Method Article

تتبع التعبير الجيني من خلال الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة كله الماوس

DOI:

10.3791/57785

⸱

June 26th, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical and Health Sciences, Universidad Europea de Madrid, 2Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), 3School of Doctoral Studies and Research, Universidad Europea de Madrid

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يمكننا وصف بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج. هذا هو إجراء سهل وسريع لرصد الجينات أثناء التطوير التي يمكن أن تطبق أيضا على أقسام الأنسجة، الأجهزة أو الخلايا المستزرعة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستخدم الجين الإشريكيّة القولونية لاكز ، ترميز β-جالاكتوسيداسي، إلى حد كبير كمراسل للتعبير الجيني وتتبع في الخلية النسب الدراسات. رد فعل histochemical الكلاسيكي يرتكز على التحلل المائي للركيزة X-غال في تركيبة مع أيونات الحديديك والحديدية، التي تنتج ترسبات زرقاء غير قابلة للذوبان من السهل تصور. ولذلك، β-جالاكتوسيداسي النشاط بمثابة كعلامة لنمط التعبير للجينات لمصلحة التنمية العائدات. هنا يصف لنا بروتوكول قياسي للكشف عن النشاط β-جالاكتوسيداسي في الأجنة الماوس كله في وقت مبكر وأسلوب البارافين تمزيقها وكونتيرستينينج لاحقاً. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفيرها من إجراء لتوضيح الأجنة كله تصور أفضل X-غال تلطيخ في مناطق أكثر عمقاً للجنين. يتم الحصول على نتائج متسقة قبل تنفيذ هذا الإجراء، رغم الحاجة إلى تحسين ظروف رد فعل لتقليل النشاط الخلفية. ينبغي أيضا النظر قصور التحليل، لا سيما فيما يتعلق بحجم الجنين في جبل كله تلطيخ. وينص البروتوكول لدينا حساسة وطريقة موثوقة لكشف β-جالاكتوسيداسي أثناء وضع الماوس التي يمكن تطبيقها كذلك على أبواب كريوستات، فضلا عن أجهزة كاملة. وهكذا، يمكن تحليل أنماط تعبير الجينات الحيوية في جميع أنحاء التنمية بسهولة باستخدام هذا البروتوكول في الأجنة كلها، ولكن كما يمكن تقييم التعبير مفصلة على المستوى الخلوي بعد تقطيع البارافين.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل وصف أنماط التعبير الجيني محددة، تم استخدام الجينات مراسل كعلامات قصوى من المورفولوجية للثدييات. في التجارب التي تنطوي على الحيوانات المحورة وراثيا والضربة القاضية، الجين البكتيري β-جالاكتوسيداسي (لاكز) من الإشريكيّة القولونية (كولاي) واحدة من الأكثر استخداماً1،2،3، 4-β-جالاكتوسيداسي (β-غال) يحفز على أن التحلل من β-جالاكتوسيديس (مثل اللاكتوز) إلى السكريات الأحادية (الجلوكوز واللبن)5. الركيزة الأكثر استخداماً هو العاشر-غال (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)، غليكوزيد الذي هو تحلل من β-جالاكتوسيداسي نشأ عنه 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole واللبن. الأول هو تتأكسد في ديمر، عندما تستخدم جنبا إلى جنب مع البوتاسيوم فيري-وتنتج فيرو-السيانيد، مميزة غير قابلة للذوبان، ويعجل باللون الأزرق (الشكل 1)6.

بدأت الجينات لاكز لاستخدامها كأحد جينات مراسل منذ أكثر من ثلاثين عاماً7،8. عادة، يتم إدراج لاكز المتلقين للمعلومات من المروجين الذاتية مكان الإطار القراءة المفتوحة، حيث يمكن استخدامه في الثقافة البكتيريا والخلية لتصور الخلايا التي تحتوي على إدراج خاصة، وكذلك في الحيوانات المحورة وراثيا كتتبع من الذاتية أنماط التعبير الجيني أثناء التنمية9. وفي هذا الصدد، التصور من β-جالاكتوسيداسي النشاط على نطاق واسع استخدمت في المورفولوجية لفهم العمليات الإنمائية والخلوية من خلايا مفردة لكل الأنسجة. الوراثة المورفولوجية لصالح توليد خطوط مستقرة فيه بناء عنصر ف معدلة تحتوي على الجينات مراسل لاكز إدراج المواقع في الجينوم عشوائياً. وهكذا، عندما وضعت تحت تأثير عناصر محسن قد محرك التعبير عن بطريقة محددة أنسجة، مما سمح إجراء تحليل منهجي لأنماط التعبير العديد من الجينات خلال العقدين الماضيين الماضية10. وبالإضافة إلى ذلك، يتيح استخدام الفئران المعدلة وراثيا لرصد التعبير الجيني لاكز أيضا الكشف عن المورثات جزئ الأحداث حسب لوكسب لجنة المساواة العرقية بوساطة جزئ، والترجمة من المشتقات متحولة الخلايا الجذعية الجنينية في تحليلات تشيميريك 11، مما يسهل التحكم في التعبير لاكز في أنسجة محددة، وكذلك وقتيا. أيضا، في الأجنة كله، الكشف عن نشاط β-جالاكتوسيداسي قد تنتج أنماط المصبوغة التفاضلية في كثافات مختلفة التي يمكن ملاحظتها مريح عبر مراحل تنموية مختلفة لتحليل التغيرات الزمنية في التعبير الجيني 8،12.

في هذه المقالة، نقدم بروتوكولا لتصور التعبير الجيني عن طريق X-غال تلطيخ في الأنسجة جبل كله في مراحل النمو المبكر للأجنة الماوس. أننا نقدم هذا الأسلوب histochemical كتقنية حساسة للغاية وغير مكلفة التي تفضل كشف دقيق للخلايا المسماة في العينات جبل كله أو على المستوى الخلوي بعد البارافين مضمن الأنسجة أو الأجنة. الأسلوب يسمح للتصور مباشرة من تلطيخ في الأنسجة الماوس مع خلفية الحد الأدنى عند مقارنتها مع أساليب أخرى13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق جميع الإجراءات التجريبية اللجنة المعنية "أخلاقيات التجارب الحيوانية" المحوسبة بطاقة الهوية الوطني (المركز الوطني للبحوث كارديوفاسكولاريس) وفي مدريد الدولية المستقلة لضمان الحد الأدنى الحيوان المعاناة.

1-جمع الأجنة من الفئران الحوامل (من E8.5 إلى E12.5)

  1. التضحية الفئران الحوامل بخلع عنق الرحم أو استنشاق أول أكسيد الكربون2 . الاحتفال باليوم الأول التوصيل المهبلية اعتبرت الجنينية يوم 0.5 (E0.5).
  2. وضع الحيوان في موقف ضعيف على لوحة ماصة وتنظيف البشرة البطن للماوس مع الإيثانول 70%.
    ملاحظة: ليس مطلوب من العقم في الخطوات التالية.
  3. قرصه ورفع الجلد البطن باستخدام الملقط الماوس-الأسنان.
  4. جعل شق من خلال الجلد وجدار البطن، 2 إلى 4 سم عمودياً عبر خط الوسط للبطن باستخدام مقص جراحي.
  5. كشف البطن وإزالة قرون الرحم من الأم مع ملقط قطع الأوعية الدموية على طول انحناء الرحم الداخلي مع المقص الجراحي.
  6. إزالة سلسلة الأجنة ونقلها إلى طبق بتري على الجليد التي تحتوي على 10 مل المثلج 0.01 متر الفوسفات المخزن المؤقت المالحة درجة الحموضة 7.4 (PBS).
  7. تشريح الأجنة خارجاً من الرحم تحت ستيريوميكروسكوبي في طبق بتري مع 10 مل برنامج تلفزيوني المثلج الطازجة بعناية. فهم الجدار العضلات بالملقط الساعات لفضح الكيس الذي يحيط بالجنين، وثم تمزق الغشاء السلوى لإزالة الجنين المغلقة وكيس ألمح باستخدام النصائح من الملقط.
  8. جمع الأجنة ليتيرماتي من الفئران الحوامل في مراحل مبكرة (من E8.5 إلى E12.5) (الشكل 2).
  9. نقل الأجنة إلى طبق جديد مع برنامج تلفزيوني الباردة 1 x 10 مل باستخدام الملقط منحنى، أو لاجنة صغيرة جداً (E8.5-E9.5)، استخدام الماصات البلاستيكية نقل لجمع العينات دون ضرر الجنين.
  10. قبل البدء في التثبيت، أن نموذج جنينية في أنبوب ميكروسينتريفوجي للتنميط بقطع قطعة صغيرة من الجنين أو أخذ الغشاء السلوى في الأجنة أصغر (من E8.5 إلى E9.5) مع الملقط الساعات.
    ملاحظة: التنميط لاكز يتحدد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) كبسولة تفجير: إلى الأمام، 5´-أتكجتجكجتجتجاكتج-3´؛ عكس، 5´-كجاجكجتاككجتكاجكا-3´.

2. تثبيت الأجنة الماوس

  1. نقل كل الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع قاعدة مدورة تحتوي على برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل.
    ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات في البروتوكول في هذه الأنابيب مع الانفعالات استخدام شاكر متداول.
  2. تغسل الأجنة في 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة الدم المتبقي. استخدام الماصات البلاستيكية نقل لتغيير السوائل في الأنابيب.
  3. إصلاح الجنين في 1 مل من 0.125 ٪ glutaraldehyde على الجليد.
    ملاحظة: وقت التثبيت يعتمد على حجم الجنين: 20 دقيقة للأجنة E8.5-E9.5، 30 دقيقة للأجنة E10.5 وح 1 للأجنة E12.5.
  4. إزالة مثبت وتغسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1 x مرتين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تجهيز العينة لتلطيخ غال X.

3-كله جبل β-جالاكتوسيداسي هيستوتشيميستري الأجنة الماوس

  1. العاشر-غال "تلطيخ حل" قبل البدء في هذا الإجراء و "شطف" غال X إعداد المخزن المؤقت (انظر الجدول 1 و الجدول للمواد). استخدام أجنة ليتيرماتي (WT) البرية من نوع كعناصر سلبية لرد الفعل الأنزيمي.
  2. تبني الأجنة في شطف X-غال المخزن المؤقت لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
  3. تبني الأجنة في "حل تلطيخ" غال س من ح 2 المبيت في 37 درجة مئوية محمية من الضوء. مراقبة رد فعل اللون بشكل دوري عبر مجهر تشريح حتى لوحظ كثافة كافية لتلطيخ الأزرق دون الخلفية في الجنين. الحفاظ على درجة الحموضة للحل بين 8 و 9 لتقليل الخلفية أثناء المصبوغة كلياً. إذا كان الحل المصبوغة يبدأ تشغيل الضوء، استبدلها بحل الركازة جديدة لتوسيع التفاعل الأنزيمي.
  4. وقف رد الفعل عندما يتم الحصول على إشارة المطلوب قبل الغسيل الأجنة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مع برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل مرتين عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل الأجنة الملون إلى 1 مل 4% بارافورمالدهيد (PFA) لإعادة إصلاحها، ح 1 المبيت في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في 4% PFA/برنامج تلفزيوني لأوقات أطول في 4 درجات مئوية أو يمكن معالجته فورا لتمزيقها. تعد هذه الخطوة التثبيت النهائي الحاسم للحفظ الطويل الأجل لنمط المصبوغة.
  6. تغسل الأجنة في برنامج تلفزيوني 1 x 1 مل مرتين لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. الخيار 1: مسح الأجنة قبل الانغماس في مجموعة من الحلول مع التركيزات المتزايدة الجلسرين (والغليسيرول 20%، 40%، 60% و 80% في برنامج تلفزيوني 1 x) عن ح 1 في درجة حرارة الغرفة في كل حل.
    ملاحظة: تغسل الأجنة في والغليسيرول 80% لأوقات أطول، وحتى أيام، حتى أنها يتم مسح ومن ثم تخزينها في والغليسيرول 80% في 4 درجات مئوية في هذه الخطوة (الشكل 2). إضافة كمية صغيرة جداً من الصوديوم كريستال أورا أزيد من ثيمول إلى الأجنة المخزنة في 4 درجات مئوية أما في الجلسرين أو 1 x يوصي ببرنامج تلفزيوني لمنع نمو العفن. بعد تطهير، يمكن استخدام الأجنة جبل كله لتصوير (الخطوة 4).
  8. الخيار 2: عملية الأجنة البارافين التضمين وتمزيقها باستخدام مبضع (الشكل 2). الوثيقة نمط التعبير في أجنة ملطخة كلياً قبل تمزيقها (الخطوات 4 و 5).

4-التصوير كله جبل الأجنة

  1. تصوير جبل كله الملون الأجنة قبل تمزيقها، ونقلها إلى طبق بتري أعد مع قاعدة من وطدت [اغروس] 1-2% في برنامج تلفزيوني 1 x.
  2. تغطية الجنين تماما مع PBS 1 x 10 مل في الأطباق [اغروس] المغلفة لمنع التجفاف والتأمل حين تصوير عن طريق السائل.
  3. توجيه الجنين منغمسين في 1 x PBS باستخدام الملقط. لكبار السن من الأجنة (E10.5-E12.5)، جعل ثقب صغير في [اغروس] مع الملقط للمكان ووضع العينة داخله في زوايا مختلفة وتجنب التعويم الحر أثناء التصوير.
  4. ضع الطبق على المسرح ستيريوميكروسكوبي، واستخدام الضوء المنقولة (وكيل المرحلة). تغيير بين 'الظلام-الحقل' والتسويات 'مشرق الحقل' لتعيين الإضاءة المطلوبة أثناء التصوير الفوتوغرافي وتحسين الشفافية العينة.
    ملاحظة: استخدام الإضاءة الألياف البصرية للأجنة لاحقاً لتجنب التفكير في السطح للجنين. عند تصوير الأجنة المطهرة، اتبع نفس الإجراء ولكن نقلها إلى طبق بتري يحتوي على الجلسرين 100% وتزج الكامل لهم.

5-البارافين التضمين وتمزيقها من X-غال الملون الأجنة

  1. شمع البارافين التضمين
    1. إزالة X-غال الملون الأجنة من 4 درجة مئوية (الخطوة 3، 5) وغسلها ببرنامج تلفزيوني 1 x 1 مل ثلاث مرات للقضاء على الفائض في مثبت.
    2. نقل كل الأجنة إلى كاسيت الأنسجة باستخدام الملقط.
    3. وضع أشرطة الكاسيت التي تحتوي على الأجنة في كوب ويذوي ثم بتمريرها من خلال سلسلة متدرجة من إيثانول في درجة حرارة الغرفة: 70% إيثانول، مرة واحدة لمدة 30 دقيقة؛ إيثانول 96%، مرتين لمدة 30 دقيقة في كل؛ 100 ٪ الإيثانول، مرتين لكل 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأجنة في الإيثانول 70% بالنسبة لوقت غير محدد عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ عملية الجفاف.
    4. احتضان كاسيت كله في الكحول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. باستخدام الملقط، نقل الأشرطة لزجاج تلطيخ الحوض يحتوي على الايزوبروبانول المعالجون مسبقاً وتترك في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. ضع أشرطة الكاسيت في زجاج جديد تلطيخ الحوض الصغير الذي يحتوي على خليط الكحول 50%/50% ذاب شمع البارافين وإجازة ح 4 في فرن 60 درجة مئوية.
    7. احتضان الأشرطة مع الأجنة مع اثنين من التغييرات من شمع البارافين المنصهر، 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية كل.
    8. في نهاية الغسيل البارافين النهائي، فتح الكاسيت ونقل كل الأجنة إلى أنسجة منفصلة تضمين القالب لعرض العينة تحت ستيريوميكروسكوبي.
    9. سد البئر شمع البارافين المنصهر في 60 درجة مئوية. استخدام الملقط ساخنة للاحتفاظ الشمع المنصهر وتوجيه عناية الجنين في القالب.
      ملاحظة: التوجه السليم للعينة خطوة حاسمة لتقطيع الجنين في الطائرة المطلوب.
    10. قبل أن يتصلب البرافين في القالب، ضع كاسيت دون غطاء على رأس الكتلة وملئه شمع البارافين المنصهر. السماح لتبرد الشمع المتبقي حتى توطد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    11. بمجرد البارافين هو توطد تماما، إزالة كتلة صلبة من العفن وتخزين كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة أو في 4 درجات مئوية حتى تمزيقها14.
  2. البارافين تمزيقها
    1. توجيه النصل على مبضع وإعداد 5-7 ميكرون سمك. 5.2.2-كول في كتلة البارافين على الجليد وتقليم لإنتاج مكعب أو هرم.
    2. إرفاق الكتلة حامل مبضع باستخدام كمية صغيرة من الشمع المصهور.
    3. توجيه كتلة قطع الأمثل. قسم كتل البارافين إلى 5-7 ميكرون شرائح سميكة في درجة حرارة الغرفة باستخدام مبضع القياسية.
    4. استخدام الرسام ما يرام، وضع المقاطع في حمام مائي في درجة حرارة الغرفة للتلاعب وتحديد الشرائح.
    5. التقاط أجزاء من حمام الماء مع شريحة مجهر وتحويلها إلى حمام مائي في 42 درجة مئوية للتمدد.
    6. إزالة أقسام من حمام المياه ووضعها بلطف على شرائح المجهر الالتصاق.
    7. الجاف للشرائح جيدا في فرن عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للسماح للفروع التقيد تماما، وإلا فإنها قد تضيع خلال تلطيخ.
      ملاحظة: تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية حتى تبدأ تلطيخ الإجراءات.
  3. ديبارافينيزيشن وكونتيرستاينينج من مقاطع البارافين غال الملطخة X
    1. وضع الشرائح على شريحة مجهر صينية في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على الأقل جعل شمع البارافين أكثر مرونة.
    2. نقل الشرائح إلى رف واستخدام الزجاج تلطيخ الأطباق إلى الخطوات التالية: تغرق الحامل في الجرار المصبوغة التي تحتوي على الكحول لتقليل تركيزات لإزالة كاملة من البارافين وترطيب الأنسجة: الايزوبروبانول لمدة 5 دقائق في 60 درجة مئوية؛ الايزوبروبانول لمدة 3 دقائق؛ الإيثانول 100% لمدة 2 دقيقة؛ إيثانول 96% لمدة 1 دقيقة؛ إيثانول 70% لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    3. شطف المقاطع في الماء المقطر مرتين للتأكد من أن هناك لا بقايا الكحول.
    4. كونتيرستين الأقسام مع وصمة عار (مثلاً حل "الأحمر" النووي-سريع) لمدة 5 دقائق (عادة ما بين 3-8 دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (الشكل 2).
      ملاحظة: تلطيخ هذا يساعد على الكشف عن هيكل الأنسجة عموما في الفروع.
    5. بعد تلطيخ، يغسل الشرائح في الماء المقطر لمدة 1 دقيقة ومراجعة قسم تلطيخ في المجهر.
      ملاحظة: إذا كان المطلوب تلطيخ ضعيفة جداً، كونتيرستين الأبواب مرة أخرى لفترة أطول.
    6. يذوي المقاطع في السلسلة التالية مع زيادة تركيزات إيثانول: يغسل اثنين في الإيثانول 95% لمدة 2 دقيقة، يغسل اثنين في الإيثانول 100% لكل 2 دقيقة، وتفادي تذويب الزرقاء اللون رواسب، الغسيل السريع واحد فقط في زيلين نفط.
    7. إزالة الشرائح من الرف واحداً تلو الآخر، ووضعها على قطعة من الورق. ثم جبل وساترة كل شريحة باستخدام وسيلة تصاعد الاصطناعية، الدائمة.
      ملاحظة: زيلين نفط هو منتج قابل للاشتعال الأبخرة التي مزعجة وضارة بصحة الإنسان والكائنات الحية المائية. أنه يحتاج إلى معالجته داخل غطاء محرك السيارة، ويتطلب استخدام المعدات الواقية المناسبة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نعرض النتائج من تطبيق البروتوكول القياسي لرد فعل histochemical β-جالاكتوسيداسي باستخدام X-غال كالركيزة في الأجنة كله الماوس (الشكل 1 و الشكل 2). باستخدام هذا البروتوكول، علينا أن ندرس نوع الغشاء أية 4-مصفوفة (Mt4-mmp) التعبير في مختلف مراحل النمو الجنيني (E9.5 و E11.5 و E12.5) استخدام Mt4-mmp متحولة الفئران التي تعبر عن مراسل لاكز الخاضعة لسيطرة الذاتية Mt4-mmp المروج (الشكل 3،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجين لاكز كولاي قد استخدمت على نطاق واسع من كمراسل في الدراسات المتعلقة بأنماط التعبير الجيني بسبب حساسية عالية وسهولة الاكتشاف. هذا البروتوكول وصف أسلوب كلاسيكي للكشف عن التعبير β-غال استناداً إلى فعل الانزيمية التي من السهل والسريع لأداء وغير مكلفة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب أيضا دون تعديلات رئيسية في الأجنة جبل كله أو أجهزة سليمة، كريوستات أقسام الأنسجة أو الخلايا المستزرعة.

التطبيق الدقيق لهذا الأسلوب يؤدي تلطيخ قوية والتفسير. ومع ذلك، عناصر التحكم المتزامن والخطوات اللاحقة توكيدي ي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم أي مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر "خدمة نسيجية" لمساعدتها التقنية في كارديوفاسكولاريس المركز الوطني للبحوث (المحوسبة بطاقة الهوية الوطني). كما نشكر الدكتور Motoharu سيكي للفئران Mt4-mmpلاكز توفير يرجى، والدكتورة أليسيا زاي أرويو لدعم مشروعنا ولها قراءة نقدية من المخطوطة. ونود أن نشكر بيتر بوني لتصحيح هذه المقالة. وأيده هذا العمل الأوروبي جامعة مدريد عن طريق منحة (# 2017UEM01) منحت إلى C.S.C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > كواشف < / قوي >
2-بروبانولSIGMA-ALDRICH24137-1L-R
AgaroseSCHARLAU50004 / LE3Q2014
تركيب مائيVECTOR LABSH-5501
تركيب اصطناعيةMERCK100579
96٪ إيثانولPROLABO20824365
99.9٪ إيثانول مطلقSCHARLAUET00021000
50٪ محلول جلوتارالديهايدSIGMA-ALDRICHG6403-100ml
85٪ جلسرينMERCK104094
99.9٪ جلسرينSIGMA-ALDRICHG5516
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSIGMA-ALDRICH63064
خافض للتوتر السطحي غير أيوني (Nonidet P-40)SIGMA-ALDRICH542334
نووي سريع أحمر COUNTERSTAINSIGMA-ALDRICHN3020
باستيل البارافينMERCK111609
بارافورمالدهيدSIGMA-ALDRICH158127-500 جم
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (أقراص)SIGMA-ALDRICHP4417-50TAB
فيروسيانات البوتاسيومMERCK1049840500
فيروسيانيد البوتاسيومMERCK1049731000
أزيد الصوديومSIGMA-ALDRICHS8032
ديوكسي كولات الصوديومSIGMA-ALDRICH30970
فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم أحادي الهيدراتSIGMA-ALDRICH106346
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة ثنائي الهيدراتSIGMA-ALDRICH71638
ThymolSIGMA-ALDRICHT0501
تريس هيدروكلوريد (تريس هيدروكلوريد)سيجما ألدريتش10812846001 (روش) X-GAL
VENN NOVAR-0004-1000
كيماوياتالزيلينVWRC28973.363
<قوية > المعدات < / قوية>
التبريد البلاستيكية التي يمكن التخلص منها 15x15x5 ممSAKURA4566
Rotating MicrotomeLeicaRM2235
كاسيتأكسفورد تريدOT-10-9046
نظارات غطاء المجهر 24x60 ممVWRECN631-1575
مجهرThermo Scientific ، MENZEL-GL & Auml ؛ SERAGAA000001 # 12E
مجهر التصاقThermo Scientific ، MENZEL-GL & Auml ؛ SERJ1820AMNZ
التعويم حمام مائيLeicaHI1210
شفرات ميكروتوم منخفضة التكلفة يمكن التخلصمنها ريشةUDM-R35
فرن البارافينJR SELECTA
البارافين الشمعي2000205 JR SELECTA
المجهر المجسمLeicaDM500
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبلين 2.0 ملSIGMA-ALDRICHT2795
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبلين 1.5 ملSIGMA-ALDRICHT9661
شاكر مداريIKA LabortechnikHS250 BASIC
تحريك لوحة ساخنةBibbyHB502
دوامة شاكرIKA LabortechnikMS1
مقياس مختبرGRAMFH-2000
مقياس الدقةSartoriusISO9001
مقياس الهيدرومترCrisonBasic 20
الألياف البصريةOptechPL2000
متوسط وسائط VWR قوالب شرائح شرائح موزع 4000490

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
  2. Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182(1994).
  3. Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
  4. Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
  5. Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
  6. Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
  7. Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
  8. Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
  9. Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767(2017).
  10. Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux's Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
  11. Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
  12. Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
  13. Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
  14. Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797(2011).
  15. Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
  16. Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
  17. Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
  18. Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
  19. Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
  20. Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
  21. Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
  22. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
  23. Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
  24. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  25. Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
  26. Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
  27. Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
  28. Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937(2013).
  29. Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
  30. Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
  31. Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
  32. Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
  33. Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
  34. Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
  35. Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
  36. Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
  37. Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
  38. Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
  39. Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
  40. Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
  41. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  42. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  43. Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
  44. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Beta galactosidase DetectionX gal StainingMouse Embryo AnalysisParaffin SectioningHistochemical AssayGene Expression TracingWhole Mount StainingCell Lineage StudiesEmbryo ClarificationDevelopmental Biology

Related Articles