يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست

7.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57790

⸱

أغسطس 16, 2018

 ,  , 
1Department of Basic Sciences and Aquatic Medicine, Faculty of Veterinary Medicine, Norwegian University of Life Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

توضح هذه المقالة بروتوكولا أمثل لصنع شرائح أنسجة المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق، استخدام الأسماك تيليوست الميداكا (Oryzias latipes)، تليها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية باستخدام تقنية المشبك التصحيح مع تكوين تصحيح مثقب.

الملخص

وقد أجريت تحقيقات الكهربية خلايا الغدة النخامية في العديد من الأنواع الفقارية، ولكن عدد قليل جداً في الأسماك تيليوست. ومن بين هذه، تم إجراء غالبية واضحة على ينتابها الابتدائية الخلايا. لتحسين فهمنا لكيفية تيليوست خلايا الغدة النخامية، وتتصرف في بيئة ذات صلة أكثر بيولوجيا، هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد شرائح المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق استخدام الميداكا الصغيرة من أسماك المياه العذبة (Oryzias latipes). جعل شرائح المخ--الغدة النخامية، درجة الحموضة وأوسمولاليتي لجميع الحلول عدلت إلى القيم الموجودة في سوائل الجسم من أسماك المياه العذبة التي تعيش في 25 إلى 28 درجة مئوية. وبعد إعداد شريحة، البروتوكول يوضح كيفية إجراء التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية ثقب كامل الخلية التصحيح-المشبك. تقنية التصحيح-المشبك أداة قوية مع الأزمنة لم يسبق لها مثيل وحساسية، السماح بالتحقيق في خصائص الكهربائية من الخلايا كلها سليمة وصولاً إلى قنوات أيون واحد. مثقب التصحيح فريدة من نوعها في ذلك فإنه يحتفظ بالبيئة داخل الخلايا سليمة منع العناصر التنظيمية في سيتوسول من يجري تمييع الحل الكهربائي ماصة التصحيح. وفي المقابل، عند إجراء تسجيلات كامل الخلية التقليدية، فقد لوحظ أن خلايا الغدة النخامية الميداكا تفقد بسرعة قدرتها على إطلاق إمكانات العمل. بين انثقاب مختلف التقنيات المتاحة، هذا البروتوكول يوضح كيفية تحقيق انثقاب الغشاء مصححة باستخدام مبيد الامفوتريسين باء

المقدمة

الغدة النخامية جهاز الغدد الصماء رئيسية في الفقاريات الموجودة أدناه تحت المهاد والخلفية إلى chiasm البصرية. وتنتج وتفرز الهرمونات ستة إلى ثمانية من أنواع الخلايا المحددة. هرمونات الغدة النخامية تشكل وسيط بين الدماغ والأجهزة الطرفية ومحرك مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية الأساسية بما في ذلك النمو والتكاثر، وتنظيم التوازن. مشابهة للخلايا العصبية، خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية منفعل كهربائياً مع القدرة على إطلاق إمكانات العمل تلقائياً 1. ودور هذه إمكانات العمل هو الخلية التابعة. في العديد من أنواع الخلايا في الغدة النخامية الثدييات، إمكانات العمل يمكن أن ترفع داخل الخلية Ca2 + بما فيه الكفاية لإطلاق سراح المطرد لهرمون 2. وبالإضافة إلى ذلك، يتلقى الغدة النخامية معلومات محفزة والمثبطة على حد سواء من الدماغ الذي يؤثر على إمكانات غشاء الخلايا 3،4،،من56. عادة، مدخلات تنشيطية يزيد استثارة وغالباً ما ينطوي على إطلاق سراح Ca2 + من مخازن داخل الخلايا، فضلا عن زيادة إطلاق تردد 7. فهم كيف يستخدم تكوين قناة أيون الخلية وتتكيف مع هذه الإشارات الإدخال من الدماغ مفتاح لفهم هرمون التجميعي والإفراج.

تقنية التصحيح-المشبك وضعته زاكمان ونيهر9،،من 810 في أواخر السبعينات وزيادة تحسين طريق هاميل 11، ويسمح بتحقيقات مفصلة للخصائص الكهربية للخلايا وصولاً إلى قنوات أيون واحد. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة كل من التيار والجهد. واليوم، لقط التصحيح هو المعيار الذهبي لقياس الخصائص الكهربية للخلية. وكانت أربعة تكوينات رئيسية تقنية التصحيح-المشبك ختم ضيق 11من البلدان المتقدمة النمو؛ الخلية-المرفقة والداخل إلى الخارج، الخارج، وتصحيح كامل الخلية. ثلاثة تكوينات الأولى تستخدم عادة للتحقيقات قناة أيون واحد. للدورة الرابعة، بعد تكوين خلية يولي، ثقب في غشاء الخلية باستخدام ضغط الغلاف الجوي الفرعية. يسمح هذا التكوين أيضا التحقيقات المتعلقة بتكوين خلية كله 12قناة أيون. بيد أن القيد واحد من هذا الأسلوب أن جزيئات هيولى مخففة بالتصحيح ماصة حل 13 (الشكل 1أ)، مما يؤثر على الاستجابات الكهربائية والفسيولوجية للخلايا المدروسة. وفي الواقع، بعض من تلك الجزيئات قد تؤدي أدواراً هامة في توصيل الإشارات أو في تنظيم قنوات أيون مختلفة. لتجنب هذا، وضعت لينداو وفرنانديز 14 طريقة حيث يتم إضافة مركب تشكيل المسام إلى ماصة التصحيح. بعد تكوين خلية يولي، سوف تدرج في غشاء البلازما تحت التصحيح المجمع والتسلخات ببطء الغشاء إنشاء الاتصال الكهربائية مع سيتوسول (الشكل 1ب). ويمكن استخدام العديد من الأنواع مختلفة مثل النيستاتين 15 والامفوتريسين ب 16، أو التوتر السطحي مثل ال 17،صابونين بيتا-إيسين18 . إنشاء هذه المركبات المسام كبيرة بما يكفي للسماح بالأيونات الموجبة الفموي الأحادي التكافؤ ونشرها بين في سيتوسول وماصة التصحيح مع الحفاظ على مستويات الجزيئات والايونات أكبر مثل Ca2 + 15، سيتوسوليك من Cl– 16.

ويتمثل التحدي في استخدام التصحيح مثقبة المقاومة سلسلة يحتمل أن تكون عالية. سلسلة المقاومة (Rs) أو الوصول إلى المقاومة هي المقاومة مجتمعة على ماصة التصحيح بالنسبة للأرض. خلال تسجيلات المشبك التصحيح، سيكون Rs بالتوازي مع مقاومة الغشاء (Rم). Rm و Rs في العمل بالتوازي مقسم الجهد. مع ارتفاع Rs، ستسقط الجهد عبر Rs يعطي أخطاء في التسجيلات. الخطأ سوف تصبح أكبر مع التيارات الكبيرة المسجلة. وباﻹضافة إلى ذلك، مقسم الجهد هو أيضا التردد يعتمد إنشاء مرشح تمرير منخفض، مما يؤثر في الأزمنة. في الواقع، التصحيح مثقب قد لا تسمح دائماً تسجيلات تيارات الكبيرة والسريعة مثل الجهد عن طريق بوابة التيارات نا+ (لقراءات مفصلة، انظر المرجع 19). أيضا، قد تختلف Rs أثناء تسجيلات المشبك التصحيح، مرة أخرى مما يؤدي إلى تغييرات في الحالي مسجل. وهكذا، قد تحدث إيجابيات كاذبة في حالات حيث يتغير Rs أثناء تطبيق المخدرات.

الكهربية في الأنسجة شرائح قدم لأول مرة بالمعمل أندرسن لدراسة الخصائص الكهربية للخلايا العصبية في الدماغ 20. الأسلوب الذي مهد الطريق لتحقيقات مفصلة للخلايا المفردة، فضلا عن دوائر الاتصالات وخلية خلية خلية في بيئة سليمة أكثر. تقنية مماثلة لصنع شرائح الغدة النخامية قدم في عام 1998 Guérineau et al. 21-ومع ذلك، فإنه لم يكن قبل عام 2005، استخدمت ذلك إعداد شريحة الدماغ-الغدة النخامية بنجاح للدراسات التصحيح-المشبك في تيليوست 22. في هذه الدراسة، ذكر الكتاب أيضا استخدام تسجيلات المشبك التصحيح مثقب. ومع ذلك، حتى الآن، معظم التحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية قد أجريت في الثدييات، وحفنة فقط من الفقاريات الأخرى، بما في ذلك الأسماك تيليوست 1،2،22،23 . في اريوكروماس، وتقريبا جميع دراسات أجريت على خلايا معزولة الابتدائي 24،25،26،27،،من2829،30 .

في هذه الورقة، فإننا مخطط بروتوكولا أمثل لإعداد شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة من الميداكا الأسماك النموذجية. النهج الذي يمثل العديد من المزايا المقارنة للثقافات الخلية ينتابها الأولية. أولاً، يتم تسجيل الخلايا في بيئة المحافظة نسبيا مقارنة بفصل شروط ثقافة الخلية. ثانيا، الأعمال التحضيرية شريحة تسمح لنا بدراسة مسارات غير مباشرة توسط خلية خلية الاتصالات 22، التي ليس من الممكن في ظروف الثقافة خلية معزولة. وعلاوة على ذلك، نحن لشرح كيفية إجراء التسجيلات الكهربية على شرائح الأنسجة التي تم الحصول عليها استخدام تقنية ثقب كامل الخلية التصحيح-المشبك مع الامفوتريسين B كعامل تشكيل المسام.

الميداكا أسماك المياه العذبة صغيرة أصلي إلى آسيا، وجدت في المقام الأول في اليابان. علم وظائف الأعضاء، وعلم الأجنة، وعلم الوراثة من الميداكا قد درست على نطاق واسع لما يزيد على 100 سنة 31، ونموذج بحث شائعة استخدام في العديد من المختبرات. أهمية خاصة لهذه الورقة هو المنظمة المورفولوجية متميزة للمجمع تحت المهاد-النخامية في الأسماك تيليوست: بينما في الثدييات والطيور الخلايا العصبية طائي الإفراج عن الهرمونات العصبية تنظيم خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية نظام المدخل لنيافة الوسيط، هناك إسقاطات عصبية مباشرة لطائي من الخلايا العصبية إلى خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية في الأسماك تيليوست 32. وهكذا، تجري بعناية تشريح الدماغ-الغدة النخامية له أهمية خاصة في الأسماك، مما يسمح لنا بالتحقيق في الخصائص الكهربية لخلايا الغدة النخامية في شبكة الدماغ-الغدة النخامية الحفاظ عليها جيدا، ولا سيما كيف الغدة النخامية خلايا التحكم استثارة وبالتالي Ca2 + التوازن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجرى جميع الحيوانات معالجة وفقا لتوصيات للعناية والرعاية للحيوانات البحوث في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة، وتحت إشراف المحققين المأذون بها.

1-إعداد الأدوات والحلول

ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول العقيمة. ينبغي إيلاء الاهتمام إلى درجة الحموضة وأوسمولاليتي (أوسمول/كغ ماء) لجميع الحلول، التي ينبغي أن تتكيف البيئة خارج الخلية للأنواع المدروسة بعناية دقيقة. ينبغي أن تعدل الحموضة و osmolality مع المعدات الإلكترونية الدقيقة مثل مقياس الأس الهيدروجيني ودرجة التجمد أوسموميتير على التوالي.

  1. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية دون Ca2 + (Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، 186.37 مغ بوكل، مغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من عالي النقاوة (0.055 الولايات المتحدة/سم عند 25 درجة مئوية، والمقاومة موهم 18.2) ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  2. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية (الجماعة الأوروبية): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل2، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، ملغ 186.37 من بوكل، ملغ 147.01 كاكل2، ملغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  3. جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية مع ألبومين المصل البقري 0.1% (المفوضية الأوروبية مع جيش صرب البوسنة): 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملم بوكل، 2 مم كاكل2، 1.3 مم مجكل2، الجلوكوز 4 مم، 10 مم حبيس.
    1. حل ز 4.38 من كلوريد الصوديوم، ملغ 186.37 من بوكل، ملغ 147.01 كاكل2، ملغ 61.89 مجكل2، مغ 360.32 الجلوكوز وز 1.19 حبيس في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.75 مع هيدروكسيد الصوديوم.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 290 – 300 مع المانيتول. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر. إضافة 50 ملغ جيش صرب البوسنة.
  4. جعل 250 مل من محلول داخل الخلايا (IC): 110 مم كوه، 20 مم بوكل، 10 مم حبيس، السكروز 20 مم.
    1. حل ز 1.54 كوه وملغ 595.75 من حبيس وملغ 327.75 من بوكل ز 1.712 السكروز في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
    2. قم بضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع الإيثان (N-morpholino) سولفونيك (MES) حمض.
    3. نقل الحل إلى دورق حجمي 250 مل. شغل دورق حجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 250 مل.
    4. مزيج الحل جيدا قبل قياس أوسمولاليتي. ضبط لموسم 280-290 (10 موسم أقل من الجماعة الأوروبية) مع السكروز. فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام فراغ الماء و 0.2 ميكرون فلتر.
  5. جعل 100 مل محلول [اغروس] ذوبان منخفضة 2% في Ca2 + والمفوضية الأوروبية الحرة جيش صرب البوسنة (ز 2 من [اغروس] انصهار منخفضة في 100 مل من Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية). حل استخدام ميكروويف ووضع [اغروس] المذابة في حمام مائي عند 40 درجة مئوية. ندعه يبرد حتى تصل إلى 40 درجة مئوية قبل استخدامها في الأنسجة.
    ملاحظة: الجماعة الأوروبية، Ca2 + المفوضية الأوروبية الحرة قد تكون مخزنة في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع في حالة معقمة وحلول IC في-20 درجة مئوية، لعدة أشهر. [اغروس] يمكن تخزينها لمدة أسبوع في 4 درجات مئوية، ويمكن استخدامها من 3 – 5 مرات قبل فترة وجيزة مايكرويف. إعادة الاستخدام المفرط يؤدي إلى التبخر وتحوير [اغروس] وتركيز الملح والجودة.
  6. جعل الجسر أجار:
    1. حرارة الشعيرات طويلة البورسليكات الزجاج 7.5 ملم مع خارج القطر (نقلت) 2 مم وداخل القطر (معرف) 1.16 مم باستخدام موقد بنسن في تنسيق نقطة حوالي 1/3 من طرف واحد حتى يبدأ الزجاج لثني. إزالة الزجاج من اللهب والسماح بالزجاج لينحني بزاوية مقدارها حوالي 120 درجة (الشكل 2أ).
    2. تذوب أجار 2% في المفوضية الأوروبية العادية دون الجلوكوز باستخدام ميكروويف، وفي حين [اغروس] هو ملء السائل الزجاج مسبقة الصنع الشعرية الشعرية باستخدام القوات بوضع أحد طرفي الزجاج السائل، والانتظار لبضع دقائق. تخزين الجسور حتى الاستخدام عند 4 درجة مئوية في المفوضية الأوروبية دون السكر.
  7. إعداد البورسليكات الزجاج مع خيوط التصحيح الممصات باستخدام ساحبة ماصة مناسبة. أرجع إلى دليل ساحبة ماصة للحصول على مقاومة القطب المنشود.
    ملاحظة: تفتق ماصة ينبغي أن تكون قصيرة قدر الإمكان. ويتحقق باستخدام الخطوات 4-6 سحب ماصة قصيرة مستدقة. ينبغي أن تكون مقاومة القطب بين 2 و 6 MΩ تبعاً لحجم الخلية.
  8. لتجنب معطف حركة الأنسجة أثناء تجارب التصحيح-المشبك على سطح قاعة تسجيل مع 0.1% بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) في المخزن المؤقت بورات.
    1. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت بورات (25 مم):
      1. حل ز 4.768 نا2ب4س7ح 102س في 450 مل من النقاوة ح2س في كوب زجاج استخدام المحرض مغناطيسية.
      2. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 8.4 مع HCl.
      3. نقل الحل إلى دورق حجمي 500 مل. ملء قارورة الحجمي مع عالي النقاوة ح2س حتى 500 مل و 0.2 ميكرون فلتر تعقيم الحل باستخدام نظام الشفط المياه.
    2. تحضير حلاً أسهم 1% بي (1 مل بي 50% إلى 49 مل 25 مم بورات المخزن المؤقت) وإضعاف بي 0.1% بتمييع ميليلتر 10 حل الأسهم 1% في 100 ميليلتر من بورات المخزن المؤقت للاستخدام النهائي.
    3. إضافة 2 مل بي 0.1% على الزجاج حامل شريحة واسمحوا للطلاء احتضانها لمدة 1 دقيقة. ثم بإيجاز يغسل الزجاج مرتين مع 5 مل من النقاوة ح2س واسمحوا الهواء الجاف حتى الاستخدام.
  9. إعداد الحلول الامفوتريسين B.
    1. جعل الحل الأسهم 60 ملغ/مل بتذويب 3 ملغ مسحوق الامفوتريسين بفي 50 ميليلتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])، في أنبوب 1 مل محمية من الضوء. دوامة في السرعة القصوى لمدة 30 ثانية و sonicate لمدة 15 دقيقة مجانسة. تخزين مختبرين في أنابيب 3-5 في-20 درجة مئوية واستخدام قاسمة واحد يوميا.
      ملاحظة: إذا لم يكن الحل الامفوتريسين باﻷسهم واضح والأصفر اللون ولكن حليبي (الأصفر لا يزال) بعد 15 – 20 دقيقة سونيكيشن جعل حل مخزون جديد.
    2. جعل الحل IC مع الامفوتريسين B من بيبيتينج 2 مل من المجتمع الدولي في كوب زجاج نظيفة مع أكثر من قدرة 10 مل. إضافة 8 ميليلتر الامفوتريسين باﻷسهم الحل إلى الحل ماصة، ومزيج من بيبيتينج. التفاف أخلطه مع رقائق الألومنيوم ومكان على الجليد حتى استخدامها وتجديدها كل ح 3.

2-تشريح وتقطيع مع فيبرتوم

  1. إعداد أدوات التشريح قبل تشريح، بما في ذلك واحدة حادة وملقط قوي واحد مع المقص. تنظيف الأدوات (حامل مناديل، فرشاة، الملقط) مع الإيثانول والتأكد من أنها تستخدم فقط لأغراض التشريح، وابدأ على اتصال الأنسجة الثابتة. الاحتفاظ بها في مربع منفصل لتجنب التلوث.
  2. Euthanize الأسماك في المياه الباردة الجليد لمدة 1 دقيقة.
  3. اتبع الخطوات اللاحقة لتشريح الميداكا الدماغ والغدة النخامية بسرعة بالملقط حادة (استخدام لا يزيد عن 3 دقائق).
    1. في حين عقد السمك مع الملقط قوية شديدة الأعصاب البصرية هما وراء العينين مع مقص أو الملقط حادة.
    2. فتح الجزء الظهرية الجمجمة من مؤخرة الجانب الأمامي بكسر عظام الجمجمة خطوة بخطوة مع الملقط قوية.
    3. تقشر الجمجمة على جانب واحد مع الملقط قوية.
    4. شديد على الحبل الشوكي مع مقص أو الملقط حادة.
    5. بلطف، الاستيلاء على الحبل الشوكي مع الملقط والوجه الدماغ من الخلفي إلى الأمامي ووضعه في طبق مع المثلج Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية.
  4. ملء قالب معدني 1.5 – 2 سم3 مع سائل [اغروس] ووضعه على الجليد.
  5. فقط قبل أن يقوي [اغروس] (في حوالي 25-30 درجة مئوية)، بلطف الاستيلاء على المخ بالحبل الشوكي مع الملقط والجاف الملقط مع قطعة من الورق الجميلة ووضع الأنسجة [اغروس]. مزيج [اغروس] تمييع آثار الجماعة الأوروبية تركت حول الأنسجة وتوجيه الأنسجة واسمحوا العفن على الجليد لبضع ثوان حتى يصلب [اغروس] بسرعة.
    ملاحظة: من الضروري لهذه الخطوة أن تكون سريعة. [اغروس] يتصلب بسرعة كما يتم تبريده العفن معدنية بالجليد.
  6. تقليم كتلة مربعة من [اغروس] التي تحتوي على الأنسجة بشفرة المبضع والصقه على صاحب العينة فيبرتوم استخدام الغراء جراحة (غير سامة).
  7. ملء ومبومو فيبرتوم تلقي صاحب (الدماغ-الغدة النخامية) عينة مع المثلج Ca2 + مجاناً ec.
  8. ضع صاحب العينة إلى فيبرتوم وخفض الكتلة [اغروس] جعل المقاطع باراساجيتال من 150 ميكرومتر، استخدام الترددات العالية وسرعة منخفضة لتمزيقها. تجميع المقاطع المحددة ووضعها في دائرة تسجيل التصحيح-المشبك مع 3 مل من المثلج Ca2 + مجاناً ec.
  9. ضع القيثارة الشبكة (الشكل 2ب) على قسم الأنسجة.
    ملاحظة: القيثارة سوف جنبا إلى جنب مع الطلاء استقرار الأنسجة ومنعه من التحرك خلال تسجيلات المشبك التصحيح.
  10. بعد القيثارة في مكان، تغيير Ca2 + مجاناً المفوضية الأوروبية المتوسطة للمفوضية الأوروبية العادية مع Ca2 + وجيش صرب البوسنة. ترك بقية الأنسجة لمدة 10 دقائق.

3-مثقب التصحيح-المشبك والتسجيلات الكهربية

  1. قبل البدء التجربة، كلوريد الفضة سلك كهربائي بالخطوات التالية: أولاً، استخدام الصنفرة غرامة (p180) لتنظيف أقطاب الأسلاك الفضية. وثانيا، شطف مع 2 مل، إيثانول 70%. ثالثا، تراجع الأسلاك في 2 مل، الكلور 2-5% لمدة 10 دقائق. وأخيراً، شطف مع 2 مل، عالي النقاوة H2o.
  2. ضع دائرة التسجيل مع شريحة الدماغ-الغدة النخامية في مرحلة مجهر وتحديد موقع المنطقة المستهدفة (الغدة النخامية) باستخدام 10 X الهدف وفحص الخلايا باستخدام 40 X الهدف.
    ملاحظة: إذا كان الإعداد بنجاح، يجب أن تكون قليلة جداً من الخلايا جولة مرئية. من هذه الخلايا جولة عادة تلف الخلايا التي يتم فصلها من الأنسجة.
  3. ضع قطب التأريض من خلال جسر أجار 2% إلى حمام المفوضية الأوروبية.
  4. حدد موقع خلية صحية باستخدام هدف X 40.
    ملاحظة: خلية صحية ينبغي إيمانا راسخا تعلق بشريحة الأنسجة ولا تقريب وفصل من الشريحة.
  5. تعيين مكبر للصوت في الجهد-المشبك (اتفاقية فيينا؛ وضع نقطة 4A الشكل 1). فتح الختم اختبار تكوين الحمام نافذة والصحافة (الشكل 4 باء النقطة 1 و 2. استخدام نبضة 5-أم لمراقبة مقاومة ماصة (الشكل 4 باء النقطة 3).
  6. الردم غيض ماصة التصحيح مع الحل IC الحرة المضادة للفطور قبل إضافة الحل IC مع الامفوتريسين باستخدام المحاقن الصغيرة-حشو (انظر الشكل 3).
  7. إضافة ضغط هواء إيجابي طفيف في ماصة التصحيح باستخدام المحاقن 1 مل.
    ملاحظة: وهذا يجعل تدفق سائل صغيرة من ماصة التصحيح التي تجنب تلوث الحافة.
  8. مرة واحدة في الحمام، تقييم مقاومة ماصة التصحيح والتأكد من لا جزيئات ترتبط غيض الماصة (الشكل 4).
    ملاحظة: يتم إرفاق قطعة صغيرة من الشريط على شاشة عرض النموذج تسجيل الفيديو مجال الرؤية. وهذا يجعل الموضع من ماصة التصحيح بالنسبة للخلية أسهل عندما لا تركز في الخلية الهدف.
  9. دليل ماصة التصحيح وصولاً إلى الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتورس.
    ملاحظة: تأكد من أن الماصة نظيفة بالبحث عن الجسيمات الصغيرة التي قد تعلق على تلميح الماصة. التغيرات المفاجئة في المقاومة قد تكون أيضا نتيجة لجسيمات عالقة في تلميح ماصة.
  10. تعديل ماصة عند عدد قليل ميكرون فوق الخلية حيث أنه سوف غيض ماصة اللمس الخلية 1/3 من منتصف الخلية، كما هو موضح في الشكل 5. عند لمس الخلية، الإفراج عن الضغط وتطبيق الشفط لطيف لجعل ختم.
    ملاحظة: الوقت من ماصة التصحيح يدخل الحمام لناجحة ينبغي أن يوضع خاتم قصيرة قدر الإمكان. لا أكثر من 1 – 1.5 دقيقة بغية تجنب الامفوتريسين بالتوصل إلى طرف الماصة وتسرب في الحمام.
  11. قم بالتبديل إلى إطار التصحيح في برامج التصحيح-المشبك (النقطةرقم 4 د 1) على الفور وعلى إمكانية عقد بين أم-50 و-60 (النقطة 2 منالشكل 4 ). صفر السعة السريع الذي يتكون من ماصة زجاجية (النقطة 3 منالشكل 4 ).
  12. التبديل إلى إطار الخلية في برامج التصحيح-المشبك (الرقم 4E النقطة 1 و 2) والبدء في رصد وصول المقاومة، جمهورية أرمينيا، المعروضة في الإطار. صفر خارج الغشاء السعة في برنامج مكبر للصوت (الرقم 4E النقطة 3) بعد وصول كافية.
    ملاحظة: قد يستغرق وصول كافية 10 إلى 30 دقيقة (الرقم 4E النقطة 2). ينبغي أن يكون منفذ جيد لتسجيلات المشبك الحالية أدناه 20 مترا.
  13. قم بالتبديل إلى الحالي المشبك، IC، في إطار برنامج مكبر للصوت (الرقم 4F النقطة 1). ضبط التيارات سعوية تعمل بسرعة في إطار برنامج مكبر للصوت (الرقم 4F نقطة 2 و 3) إلى نفس القيمة كما هو الحال في 3.12 -المشبك . التحقق من إمكانات غشاء (الرقم 4F النقطة 1).
    ملاحظة: الأهم من ذلك، إذا كان الغشاء المحتملة الضحلة (نموذجي أعلاه-35 mV) الخلية قد يكون معطوباً. إلغاء التسجيل والبحث عن خلية جديدة.
  14. بعد العثور على خلية صحية (المرفقة بحزم للأنسجة مع غشاء المحتملة أدناه-40 mV)، تبدأ التسجيلات التجريبية كما هو مفصل في البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة،من 3334.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوضح هذا البروتوكول بروتوكول خطوة بخطوة عن كيفية تحقيق موثوق بها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية (جونادوتروبي)، باستخدام خط الميداكا المعدلة وراثيا [تيراغرام (لهب-هرجفبيي)] حيث الخلايا المستهدفة (Lh المنتجة جونادوتروبيس) تتم تسمية مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل).

في البداية، أجريت التحقيقات الكهربية باستخدام التكوين كامل الخلية. ومع ذلك، لوحظت إمكانات العمل العفوي لا في أي من الخلايا المدروسة....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية التصحيح-المشبك على شرائح المخ--الغدة النخامية تتطلب التحسين الدقيق. بروتوكولات جيدا الأمثل لإجراء تحقيقات خلية يعيش على وجه التحديد في اريوكروماس محدودة، مع غالبية المنشورات باستخدام البروتوكولات القائمة على نظم الثدييات. وفي هذا الصدد، من المهم أن تدرك حقيقة أن العديد من المعلمات الفسيولوجية مثل درجة الحموضة و osmolality ليس فقط الأنواع معتمدة، ولكن أيضا يتوقف إلى حد كبير على ما إذا كان الكائن الحي في السؤال تعيش على الأرض أو في المياه. للأسماك، ومن الضروري أيضا، أن تأخذ في الاعتبار، إذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

شكر وتقدير

ونشكر السيدة لورديسكاريون ز تان لمساعدة لها صيانة المرفق الميداكا وبلتيير أنتوني لأرقام توضيحية. تم تمويل هذا العمل نمبو، ومجلس البحوث في النرويج، أرقام المنح 244461 (برنامج تربية الأحياء المائية) و 248828 (برنامج النرويج الحياة الرقمية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
VibratomeLeicaVT1000 S
الغراء ChirurgicalWPIVETBOND3M Vetbond شفرات
لاصقة من الفولاذ المقاومشفرات Campden Instruments752-1-SS
قوالب معدنيةSAKURA4122
أدوات القيثارة الفولاذيةWarner64-1417
PBSSIGMAD8537
التصحيح فائقة النقاء LMP agaroseinvitrogen166520-100
أداة SutterBF150-110-10HPالبورسليكات مع خيوط OD: 1.5 مم ، معرف: 1.10 مم
شرائح المجهرScientificapro6000
P-Clamp10الأجهزة الجزيئية# 1-2500-0180sofware
Digitizer Digidata 1550A1الأجهزة الجزيئيةDD1550
مكبر للصوت Multiclap 700B Headstage CV-7Bالأجهزة الجزيئية1-CV-7B
GnRHBachem4108604H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH ملح ثلاثي فلورو أسيتات  
مجتذب الماصةأداة Sutter InstrumentP-1000
أمفوتريسين BSIGMAA9528مضاد حيوي
بولي إيثيلينيمين المسام المكونة   ؛SIGMAP314350٪ PEI حل
حقنة ميكروفيلر WPIMF28 / g67-5
زجاج لجسر أجارأداة سوترBF200-116-15البورسليكات مع خيوط OD: 2.0 مم ، معرف: 1.16 مم
للحريق برنامج الفحص المجهري مفتوح المصدر
optiMOS sCMOS كاميراQimaging  ؛ 01-OPTIMOS-R-M-16-C
سونيكاتورElmaD-7700 singen
NaClSiGMAS3014
KClSiGMAP9541
MgCl2< / sub>SiGMAM8266
D-GlucoseSiGMAG5400
HepesSiGMAH4034
CaCl< sub>2< / sub>SiGMAC8106
السكروزSiGMA84097
D-mannitolSiGMA63565
MES-acidSIGMAM0895
BSASIGMAA2153
للصدأ ماصات برنامج Micro-Manager مصقول

المراجع

  1. Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
  2. Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trends Endocrinol Metab. 16 (4), 152-159 (2005).
  3. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Dopamine-D2 actions on voltage-dependent calcium current and gonadotropin-II secretion in cultured goldfish gonadotrophs. J Neuroendocrinol. 10 (3), 175-186 (1998).
  4. Chang, J. P., Pemberton, J. G. Comparative aspects of GnRH-Stimulated signal transduction in the vertebrate pituitary - Contributions from teleost model systems. Mol Cell Endocrinol. , (2017).
  5. Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. Inward membrane currents and electrophysiological responses to GnRH in ovine gonadotropes. Neuroendocrinology. 61 (6), 609-621 (1995).
  6. Ben-Jonathan, N., Hnasko, R. Dopamine as a Prolactin (PRL) Inhibitor. Endocrine Reviews. 22 (6), 724-763 (2001).
  7. Sanchez-Cardenas, C., Hernandez-Cruz, A. GnRH-Induced [Ca2+]i-signalling patterns in mouse gonadotrophs recorded from acute pituitary slices in vitro. Neuroendocrinology. 91 (3), 239-255 (2010).
  8. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  9. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  10. Neher, E. Techniques in cellular physiology. Baker, P. F. , Elsevier/North. Holland. 4-19 (1981).
  11. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
  12. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  13. Marty, A., Neher, E. Single Channel Recording. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 113-114 (1983).
  14. Lindau, M., Fernandez, J. M. IgE-mediated degranulation of mast cells does not require opening of ion channels. Nature. 319 (6049), 150-153 (1986).
  15. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  16. Rae, J., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. Low access resistance perforated patch recordings using amphotericin B. J Neurosci Methods. 37 (1), 15-26 (1991).
  17. Fan, J. S., Palade, P. Perforated patch recording with beta-escin. Pflugers Arch. 436 (6), 1021-1023 (1998).
  18. Hodne, K., von Krogh, K., Weltzien, F. A., Sand, O., Haug, T. M. Optimized conditions for primary culture of pituitary cells from the Atlantic cod (Gadus morhua). The importance of osmolality, pCO(2), and pH. Gen Comp Endocrinol. 178 (2), 206-215 (2012).
  19. Sakmann, B., Neher, E. Single-Channel Recording. , Springer. US. 3-35 (1983).
  20. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  21. Guerineau, N. C., Bonnefont, X., Stoeckel, L., Mollard, P. Synchronized spontaneous Ca2+ transients in acute anterior pituitary slices. J Biol Chem. 273 (17), 10389-10395 (1998).
  22. Levavi-Sivan, B., Bloch, C. L., Gutnick, M. J., Fleidervish, I. A. Electrotonic coupling in the anterior pituitary of a teleost fish. Endocrinology. 146 (3), 1048-1052 (2005).
  23. Guerineau, N. C., McKinney, R. A., Debanne, D., Mollard, P., Gahwiler, B. H. Organotypic cultures of the rat anterior pituitary: morphology, physiology and cell-to-cell communication. J Neurosci Methods. 73 (2), 169-176 (1997).
  24. Yu, Y., Ali, D. W., Chang, J. P. Characterization of ionic currents and electrophysiological properties of goldfish somatotropes in primary culture. Gen Comp Endocrinol. 169 (3), 231-243 (2010).
  25. Price, C. J., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Voltage-activated ionic currents in goldfish pituitary cells. Gen Comp Endocrinol. 92 (1), 16-30 (1993).
  26. Van Goor, F., Goldberg, J. I., Chang, J. P. Electrical membrane properties and ionic currents in cultured goldfish gonadotrophs. Can J Physiol Pharmacol. 74 (6), 729-743 (1996).
  27. Xu, S., Shimahara, T., Cooke, I. M. Capacitance increases of dissociated tilapia prolactin cells in response to hyposmotic and depolarizing stimuli. Gen Comp Endocrinol. 173 (1), 38-47 (2011).
  28. Haug, T. M., Hodne, K., Weltzien, F. A., Sand, O. Electrophysiological properties of pituitary cells in primary culture from Atlantic cod (Gadus morhua). Neuroendocrinology. 86 (1), 38-47 (2007).
  29. Strandabo, R. A., et al. Signal transduction involved in GnRH2-stimulation of identified LH-producing gonadotropes from lhb-GFP transgenic medaka (Oryzias latipes). Mol Cell Endocrinol. 372 (1-2), 128-139 (2013).
  30. Hodne, K., et al. Electrophysiological differences between fshb- and lhb-expressing gonadotropes in primary culture. Endocrinology. 154 (9), 3319-3330 (2013).
  31. Wittbrodt, J., Shima, A., Schartl, M. Medaka--a model organism from the far East. Nat Rev Genet. 3 (1), 53-64 (2002).
  32. Ball, J. N. Hypothalamic control of the pars distalis in fishes, amphibians, and reptiles. Gen Comp Endocrinol. 44 (2), 135-170 (1981).
  33. pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis For Comprehensive Electrophysiology User Guide. Molecular Devices Corporation. , (2006).
  34. MultiClamp 700B COMPUTER-CONTROLLED MICROELECTRODE AMPLIFIER Theory and Operation. Axon Instruments / Molecular Devices Corp. , (2005).
  35. Dominguez-Mancera, B., et al. Leptin regulation of inward membrane currents, electrical activity and LH release in isolated bovine gonadotropes. Biochem Biophys Res Commun. 491 (1), 53-58 (2017).
  36. Schmidt-Nielsen, K. Animal Physiology : adptation and environment fifth edition. , Cambridge university press. 613(1997).
  37. Burton, R. F. Evolutionary determinants of normal arterial plasma pH in ectothermic vertebrates. J Exp Biol. 205, Pt 5 641-650 (2002).
  38. Burton, R. F. The dependence of normal arterial blood pH on sodium concentration in teleost fish. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Physiology. 114 (2), 111-116 (1996).
  39. Heming, T. A., Blumhagen, K. A. Plasma acid-base and electrolyte states of rainbow trout exposed to alum (aluminum sulphate) in acidic and alkaline environments. Aquatic Toxicology. 12 (2), 125-139 (1988).
  40. Reeves, R. B. The interaction of body temperature and acid-base balance in ectothermic vertebrates. Annu Rev Physiol. 39, 559-586 (1977).
  41. Baicu, S. C., Taylor, M. J. Acid-base buffering in organ preservation solutions as a function of temperature: new parameters for comparing buffer capacity and efficiency. Cryobiology. 45 (1), 33-48 (2002).
  42. Miyanishi, H., Inokuchi, M., Nobata, S., Kaneko, T. Past seawater experience enhances seawater adaptability in medaka, Oryzias latipes. Zoological Lett. 2, 12(2016).
  43. Cass, A., Finkelstein, A., Krespi, V. The ion permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 100-124 (1970).
  44. Holz, R., Finkelstein, A. The water and nonelectrolyte permeability induced in thin lipid membranes by the polyene antibiotics nystatin and amphotericin B. J Gen Physiol. 56 (1), 125-145 (1970).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Oryzias latipes
شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.