توضح هذه المقالة بروتوكولا أمثل لصنع شرائح أنسجة المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق، استخدام الأسماك تيليوست الميداكا (Oryzias latipes)، تليها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية باستخدام تقنية المشبك التصحيح مع تكوين تصحيح مثقب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
شرائح المخ--الغدة النخامية سليمة للتحقيقات الكهربية من خلايا الغدة النخامية في الأسماك تيليوست
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد أجريت تحقيقات الكهربية خلايا الغدة النخامية في العديد من الأنواع الفقارية، ولكن عدد قليل جداً في الأسماك تيليوست. ومن بين هذه، تم إجراء غالبية واضحة على ينتابها الابتدائية الخلايا. لتحسين فهمنا لكيفية تيليوست خلايا الغدة النخامية، وتتصرف في بيئة ذات صلة أكثر بيولوجيا، هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد شرائح المخ--الغدة النخامية قابلة للتطبيق استخدام الميداكا الصغيرة من أسماك المياه العذبة (Oryzias latipes). جعل شرائح المخ--الغدة النخامية، درجة الحموضة وأوسمولاليتي لجميع الحلول عدلت إلى القيم الموجودة في سوائل الجسم من أسماك المياه العذبة التي تعيش في 25 إلى 28 درجة مئوية. وبعد إعداد شريحة، البروتوكول يوضح كيفية إجراء التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية ثقب كامل الخلية التصحيح-المشبك. تقنية التصحيح-المشبك أداة قوية مع الأزمنة لم يسبق لها مثيل وحساسية، السماح بالتحقيق في خصائص الكهربائية من الخلايا كلها سليمة وصولاً إلى قنوات أيون واحد. مثقب التصحيح فريدة من نوعها في ذلك فإنه يحتفظ بالبيئة داخل الخلايا سليمة منع العناصر التنظيمية في سيتوسول من يجري تمييع الحل الكهربائي ماصة التصحيح. وفي المقابل، عند إجراء تسجيلات كامل الخلية التقليدية، فقد لوحظ أن خلايا الغدة النخامية الميداكا تفقد بسرعة قدرتها على إطلاق إمكانات العمل. بين انثقاب مختلف التقنيات المتاحة، هذا البروتوكول يوضح كيفية تحقيق انثقاب الغشاء مصححة باستخدام مبيد الامفوتريسين باء
المقدمة
الغدة النخامية جهاز الغدد الصماء رئيسية في الفقاريات الموجودة أدناه تحت المهاد والخلفية إلى chiasm البصرية. وتنتج وتفرز الهرمونات ستة إلى ثمانية من أنواع الخلايا المحددة. هرمونات الغدة النخامية تشكل وسيط بين الدماغ والأجهزة الطرفية ومحرك مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية الأساسية بما في ذلك النمو والتكاثر، وتنظيم التوازن. مشابهة للخلايا العصبية، خلايا الغدد الصماء الغدة النخامية منفعل كهربائياً مع القدرة على إطلاق إمكانات العمل تلقائياً 1. ودور هذه إمكانات العمل هو الخلية التابعة. في العديد من أنواع الخلايا في الغدة النخامية الثدييات، إمكانات العمل يمكن أن ترفع داخل الخلية Ca2 + بما فيه الكفاية لإطلاق سراح المطرد لهرمون
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجرى جميع الحيوانات معالجة وفقا لتوصيات للعناية والرعاية للحيوانات البحوث في الجامعة النرويجية لعلوم الحياة، وتحت إشراف المحققين المأذون بها.
1-إعداد الأدوات والحلول
ملاحظة: يجب أن تكون جميع الحلول العقيمة. ينبغي إيلاء الاهتمام إلى درجة الحموضة وأوسمولاليتي (أوسمول/كغ ماء) لجميع الحلول، التي ينبغي أن تتكيف البيئة خارج الخلية للأنواع المدروسة بعناية دقيقة. ينبغي أن تعدل الحموضة و osmolality مع المعدات الإلكترونية الدقيقة مثل مقياس الأس الهيدروجيني ودرجة التجمد أوسموميتير على التوالي.
- جعل 500 مل من محلول خارج الخلوية دون Ca2 + (Ca2 + مجاناً الجماعة الأوروبية): 150 مم كلوريد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح هذا البروتوكول بروتوكول خطوة بخطوة عن كيفية تحقيق موثوق بها التسجيلات الكهربية من خلايا الغدة النخامية (جونادوتروبي)، باستخدام خط الميداكا المعدلة وراثيا [تيراغرام (لهب-هرجفبيي)] حيث الخلايا المستهدفة (Lh المنتجة جونادوتروبيس) تتم تسمية مع البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل).
في البداية، أجريت التحقيقات الكهربية باستخدام التكوين كامل الخلية. ومع ذلك، لوحظت إمكانات العمل العفوي لا في أي من الخلايا المدروسة........
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التسجيلات الكهربية باستخدام تقنية التصحيح-المشبك على شرائح المخ--الغدة النخامية تتطلب التحسين الدقيق. بروتوكولات جيدا الأمثل لإجراء تحقيقات خلية يعيش على وجه التحديد في اريوكروماس محدودة، مع غالبية المنشورات باستخدام البروتوكولات القائمة على نظم الثدييات. وفي هذا الصدد، من المهم أن تدرك حقيقة أن العديد من المعلمات الفسيولوجية مثل درجة الحموضة و osmolality ليس فقط الأنواع معتمدة، ولكن أيضا يتوقف إلى حد كبير على ما إذا كان الكائن الحي في السؤال تعيش على الأرض أو في المياه. للأسماك، ومن الضروري أيضا، أن تأخذ في الاعتبار، إذ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
ونشكر السيدة لورديسكاريون ز تان لمساعدة لها صيانة المرفق الميداكا وبلتيير أنتوني لأرقام توضيحية. تم تمويل هذا العمل نمبو، ومجلس البحوث في النرويج، أرقام المنح 244461 (برنامج تربية الأحياء المائية) و 248828 (برنامج النرويج الحياة الرقمية).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| الغراء Chirurgical | WPI | VETBOND | 3M Vetbond شفرات |
| لاصقة من الفولاذ المقاوم | شفرات Campden Instruments | 752-1-SS | |
| قوالب معدنية | SAKURA | 4122 | |
| أدوات القيثارة الفولاذية | Warner | 64-1417 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| التصحيح فائقة النقاء LMP agarose | invitrogen | 166520-100 | |
| أداة Sutter | BF150-110-10HP | البورسليكات مع خيوط OD: 1.5 مم ، معرف: 1.10 مم | |
| شرائح المجهر | Scientifica | pro6000 | |
| P-Clamp10 | الأجهزة الجزيئية | # 1-2500-0180 | sofware |
| Digitizer Digidata 1550A1 | الأجهزة الجزيئية | DD1550 | |
| مكبر للصوت Multiclap 700B Headstage CV-7B | الأجهزة الجزيئية | 1-CV-7B | |
| GnRH | Bachem | 4108604 | H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH ملح ثلاثي فلورو أسيتات |
| مجتذب الماصة | أداة Sutter Instrument | P-1000 | |
| أمفوتريسين B | SIGMA | A9528 | مضاد حيوي |
| بولي إيثيلينيمين المسام المكونة ؛ | SIGMA | P3143 | 50٪ PEI حل |
| حقنة ميكروفيلر WPI | MF28 / g67-5 | ||
| زجاج لجسر أجار | أداة سوتر | BF200-116-15 | البورسليكات مع خيوط OD: 2.0 مم ، معرف: 1.16 مم |
| للحريق برنامج الفحص المجهري مفتوح المصدر | |||
| optiMOS sCMOS كاميرا | Qimaging | ؛ 01-OPTIMOS-R-M-16-C | |
| سونيكاتور | Elma | D-7700 singen | |
| NaCl | SiGMA | S3014 | |
| KCl | SiGMA | P9541 | |
| MgCl2< / sub> | SiGMA | M8266 | |
| D-Glucose | SiGMA | G5400 | |
| Hepes | SiGMA | H4034 | |
| CaCl< sub>2< / sub> | SiGMA | C8106 | |
| السكروز | SiGMA | 84097 | |
| D-mannitol | SiGMA | 63565 | |
| MES-acid | SIGMA | M0895 | |
| BSA | SIGMA | A2153 |
المراجع
- Stojilkovic, S. S., Tabak, J., Bertram, R. Ion channels and signaling in the pituitary gland. Endocr Rev. 31 (6), 845-915 (2010).
- Stojilkovic, S. S., Zemkova, H., Van Goor, F. Biophysical basis of pituitary cell type-specific Ca2+ signaling-secretion coupling. Trend....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
