Method Article

أسلوب مبسط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار

DOI:

10.3791/57784

⸱

August 25th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Oral Tissue Regeneration and Laboratory for Tissue Engineering and Regeneration, School of Stomatology, Shandong University, 2Suzhou Institute of Shandong University, 3Department of Urology, Qilu Hospital of Shandong University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا لكفاءة عزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية من أنسجة الجلد الكبار. يبسط هذا الأسلوب الإجراء التقليدي باستخدام Y-27632 مثبط لموسيقى الروك في الأجلين المتوسط والتطعيم بصورة عفوية فصل خلايا البشرة من خلايا الجلد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكيراتينيه البشرية الأولية المعزولة من أنسجة الجلد طازجة وعلى التوسع في المختبر يستخدم على نطاق واسع لمختبر البحوث والتطبيقات السريرية. طريقة العزل التقليدية الكيراتينيه البشرية ينطوي على إجراء خطوتين هضم الأنزيمي متسلسل، التي ثبت أن تكون غير فعالة في توليد الخلايا الأولية من أنسجة البالغين نظراً لمعدل استرداد الخلية منخفضة وانخفاض الخلية البقاء. نحن ذكرت مؤخرا أسلوب متقدمة لعزل الخلايا البشرية السلف البشرة الأولية من أنسجة الجلد التي تستخدم مثبطات كيناز رو Y-27632 في الأجل المتوسط. وبالمقارنة مع البروتوكول التقليدي، هذا الأسلوب الجديد هو أبسط وأسهل وأقل استهلاكاً للوقت، ويزيد الغلة طلائي الخلايا الجذعية ويعزز خصائصها الخلايا الجذعية. وعلاوة على ذلك، المنهجية الجديدة لا تتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، وذلك، وهي مناسبة لعزل الخلايا من أنواع مختلفة من الأنسجة الكبار. هذا الأسلوب الجديد في عزلة يتغلب على أوجه القصور الرئيسية في الطرق التقليدية، وهو أكثر ملاءمة لإنتاج إعداد كبيرة من خلايا البشرة بفاعلية عالية للمختبرات والتطبيقات السريرية. وهنا يصف لنا الطريقة الجديدة بالتفصيل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من ذلك وضع بروتوكول بسيط وفعال لعزل الخلايا الكيراتينيه البشرية الأولية (هككس) من أنسجة البالغين، خاصة بالنسبة للتطبيقات السريرية. خلايا جذعية البشرة الجلد، المترجمة في الطبقة القاعدية للجلد، وتمتلك إمكانات كبيرة لتتكاثر والتفريق وتوفير الكيراتينيه للحفاظ على وظائف الجلد1،2،3، 4-هككس المعزولة من الجلد أنسجة تستخدم على نطاق واسع في الأغراض الجلد الأنسجة الهندسة والتجديد، خاصة في إصلاح تلف الجلد والعلاج الجيني للتطبيقات السريرية5،6. هو القضية الرئيسية للتطبيقات المستندة إلى HKC لعزل بكفاءة وتوسيع إعداد كبيرة من هككس مع ارتفاع محتمل في المختبر7،8. على الرغم من أن مختلف مجموعات بحثية تطورت أساليب إنتاج ثقافات هككس الشبيهة الجذعية، هذه الأساليب في بعض الأحيان تستغرق وقتاً طويلاً ومعقداً لأداء والقيود الأخرى، مثل الخلية منخفضة الغلة ويجري محدودة حسب نوع العينة الجلد ويستخدم9. على سبيل المثال، الأسلوب التقليدي لعزل هككس من أنسجة الجلد ينطوي خطوتين هضم الأنزيمي مع انفصال البشرة عن الأدمة6. هذا الأسلوب عادة ما يعمل بشكل جيد الوليدي الأنسجة، ولكن يصبح من الصعب جداً عندما تستخدم لعزل خلايا من أنسجة البالغين.

Y-27632، المانع من البروتينات المرتبطة رو كيناز (روك)، أبلغ أن يعزز كفاءة الخلايا الجذعية البشرة العزلة ومستعمرة النمو10،،من1112. في دراسة سابقة، اكتشفنا أن Y-27632 يسهل نمو خلايا البشرة الاستنساخ ولكن يقلل عائد خلايا الجلد عن طريق خلطات السيطرة على التعبير عن التصاق جزيئات13. كما أنشأنا وسيلة تلقيح مكيفة جديدة، تسمى ز-المتوسطة، التي تدعم النمو والعائد من خلايا البشرة الأولية. من خلال الجمع بين ز-متوسطة مع Y-27632، يمكن فصل هذا الأسلوب رواية عفويا خلايا البشرة والجلد بعد إنزيم الهضم، وبالتالي إزالة الخطوة البشرة-الأدمة الفصل13،14. استناداً إلى التقارير السابقة، ونحن الآن أن تصف الإجراءات المفصلة لهذا الأسلوب الجديد لعزل هككس من أنسجة الجلد الكبار.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة البشرية المستخدمة في هذا البروتوكول قد تم التعامل معها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لجنة أخلاقيات البحوث البشرية للمؤسسة (NO.2015120401، التاريخ: 12 مايو 2015).

1-الأعمال التحضيرية

  1. تعديل الأنسجة جمع جلد البطن الكبار جديدة سيتم تجاهلها من الجراحة التجميلية في المستشفى في أنبوب 50 مل مع 10 مل دولبيكو المثلج النسر المتوسطة (دميم). يمكن الاحتفاظ بالعينة في 4 درجات مئوية ليصل إلى 72 ساعة دون درجة كبيرة تؤثر على بقاء الخلية.
  2. إعداد الكواشف والمتوسطة الثقافة كما هو موضح أدناه.
    1. إضافة 1 مل من البنسلين (100 U/mL) وستربتوميسين (100 مغ/لتر) إلى 50 مل من محلول التي مخزنة الفوسفات (PBS) لإعداد الحل الغسيل.
    2. إعداد مجموعتين من إنزيم الهضم الحلول: (1) إعداد 50 مل ديسباسي (2.5 ملغ/مل في دميم) و 50 مل من النوع الأول كولاجيناز (2.5 ملغ/مل في دميم) بشكل منفصل عن الطريقة التقليدية؛ و (2) إعداد 50 مل مزيج ديسباسي والنوع الأول كولاجيناز (ذوب 125 ملغ من مسحوق ديسباسي و 125 ملغ من النوع الأول من مسحوق كولاجيناز في 50 مل دميم) للأسلوب الجديد.
      ملاحظة: جميع إنزيم الحلول ينبغي تصفيتها بمصفاة 0.22 ميكرومتر وأبقى at4 درجة مئوية.
    3. إعداد الحلول الهضم لكلا الأسلوبين: التربسين 0.05% و 0.25% التربسين تم شراؤها تجارياً. إعداد 10 ملغ/مل الدناز أنا الحل بإذابة 50 مغ الدناز أنا مسحوق في 5 مل من برنامج تلفزيوني، تصفية بمصفاة 0.22 ميكرومتر، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    4. إعداد 500 مل متوسطة تحييد الهضم الأنزيمي: دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
    5. إعداد 500 مل من التطعيم المتوسطة (التي تحتوي على عامل النمو المتوسطة، دعا ز-المتوسطة): DMEM/F12 المتوسطة (3:1) الذي يحتوي على 1% البنسلين/ستربتوميسين، 40 ميكروغرام/مل فونجيزوني، 40 نانوغرام/مليلتر تنتجها الخلايا الليفية عامل النمو 2 (FGF2)، 20 عامل نمو البشرة من نانوغرام/مليلتر (لو)، و الملحق 2% B27.
    6. بريتريات خلية 100 ملم ثقافة الأطباق مع 2 مل مصفوفة الطلاء الذي يحتوي على نوع الكولاجين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

2-الأسلوب التقليدية

  1. المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
    1. تأخذ 1.5 سم2 من أنسجة الجلد وغسله x 1 مع 10 مل من برنامج تلفزيوني؛ ثم شطفة مع 10 مل إيثانول 70% ل 30 s واحتضان أنه x 2 مع 10 مل من الغسيل الحل (برنامج تلفزيوني يتضمن البنسلين 2% وستربتوميسين)، كل 5 دقائق.
      ملاحظة: يتم تنفيذ يغسل جميع في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي.
    2. تقليم النسيج مع مقص معقم إزالة طبقة الدهون تحت الجلد في صحن ثقافة خلية 100 مم، وتزن ثم أنسجة الجلد (الوزن 1 ز في هذا البروتوكول).
      ملاحظة: التشذيب كافية بالغ الأهمية لكفاءة فصل البشرة من الأدمة. ويمكن بسهولة تمييز طبقة الدهون مصفر بصريا.
    3. نقل الأنسجة إلى آخر طبق معقم 100 ملم مع الجانب باطن الجلد إلى أسفل، وثم قطع أنسجة الجلد إلى شرائح 3 إلى 4-مم-على صعيد استخدام شفرة المبضع.
      ملاحظة: الجانب الأدمة مع طبقة الدهون بسهولة التعرف بصريا.
    4. أضف 10 مل من محلول ديسباسي 2.5 ملغ/مل إلى أنسجة الجلد في صحن ثقافة 100 ملم، واحتضان ثم طبق بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (أي أكثر من 20 ح).
      ملاحظة: يمكن حساب مقدار ديسباسي الحل باستخدام 10 مل من محلول ديسباسي لهضم كل جرام من الأنسجة.
  2. انفصال البشرة عن أنسجة الجلد
    1. اليوم الثاني، تقشر البشرة من باطن الجلد باستخدام الملقط غرامة.
      ملاحظة: إذا كان من الصعب أن تقشر البشرة، الهضم ديسباسي لم تكن كافية، الذي يحدث عادة بسبب اقتطاع غير كافية للأنسجة. وفي هذه الحالة، يحتاج الأنسجة فترة حضانة أطول.
    2. فرم البشرة مقشرة مع 500 ميليلتر من مستنبت الخلية إلى ملاط أنسجة استخدام شفرات مشرط؛ ثم، ريسوسبيند أنه مع 10 مل التربسين 0.25% في أنبوب 50 مل واحتضان من 20 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية، مع الهز.
  3. جمع واستزراع الخلايا الأولية
    1. تحييد نشاط التربسين بإضافة وحدة تخزين مساوية لتحييد الحل (10 مل في هذا البروتوكول).
    2. فصل خلايا البشرة قبل بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً 20 x مع ماصة 10 مل مصلية وتمرير الحل خلية عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة أي حطام الأنسجة المتبقية.
    3. الطرد المركزي حل الخلية في 200 x ز لمدة 5 دقائق بعد الترشيح؛ ريسوسبيند بيليه الخلية في تحييد المتوسطة للغسيل، وثم الطرد المركزي أنه مرة أخرى في 200 x ز للحصول على خلية بيليه.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل متوسطة keratinocyte الكالسيوم منخفضة وخالية من المصل (SFM). تأخذ 10 ميليلتر لهذا الحل عد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 106 خلايا، ثم مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق pretreated مع مصفوفة الطلاء (التي تحتوي على النوع الأول من الكولاجين).
      ملاحظة: يتم طلاء خطوة ضرورية للطريقة التقليدية.
    5. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
      ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا تحت مجهر قبل وبعد تغيير الثقافة المتوسطة.
    6. مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
      ملاحظة: جميع أطباق الثقافة هي pretreated مع مصفوفة الطلاء.

3-أسلوب جديد

  1. المعالجة المسبقة أنسجة الجلد
    1. جمع الأنسجة كما هو موضح أعلاه (الخطوة 2، 1) للأسلوب التقليدي.
    2. أغسل أنسجة الجلد 1 x مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، وتزن ثم، في حاوية بلاستيكية معقمة بمقياس إلكترونية (الوزن حوالي 1 ز في هذا البروتوكول).
      ملاحظة: وزن الحد الأدنى من الأنسجة اللازمة لهذا البروتوكول 0.1 غ، نظراً لأنه من الصعب الحصول على عدد كاف من الخلايا إذا كانت العينة الأنسجة المستخدمة صغيرة جداً. لا يوجد أي الحد الأقصى للوزن من الأنسجة لهذا البروتوكول، الذي يعتمد في نهاية المطاف على قدرة التعامل مع المشغل.
    3. استخدام الملقط شطف أنسجة الجلد مع 10 مل إيثانول 70% لمدة 30 ثانية.
    4. احتضان الأنسجة 2 x مع 10 مل من الغسيل الحل (أعد الخطوة 2.1.1)، لمدة 5 دقائق في كل مرة.
      ملاحظة: يتم تنفيذ جميع الخطوات الغسيل المشار إليها أعلاه في الخلية 100 ملم ثقافة الأطباق داخل غطاء الاندفاق الصفحي (غطاء زراعة الأنسجة).
    5. نقل الأنسجة إلى آخر خلية 100 ملم الثقافة طبق العقيمة.
    6. باستخدام شفرات مشرط، فرم النسيج دقيق إلى ملاط أنسجة.
    7. إضافة 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل 5 دقائق للحفاظ على الأنسجة الرطبة.
      ملاحظة: يستغرق حوالي 15 دقيقة لخطوات 3.1.5-3.1.7. يتم تنفيذ كافة الخطوات المذكورة أعلاه في درجة حرارة الغرفة.
  2. هضم أنسجة الجلد
    1. نقل الحل النسيج المتجانس في أنبوب 50 مل. أضف 10 مل مخلوط الإنزيم لكل 1 غ من أنسجة الجلد. مزيج الإنزيمات تماما مع أنسجة المتجانس.
    2. احتضان المخلوط مع الهز في حمام مائي عند 37 درجة مئوية ح 1.
    3. إضافة وحدة تخزين 1/5 من 0.25% التربسين (2.5 مل في هذا البروتوكول) إلى الخليط الهضم لآخر 30 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
    4. إضافة الدناز أنا الحل إلى خليط الإنزيم بنسبة 1: 100 (v/v) (250 ميليلتر في هذا البروتوكول) وتبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. جمع واستزراع الخلايا الأولية
    1. إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 12.5 مل من تحييد المتوسطة بنسبة 1:1. "الماصة؛" الحل صعودا وهبوطاً لحوالي 20 x, استخدام ماصة 10 مل مصلية لفصل الخلايا.
    2. تصفية الخلايا معزولة عن طريق مصفاة خلية 100 ميكرون لإزالة الحطام الأنسجة. الطرد المركزي المادة طافية في 200 x ز 5 دقيقة ملاحظة بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
    3. تجاهل المادة طافية وتغسل بيليه الخلية مع 10 مل من تحييد المتوسطة، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 200 x ز لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من التطعيم المتوسطة (ز-المتوسطة من الخطوة 1.2.5) مع 10 ميكرون من Y-27632.
    5. تأخذ 10 ميليلتر من الحل لعد عدد الخلايا الإجمالية، ولوحة حوالي 2 × 106 خلايا، ثم مع 10 مل من ز-المتوسطة إلى طبق ثقافة خلية 100 ملم.
      ملاحظة: الخطوة precoating غير ضروري للأسلوب الجديد، ولا إزالة طبقة الجلد مطلوب أما.
    6. بعد 3 د، يستعاض عن المتوسطة التطعيم منخفضة الكالسيوم المتوسطة الإدارة المستدامة للغابات. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2 (د).
      ملاحظة: التحقق من التصاق الخلايا قبل وبعد تغيير المتوسطة.
    7. مرور الخلايا عندما تصل إلى حوالي 80% التقاء.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، بريتريت الخلايا مع التربسين 0.05% لمدة 2 دقيقة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني لإزالة تلوث خلايا الجلد قبل تريبسينيزينج خلايا البشرة.

4-خلية باساجينج

  1. إزالة المتوسطة وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، وثم إضافة 2 مل التربسين 0.05% (لكل طبق 100 ملم).
  2. احتضان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية، مع 5% CO2) لمدة 5 دقائق.
  3. فحص الخلايا باستخدام مجهر للتأكد من أن كافة الخلايا وقد فصل من طبق الثقافة.
  4. إضافة 8 مل دميم مع 10% FBS تحييد رد فعل الانزيمية، ومن ثم، جمع الخلايا في أنبوب 15 مل.
  5. الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 5 دقائق للحصول على خلية بيليه.
  6. إزالة المادة طافية ببطء، ثم، ريسوسبيند بيليه الخلية مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات المتوسطة وحساب عدد الخلايا.
  7. بلايت 1 × 106 خلايا مع 10 مل من الإدارة المستدامة للغابات في كل طبق خلية 100 ملم.
  8. تغيير المتوسطة كل 2 (د).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وترد في الشكل 1التخطيطية للأسلوب الجديد (الشكل 1A) والطريقة التقليدية (الشكل 1B). هو الأسلوب التقليدي خطوتين هضم، الأمر الذي يتطلب إجراء 2 يوم. على النقيض من ذلك، هو أسلوب جديد هضم خطوة واحدة، والتي تستغرق حوالي 3 ساعات لأداء. الأهم من ذلك، يمكن الحصول على الأسلوب الجديد خطوة واحدة السكان اثنين (خلايا البشرة والجلد) في نفس الوقت، الذي يعتمد على وجود Y-27632 في الأجلين المتوسط والتطعيم. وعلاوة على ذلك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هككس الابتدائي مثقف قد استخدمت على نطاق واسع لعلاج الجروح في مستوصفات لأكثر من ثلاثة عقود، ومنذ ذلك الوقت، أنها كانت دائماً أهمية كفاءة الحصول على إعداد كافية من الخلايا للتطبيقات السريرية في الوقت مناسب. ولذلك، في الممارسة العملية، طريقة العزل التقليدية، الأمر الذي يتطلب انفصال البشرة عن الأدمة، يجعل من الصعب تلبية هذه المطالب، بسبب منخفضة الغلة من الخلايا وقدرة منخفضة على مرور الخلايا الكبار. هنا، يمكننا وصف طريقة بسيطة جديدة قمنا بتطوير كفاءة الحصول على هككس من أنسجة البالغين استناداً إلى التقارير السابقة

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيده هذا العمل الوطني للبحوث الرئيسية وتطوير برنامج للصين (2017YFA0104604)، البرنامج العام "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية" (تشرف، 81772093)، العلم والتكنولوجيا تنمية البرنامج سوتشو (ZXL2015128)، مؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة جيانغسو (BK20161241)، وهي جائزة الباحث شاندونغ تايشان (tshw201502065).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
عداد الخلايا الآلي للكونتيسةInvitrogen Inc. C10227العد التلقائي للخلايا 
حاضنة CO2الحرارية العلمية51026333لاحتضان الخلايا
Sorvall ST 16R الطرد المركزيالحراري العلمي75004380خلية الطرد المركزي
شاكر درجة حرارةثابتة شاكر شنغهاي Boxun150036 لحمام مائي
مقياس إلكترونيHarbin Zhongh1171193لوزن الأنسجة
طبق ثقافة الخليةEppendorf30702115لزراعة الخلايا
50 مل أنبوب الطرد المركزيKIRGEN171003لأجهزة الطرد المركزي الخلوية
مصفاة الخليةCorning مدمجة431792ترشيح الخلية
محلول الفوسفات المخزنSolarbio Life Science   ؛P1020-500محلول الغسيل
DMEMThermo ScientificC11995500 مكون من وسط تحييد
محدد K-SFMLife Technologies10785-012وسط زراعة خلايا البشرة
البنسلين ستربتومايسينالحراري العلمي15140-122المضادات الحيوية
مصل الأبقار الجنينيالصناعات البيولوجية04-001-1AC5مكون من وسط تحييد
0.05٪ TrypsinLife Technologies25300-062لتفكك HKC
0.25٪ Trypsin & nbsp ؛بكين سولاربيو للعلوم & التكنولوجياT1350-100التفكك HKC
تقنيات الحياةR-011-Kلمصفوفة الطلاء
DispaseGibco17105-041لعزل HKC
Collagenase Type ILife Technologies17100-017لعزل HKC
Deoxyribonuclease ISigma9003-98-9لعزل HKC
F12 مزيج المغذيات ، HamsLife Technologies31765035مكون من G-medium
B27Supplement Life Technologies17504044عامل النمو في G-medium
FGF-2 MilliporeMerck Biosciences341595عامل النمو في G-medium
Y-27632Sigma-AldrichY0503ROCK
مثبط FungizoneGibco15290026التحضير
لبروتين بشري مؤتلفG-medium EGF جيبكوPHG0311عامل النمو في
مجموعة عد الخلايا G-medium -8فحوصات تكاثر الخلايا NC9864731
الفئران المضادة للسيتوكيراتين البشري 5شركة Hewlett-Packard DevelopmentCompany MA-20142لتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز في HKCs
أرنب مضاد للإنسان LoricrinCovancePRB-145pلتلوين التألق المناعي للتحقق من علامة التمايز لتقنية
خلاياVimentin المضادة للإنسانHKCs 3390لتلوين التألق المناعي للأرومات الليفية الجلدية
Integrin & alpha ؛ 6(GOH3)سانتا كروز SC-19622تحليل قياس التدفق الخلوي ل HKCs
Rat IgG2a FITCSanta Cruz & nbsp ؛SC-2831الجسم المضاد للتحكم السلبي ل & 6-integrin  في تحليل قياس التدفق الخلوي 
ui لمجموعة مصفوفة طلاء العلمي الحراري إشارات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).
  2. Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. Development and homeostasis of the skin epidermis. Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).
  3. Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin. Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).
  4. Blanpain, C., Fuchs, E. Epidermal stem cells of the skin. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).
  5. Guo, Z., et al. Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).
  6. Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
  7. Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing. Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).
  8. Hirsch, T., et al. Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells. Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).
  9. Hentzer, B., Kobayasi, T. Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture. Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).
  10. Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632. Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).
  11. Zhou, Q., et al. ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).
  12. Kurosawa, H. Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. A new method to isolate human epidermal keratinocytes. Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).
  15. Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin). Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).
  16. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).
  17. Breyer, J., et al. Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).
  18. Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. Focal adhesion regulation of cell behavior. Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Primary Human KeratinocytesSkin Tissue IsolationEnzymatic DigestionROCK Inhibitor Y 27632Epidermal Progenitor CellsCell Culture ExpansionK5 Marker AnalysisLoricrin DifferentiationVimentin Contamination CheckNeutralization Medium Wash

Related Articles