التسلسل بالغ السكان الخميرة المختارة للتفاعلات الإيجابية الخميرة 2-الهجين يحتمل أن تكون غلة ثروة معلومات حول التفاعل شريك البروتينات. هنا، يمكننا وصف تشغيل أدوات المعلوماتية الحيوية المحددة والبرامج المحدثة المخصصة لتحليل بيانات تسلسل من هذه الشاشات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ونحن قد تكيفت المقايسة 2-الهجين الخميرة في الوقت نفسه كشف العشرات من تفاعلات البروتين عابرة وثابتة ضمن شاشة واحدة تستخدم الفائق قصيرة-قراءة تسلسل الحمض النووي. مجموعات البيانات الناتجة عن تسلسل يمكن أن تتبع ما الجينات في عدد سكان التي هي إثراء من خلال التحديد للتفاعلات الإيجابية الخميرة 2-الهجين، بل أيضا إعطاء معلومات مفصلة حول المجالات الفرعية ذات الصلة من البروتينات كافية للتفاعل. وهنا يصف لنا مجموعة كاملة من البرامج القائمة بذاتها التي تسمح لغير الخبراء لأداء جميع المعلوماتية الحيوية والخطوات الإحصائية لمعالجة وتحليل ملفات فستق تسلسل الحمض النووي من تحليل 2-هجين خميرة دفعة. خطوات المعالجة المشمولة بهذه البرامج وتشمل: ما يلي تسلسل 1) رسم الخرائط والعد المقابلة لكل مرشح البروتين المشفرة داخل مكتبة فريسة 2-الهجين خميرة؛ 2) برنامج تحليل الإحصائي الذي يقيم في التشكيلات الجانبية للإثراء؛ و 3) أدوات لدراسة الإطار متعدية الجنسيات والموقف داخل منطقة الترميز لكل بلازميد المخصب الذي يشفر البروتينات المتفاعلة للفائدة.
المقدمة
نهج واحد لاكتشاف تفاعلات البروتين هو الإنزيم (Y2H) 2-الهجين الخميرة، الذي يستغل هندسيا خلايا الخميرة التي تنمو فقط عندما وتين اهتمام بربط جزء من شريك المتفاعلة1. الآن يمكن أن يتم الكشف عن عدة Y2H التفاعلات مع مساعدة ضخمة يسلسل الفائق موازية. العديد من الأشكال وقد تم وصف2،3،،من45 بما في ذلك وضعنا وتزرع فيها السكان دفعة واحدة في ظل الظروف التي حدد للخميرة التي تحتوي على البلازميدات التي تنتج إيجابية التفاعل Y2H6. سير العمل نحن البلدان المتقدمة النمو، يسمى ديبن (التخصيب الحيوي لشبكات التقييم من البروتين)، ويحدد إينتيراكتوميس التفاضلية من نفس مكتبات فريسة لتحديد البروتينات التي تتفاعل مع واحد من البروتين (أو المجال) مقابل. بروتين آخر أو مجال المسخ كونفورماتيونالي متميزة. إحدى الخطوات الرئيسية في سير العمل هذا هو التجهيز السليم وتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي. يمكن أن تكون بعض المعلومات المستقاة بمجرد إحصاء عدد القراءات لكل الجينات سواء قبل أو بعد التحديد التفاعلات Y2H بطريقة مشابهة لتجربة تسلسل الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، يمكن استخراج معلومات متعمقة أكثر بكثير من مجموعات البيانات هذه بما في ذلك المعلومات المتعلقة بالمجال الفرعي بروتين معين التي قادرة على إنتاج تفاعل Y2H. وباﻹضافة إلى ذلك، بينما النهج ديبن الذي قيمة، تحليل العديد من عينة replicates يمكن أن تكون مرهقة ومكلفة. هو التخفيف من حدة هذه المشكلة باستخدام نموذج إحصائي تم تطويره خصيصا لمجموعات البيانات ديبن حيث هو عدد replicates محدودة6. لجعل معالجة وتحليل مجموعات البيانات تسلسل الحمض النووي موثوق بها وكاملة وقوية وموجودا للمحققين دون الخبرة المعلوماتية الحيوية، قمنا بتطوير مجموعة من البرامج التي تغطي كافة الخطوات للتحليل.
ويشمل هذا الجناح من البرامج القائمة بذاتها التي يتم تشغيلها على أجهزة كمبيوتر سطح المكتب MAPster وديبن و Stat_Maker. MAPster هو واجهة مستخدم الرسومية التي يسمح كل ملف فستق في قائمة الانتظار لرسم خرائط الجينوم استخدام برنامج HISAT27، إنتاج ملف.sam قياسية للاستخدام في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وقد ديبن عدة وحدات. وهو يعين والتهم ما يلي المقابلة للجينات خاصة مماثلة للقياس الكمي نوع تسلسل الحمض النووي الريبي استخدام الوحدة النمطية 'العد الجينات'. كما تستخرج في تسلسل المقابلة على مفترق الطرق بين المجال النسخي Gal4 وتسلسل فريسة وجمع موقف تلك الوصلات للسماح بعمليات التفتيش بمقارنة الجداول والرسوم البيانية (باستخدام الوحدة النمطية 'Junction_Make') يسمح الوحدة النمطية 'Blast_Query' التفتيش سهلة، كوانتيتيشن، ومقارنة التسلسلات تقاطع مفرق Gal4. تقييم Stat_Maker على ما يلي كل الجينات إثراء البيانات إحصائيا كوسيلة لتحديد أولويات المحتمل Y2H مرات. وهنا، نحن تصف كيفية استخدام هذه البرامج لتحليل تسلسل الحمض النووي تجربة البيانات من Y2H ديبن الكامل. تتوفر إصدارات ديبن لتشغيلها على أنظمة الكمبيوتر، ماك و لينكس. برامج أخرى مثل برنامج رسم الخرائط MAPster ووحدة الإحصاء ديبن Stat_Maker تعتمد على subroutines التي تعمل تحت Unix وتتوفر فقط على أنظمة Mac و linux.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-تعيين الملفات فستق
ملاحظة: ديبن البرمجيات، فضلا عن العديد من البرامج المعلوماتية الحيوية استخدام بيانات تسلسل الحمض النووي حيث تم تعيين تسلسل كل قراءة لموقفها في مرجع الحمض النووي. يمكن استخدام مجموعة متنوعة من برامج رسم الخرائط لهذا بما في ذلك واجهة MAPster هنا أن يستخدم البرنامج HISTAT2 لإنتاج.sam الملفات المستخدمة في الخطوات اللاحقة.
- تعيين تسلسل البيانات إلى الإصدار الصحيح من الجينوم. لمكتبات Y2H المنشأ الماوس، استخدام الجينوم mm10 التسخن؛ لأولئك الذين يستخدمون الجينات البشرية، استخدام الجينوم مرجع hg38 التسخن، للجينات Saccharomyces cerevisiae ، استخدام الجينوم مرجع التسخن SacCer3.
-
تثبيت MAPster.
- تحميل برنامج MAPster وتثبيتها. البرمجيات ويمكن الاطلاع على استخدام مستعرض ويب في التالي: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 يعمل على الأنظمة المستندة إلى Unix مثل Apple Macintosh. وبسبب هذا، سيتم تشغيل البرنامج MAPster فقط على أنظمة متوافقة مثل "أبل ماكنتوش" ولينكس.
ملاحظة: متطلبات النظام لبرنامج "أبل ماك": ماك + 10، 10، > 4 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي، > 500 غيغابايت من مساحة القرص، والوصول إلى الإنترنت لتنزيل جينومات مرجع. قد يحتاج المستخدمون إلى التشاور مع مؤسسي ذلك الشخص إذا كان مشروعهم بروتوكولات الأمان تقييد حقوق وأذونات مسؤول.
- تحميل برنامج MAPster وتثبيتها. البرمجيات ويمكن الاطلاع على استخدام مستعرض ويب في التالي: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 يعمل على الأنظمة المستندة إلى Unix مثل Apple Macintosh. وبسبب هذا، سيتم تشغيل البرنامج MAPster فقط على أنظمة متوافقة مثل "أبل ماكنتوش" ولينكس.
-
أدخل الملفات المطلوبة والمعلمات من خلال علامة التبويب "الرئيسية" (الشكل 1). حدد الزر "بيرويس" مناسبة لإدخال الملفات أما أزواج أو مزاوج مع فستق كتنسيق الملف الافتراضي.
- لتحليل ديبن، تشغيل الخيار "بايرويسي" إلى "إيقاف تشغيل" لتشغيل تنسيق قراءة واحدة.
- تحميل ملفات إلى MAPster ببساطة عن طريق السحب والإفلات في الإطار المناسب.
- حدد مرجع مصدر الحمض النووي/الجينوم الذي يتوافق مع مصدر إدراج مكتبة فريسة Y2H. جينومات المفهرسة من عدة نموذج الكائنات يتم سردها في مربع "الجينوم" ويمكن تحميلها تلقائياً من مركز جامعة جونز هوبكنز "علم الأحياء الحسابي". سيتم تخزين مرجع جينومات محلياً لاستخدامها في وقت لاحق.
- الإشارة إلى العدد عمليات الكمبيوتر أن تكون مكرسة لبرنامج رسم الخرائط تحت خانة "المواضيع"، منذ HISAT2 يدعم متعدد خيوط. سيتم البحث في الكمبيوتر mAPster وتشير إلى الحد الأقصى لعدد المعالجات المتوفرة بشكل افتراضي.
- تحديد اسم ملف إخراج. سيتم استخدام اسم الملف هذا في جميع مراحل عملية ديبن حيث يوصي باسم قصيرة بعد وصفي بدون مسافة أو أحرف خاصة. تحديد مجلد لإخراج الملفات المعينة باستخدام الزر "فتح دليل الإخراج".
- مرة واحدة وقد تم اختيار الملفات المناسبة والمعلمات، إضافة وظيفة التعيين لوظائف قائمة الانتظار باستخدام الزر "إضافة إلى قائمة انتظار". يمكن حذف أسماء الملفات في الإطار الرئيسي واستبدالها بملفات مطابقة لنموذج جديد ويمكن إضافتها إلى قائمة الانتظار بعد توفير اسم ملف إخراج المطابق.
- انقر فوق الزر "تشغيل قائمة انتظار" حالما يتم إدخال كافة مهام في قائمة انتظار العمل.
ملاحظة: بمجرد وظيفة رسم خرائط قد وضعت في قائمة الانتظار، تحديد تلك الوظيفة يسبب إعدادات المعلمة التي سيتم عرضها في نافذة "معلمات الوظيفة" وبيان سطر الأوامر مع كافة الوسائط ليتم عرضها في إطار "الأوامر الوظيفة". وتشمل خيارات الإخراج توجيه سواء للحفاظ على ما يلي: أن تفشل لمحاذاة، وتحديد عدد التحالفات الأولية المسموح بها لكل عملية قراءة. ملف الإخراج الافتراضي من MAPster في شكل سام (مثل ملف '.sam'). سوف يحتوي على كافة على ما يلي تسلسل من ملفات فستق المحدد لهذه العينة بما في ذلك تلك التي كانت (تعيين) ولم تكن (غير معينة) المعينة بنجاح إلى جيوم المحدد.
2-بيوينفورماتيك معالجة استخدام البرمجيات ديبن
ملاحظة: البرنامج ديبن حاليا تجميع لاستخدامها مع مكتبات فريسة تحتوي على تسلسلات كدنا الماوس، تسلسل كدنا البشرية، أو تسلسل الحمض النووي الجينومي S. cerevisiae . يقبل بتنسيق ملف قياسي.sam ديبن ويمكن قبول ملف سام (.sam) يحتوي على قراءات كل المعينة وغير المعينة أو ملفات منفصلة لكل من يقرأ المعينة وغير المعينة.
- تحميل البرمجيات ديبن وتثبيته. البرمجيات ويمكن الاطلاع على استخدام مستعرض ويب في التالي: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. حدد الإصدار الذي يطابق منصة الحوسبة والتحميل. لتثبيت، افتح حزمة التثبيت التي تم تنزيلها.
ملاحظة: تتوفر إصدارات ديبن للكمبيوتر، وماك، لينكس سيسريمس. ينبغي أن يكون لأنظمة ماك والكمبيوتر > 500 غيغابايت من مساحة القرص الثابت و > 4 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي. -
قم بفتح البرنامج ديبن. من الإطار الرئيسي (الشكل 2) حدد معلومات مكتبة فريسة المقابلة من مربع التحديد أعلى. حدد مجلد حيث يمكن الذهاب الملفات التي تمت معالجتها عن طريق النقر فوق الزر "مجلد العمل" التنقل إلى المجلد/الدليل. يمكن للمرء إنشاء مجلد/دليل جديد إذا لزم الأمر. ديبن حالما يتم تحديد مجلد "العمل"، سيتم إنشاء ثلاثة مجلدات فرعية بعنوان unmapped_sam_files، و mapped_sam_files، و sam_files.
- إذا كان استخدام ملفات.sam التي تحتوي على ما يلي كل المعينة وغير المعينة مثل تلك المنتجة مع الإعدادات الافتراضية للبرنامج MAPster، وضعها في المجلد 'sam_files'. وأﻻ وضع ملفات.sam في unmapped_sam_files و mapped_sam_files وفقا لذلك.
- بدء المعالجة بواسطة النقر فوق الزر "الجينات Count + مفرق تجعل".
ملاحظة: سوف تبدأ التجهيز مع الوحدة النمطية عدد الجينات التي سوف تستخدم خرائط مواقع لعد عدد القراءات تقابل كل الجينات. سوف ثم استخراج جعل تقاطع تقاطع تسلسل (تسلسل التي تنصهر فيها مباشرة المتلقين للمعلومات من المجال Gal4-تفعيل) من على ما يلي والتعرف عليها باستخدام خوارزمية الانفجار. سيقوم هذا بإنشاء مجموعة كاملة من المجلدات المصورة في الشكل 3. تجهيز الوقت يعتمد على حجم وعدد من ملفات البيانات تسلسل وسرعة المعالجة للكمبيوتر المستخدم. يقرأ مرات نموذجي تتراوح بين 12 – 30 ح مجموعة من البيانات تجريبية من 250 مليون. يمكن أن تبدأ إجراء عدد الجينات وإجراء Junction_Make على حدة بواسطة النقر فوق الزر "Count الجينات" أو الزر "مفترق طرق تجعل". -
تنزيل وتثبيت Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). وهذا تحليل الإحصائي حزمة مصممة لمجموعات البيانات ديبن الذي يعمل حاليا فقط على أنظمة Unix ماك.
- افتح Stat_Maker ثم انقر فوق الزر "التحقق من تثبيت" (الشكل 4). إذا كان قيد التشغيل لأول مرة، Stat_Maker سيتم تلقائياً تثبيت البحث والتطوير، والنتوءات، وبيوكوندوكتور عن طريق سحب هذه الموارد من الإنترنت. حالما يتم الكشف عن البحث والتطوير، والنتوءات، وبيوكوندوكتور، وسوف تصبح نشطة Stat_Maker وإتاحة المزيد من إدخال المستخدم.
- انقر فوق الزر "اختيار مجلد" للانتقال إلى مجلد العمل التي تتم معالجتها ديبن. سوف العثور على Stat_Maker وقائمة الملفات للتحليل الإحصائي في النافذة تلقائياً.
- سحب وإسقاط الملفات المناسبة من إطار قائمة الملف أعلاه في windows الملف أدناه لكل مجموعة بيانات متجهة، والطعم وكل شروط النمو: غير المحددة (وسائل الإعلام له +) وتحديدها (وسائل الإعلام له-). الأهم من ذلك، يتطلب Stat_Maker مجموعات البيانات المكررة لإفراغ ناقلات وحدها، نموذجين للسكان غير المحددة ونموذجين لتحديد. وهذا يعطي تقديراً للتنوع داخل هذه التجربة.
- انقر فوق الزر "تشغيل". اعتماداً على سرعة الكمبيوتر، سوف تأخذ العملية الحسابية بين 5 – 15 دقيقة.
- استعراض النتائج من إخراج Stat_Maker، التي يتم وضعها في مجلد فرعي جديد ضمن المجلد العمل الرئيسي المسمى "Stat_Maker النتائج".
ملاحظة: يتم العثور على النتائج في ملف csv (قيم مفصولة بفواصل) التي يمكن فتحها في برامج جداول البيانات. Stat_Maker وسوف رتبة يضرب الجينات التي من المحتمل أن الأثران إثراء عند التحديد مع الطعم للفائدة على اختطارها بتيف فارغة (الشكل 5). كما جدولت هو النسبة المئوية لما يلي لكل مجموعة من البيانات حيث توجد إدراج الجينات المنبع، المصب، أو داخل الإطار القراءة المفتوحة، وما إذا كان الجين موجود أيضا داخل الإطار الصحيح القراءة متعدية الجنسيات. في كثير من الأحيان، وسوف التقاط ديبن تفاعلات Y2H قوية الطعم مع أجزاء من كدنا معينة التي هي خارج الإطار القراءة السليمة للبروتين المقابل أو لجزء من كدنا أن المتلقين للمعلومات من إطاره القراءة المفتوحة المقابلة. المسح الضوئي الناتج الإجمالي من Stat_Maker يبسط كشف والقضاء على هذه الزيارات غير ذي صلة. -
لاستعراض البيانات الموجودة على كل المرشحين المحتملين، افتح البرنامج ديبن، حدد المعلومات مكتبة فريسة المقابلة ومن ثم مجلد العمل الصحيح باستخدام المجلد "العمل".
- انقر فوق الزر "استعلام الانفجار". وهذا يحمل نافذة جديدة (الشكل 6). في مربع النص العلوي، اكتب اسم الجينات أو رقم NM بنك الجينات لتحديد الجينات المرشحة للفائدة. وتناظر هذه الأسماء الجينات الأسماء المسرودة في ملف الإخراج ستاتماكير. أدخل نوع أو العودة، الذي يبدأ استرجاع الجينات للفائدة.
- حدد مجموعات البيانات التي سيتم استخدامها لتحليل استخدام القوائم "تحديد مجموعة البيانات". بشكل عام، هذه تشمل ناقلات فقط والطعم عينات نمت تحت ظروف غير انتقائية ونمت تحت شروط اختيار العينة الطعم. في البداية، مجموعات البيانات سوف يستغرق بضع لحظات لتحميل، ومع ذلك، سوف تذهب استعلام اللاحقة من نفس مجموعات البيانات مع جينات مختلفة سريعاً. سيتم عرض Blast_Query نقاط الانصهار على طول التسلسل من الفائدة وكيف وفيرة كل نقطة الانصهار. يمكن عرض هذا في تنسيق جدول باستخدام علامة التبويب "نتائج" أو تنسيق رسومي باستخدام علامة التبويب "مؤامرة" على حد سواء. هذه النتائج يمكن تصديرها إلى ملف.csv عن طريق النقر فوق الزر "حفظ.csv" في الجزء العلوي الأيمن.
3-تحقق مرشحين حددها ديبن
ملاحظة: هو الغرض من ديبن و Stat_Maker لتحديد الجينات المرشحة التي تعطي Y2H تفاعل إيجابي. التحقق من هذه التفاعلات Y2H يمكن أن يكون القيام به باستخدام تنسيق Y2H ثنائي تقليدية استخدام بلازميد الطعم لمصلحة يقترن بلازميد المجال 'فريسة' Gal4-تفعيل فارغة، فضلا عن يقترن بلازميد فريسة تحمل جزء الجينات/كدنا على الاهتمام. ليس ممكناً لعزل بلازميد الفعلية من الاهتمام داخل الخليط من الحمض النووي المعزولة من الخميرة السكان يتعرضون لانتقاء Y2H. ومع ذلك، أحد يمكن حسابياً إعمار ما الجزء الجينات/كدنا أن ينتج التفاعل Y2H تصميم كبسولة تفجير ل 5 '3' ينتهي هذا الجزء وتضخيم هذا الجزء من الحمض النووي معزولة عن السكان الخميرة. يصف هذا القسم كيفية البحث عن نهاية الجزء فريسة المرشح 5 'و 3'.
- فتح برنامج ديبن واختيار المعلمات "تحديد معلمة" ومجلد العمل "تحديد العمل مجلد" المقابلة للمشروع. بدء تشغيل الوحدة النمطية Blast_Query بواسطة النقر فوق الزر "استعلام الانفجار".
-
اكتب اسم الجينات من الفائدة أو في بنك الجينات "نيوتن متر" رقم في مربع النص العلوي. حدد من القائمة المنسدلة مجموعة البيانات الذي يتوافق مع السكان الخميرة المحدد للطعم من الفائدة لاسترداد جدول تقاطع المواقف تحت علامة التبويب 'النتائج'. بشكل افتراضي، سيتم ترتيب Blast_Query المواقف المختلفة وفقا لما وفرة في dataset، كمياً بجزء في المليون من إجمالي عدد الوصلات الموجودة داخل قاعدة البيانات.
- البحث عن موقف الأكثر وفرة بأن "في ارف" و "في إطار". القيمة لموقف يتوافق مع موقف النوكليوتيدات من الجينات مع تسلسل مرجع نكبي (عدد 'شمال البحر الأبيض المتوسط') الموجودة في مربع النص العلوي. هذا التسلسل يمكن استردادها من بنك الجينات (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) أو نسخها من مربع النص السفلي في إطار Blast_Query.
ملاحظة: يمكن العثور على مثال في الشكل 6، الفريق الأوسط. في dataset مركز، تظهر 'النتائج' كمفترق الطرق الأكثر وفرة: 'موقف': 867؛ '#Junctions': 20033.821؛ الاستعلام 'ابدأ'، 1؛ الأقراص المدمجة: في ارف؛ و 'الإطار': في الإطار. النوكليوتيدات 867 التسلسل المرجعي نكبي بنك الجينات NM_019648 هو بداية الجزء الفريسة.
- البحث عن موقف الأكثر وفرة بأن "في ارف" و "في إطار". القيمة لموقف يتوافق مع موقف النوكليوتيدات من الجينات مع تسلسل مرجع نكبي (عدد 'شمال البحر الأبيض المتوسط') الموجودة في مربع النص العلوي. هذا التسلسل يمكن استردادها من بنك الجينات (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) أو نسخها من مربع النص السفلي في إطار Blast_Query.
- إذا كان "بدء الاستعلام" هو 1، تصميم 5 ' نهاية التمهيدي تشمل النوكليوتيدات المقابلة لرقم الموضع وتمديد النيوكليوتيدات 25 في اتجاه مجرى النهر من هذا الموقف (الشكل 7). إذا كان "بدء تشغيل الاستعلام" أكثر من 1، تشير إلى أن هناك النيوكليوتيدات إضافي بين المجال التفعيل Gal4 وتسلسل فريسة للفائدة والتمهيدي أن تبدأ زيادة المصب وفقا لقيمة "بدء تشغيل الاستعلام".
- من إطار ديبن انقر فوق الزر "قراءة العمق" تحت "تحليل البيانات". بمجرد فتح النافذة "عمق القراءة"، اكتب نكبي مرجع تسلسل (NM) عدد الجينات اسم أو في مربع النص العلوي. استخدم القائمة المنسدلة لتحديد مجموعة البيانات ذات الصلة الذي يحتوي على الجين المخصب للفائدة. استخدام الجدول على اليسار وعرض الرسومات على الحق في تحديد عدد القراءات عثر في البيانات التي تتوافق مع الجينات للفائدة (الشكل 7ب).
- تصميم تمهيدي نهاية 3 'التي سيتم التقاط تسلسل جزء الجينات على حسابها"عمق القراءة". إذا كانت كثرة القراءات ويتجاوز ORF ووقف كودون، تصميم التمهيدي بحيث يشمل كودون التوقف ومنطقة فقط المنبع كودون التوقف. إذا تسلسل للجينات لا تمتد إلى الماضي كودون التوقف، استخدم "الجدول نتائج" للبحث عن منطقة 3 'الأكثر بعدا التي يمكن الكشف عنها واستخدام هذا الموقف أبعد 3' موقف لوضع الدليل التمهيدي.
ملاحظة: البرنامج "عمق القراءة" بفحص في الفواصل الزمنية لإيجاد تسلسل التي تطابق الجينات/كدنا المحدد للفائدة. ويساعد هذا التنبؤ حيث 5 'و 3' نهاية الجزء الأكثر وفرة فريسة لذلك الجين في العينة. التقلبات في عمق القراءة على طول التسلسل العادي، كما يتبين في الشكل 7. إذا كان من الواضح أن عمق قراءة الماضي كودون التوقف، تشير إلى أن تتجاوز الجزء فريسة كودون التوقف وهكذا ببساطة على التمهيدي 3 ' يمكن أن تتوافق مع المنطقة المحيطة كودون التوقف. -
أداء فعل PCR 50 ميليلتر للجينات. كل رد يحتوي على 25 بمول لكل إلى الأمام وعكس التمهيدي مطابقة بلازميد فريسة-مكتبة (انظر الجدول للمواد). تحتوي أيضا على ردود الفعل 25 ميليلتر من x PCR عالية الدقة 2 ميكس ماجستير، 5 ميكروغرام من عينات الحمض النووي، والمياه تصل إلى 50 ميليلتر.
- تضخيم ردود الفعل لدورات 25 مع تمديد أوقات 3 دقيقة في 72 درجة مئوية، الصلب درجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة 30 ق، ويشوه عند 98 درجة مئوية لمدة 10 س يسبق ركوب الدراجات التي تمسخ s 30 عند 98 درجة مئوية واتبع مع حضانة 5 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعيين البيانات فستق: الخطوة الأولى
في عمليا جميع خ ع تطبيقاته ديبن الإخراج الأولى هو ملف من ما يلي تسلسل قصيرة التي يجب تعيينها بالمحاذاة للجينوم، ترانسكريبتوميك، أو أخرى مرجعية الحمض النووي8. في الآونة الأخيرة، تم تطوير هذا البرنامج المحاذاة HISAT2 التي تستخدم خوارزميات الفهرسة الدولة من الفن إلى زيادة هائلة في تعيين سرعة7،9. HISAT2 يعمل بفاعلية على جهاز كمبيوتر سطح مكتب وخريطة الحجم عا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
جناح البرامج المشروحة هنا يسمح أحد لمعالجة وتحليل بيانات تسلسل الحمض النووي الإنتاجية العالية من تجربة ديبن تماما. البرنامج الأول الذي استخدم هو MAPster، الذي يأخذ على ما يلي تسلسل الحمض النووي في الملفات القياسية فستق وخرائط موقفهم على مرجع الحمض النووي للتجهيز النهائي بمجموعة كاملة من البرامج المعلوماتية بما في ذلك البرمجيات ديبن. الأداة المساعدة للواجهة MAPster وقدرته على قائمة الانتظار متعددة الوظائف، الجمع بين ملفات الإدخال، اسم كوفينينتلي إخراج الملفات، مقترنة بسرعة HISAT2 الأساسية ويوفر البرنامج7...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها في "المعاهد الوطنية للصحة": R21 المعاهد الوطنية للصحة EB021870-01A1 و "منحة مشروع بحوث جبهة الخلاص الوطني": 1517110.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
برنامج
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Mapster | https://github.com/emptyewer/MAPster/releases | ||
| DEEPN | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| Statmaker | https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases | ||
| الحد الأدنى لنظام الكمبيوتر | Apple | Mac Intel Core i5 أو أفضل | |
| من | 4 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي أو أفضل | ||
| 500 | جيجابايت قرص spce أو أفضل | ||
| نظام | التشغيل 10.10 أو أعلى | ||
| Dell | Intel i5-7400 أو أفضل | ||
| من | 4 جيجابايت رام أو أفضل | ||
| من | 500 جيجابايت قرص spce أو أفضل | ||
| من | Windows 7 أو أعلى |
المراجع
- Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Rajagopala, S. V. Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens. Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).
- Weimann, M., et al. A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome. Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).
- Yachie, N., et al. Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics. Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).
- Trigg, S. A., et al. CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping. Nature Methods. , (2017).
- Pashkova, N., et al. DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions. Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).
- Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
- Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. Alignment of Next-Generation Sequencing Reads. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).
- Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown. Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17, 13(2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
