مقالة منهجية

العزلة والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية تحت الجلد وأومينتال البشرية

DOI:

10.3791/57804

⸱

يوليو 17, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiological Sciences, Eastern Virginia Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفريق بين adipocytes أبيض وبيج من الأنسجة الدهنية والأوعية الدموية موروث يحمل إمكانات لتحسين التمثيل الغذائي في السمنة. يصف لنا البروتوكولات CD34 + CD31 + عزل الخلية البطانية من الدهون البشرية والتوسع اللاحق في المختبر ، والتمايز في adipocytes بيج وأبيض. وتناقش عدة تطبيقات المتلقين للمعلومات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرافق البدانة إعادة عرض واسعة من الأنسجة الدهنية في المقام الأول عن طريق تضخم adipocyte. نتائج النمو adipocyte المتطرفة في ضعف استجابة للأنسولين، ونقص المحلية، والتهاب. بحفز التفريق بين adipocytes البيضاء الفنية من فروعه، يمكن منع تضخم جذرية للسكان adipocyte، ونتيجة لذلك، يمكن تحسين صحة التمثيل الغذائي للأنسجة الدهنية جنبا إلى جنب مع تخفيض التهاب. أيضا، عن طريق تنشيط ريق adipocytes بيج/براون، نفقات الطاقة الجسم الكلي يمكن زيادة، مما يؤدي إلى فقدان الوزن. هذا النهج يمكن أن تحول دون تطور المراضات المشارك السمنة مثل داء السكري من النوع 2، وأمراض القلب والأوعية الدموية.

وتصف هذه الورقة العزلة والتوسع، والتفريق في adipocytes أبيض وبيج من مجموعة فرعية خلايا الأنسجة الدهنية البشرية بطانية المشترك تعبر عن علامات CD31 و CD34. الطريقة رخيصة نسبيا وليست كثيفة العمالة. يتطلب الوصول إلى الأنسجة الدهنية البشرية ومستودع تحت الجلد ومناسبة لأخذ العينات. لهذا البروتوكول، عينات الأنسجة الدهنية الطازجة من مواضيع السمنة سقيم [مؤشر كتلة الجسم (BMI) > 35] يتم جمعها خلال إجراءات جراحات. باستخدام إيمونوسيباريشن متسلسلة من الكسر الأوعية الدموية stromal، يتم إنتاج ما يكفي من خلايا من أقل من 2-3 غرام الدهون. هذه الخلايا يمكن توسيعها في ثقافة أكثر من 10-14 يوما، ويمكن cryopreserved، والاحتفاظ بممتلكاتهم أديبوجينيك مع باساجينج حتى سن 5-6. وتعامل الخلايا لمدة 14 يوما مع أديبوجينيك كوكتيل باستخدام مزيج من الأنسولين البشري ومؤثر-روزيغليتازون PPARγ.

يمكن أن تستخدم هذه المنهجية للحصول على دليل على مفهوم التجارب على الآليات الجزيئية التي تدفع ردود أديبوجينيك في الخلايا الدهنية بطانية، أو لفحص العقاقير الجديدة التي يمكن أن تعزز أديبوجينيك الرد موجها أما نحو الأبيض أو التفريق بين adipocyte بيج/براون. باستخدام عينة صغيرة تحت الجلد، يمكن استخدام هذه المنهجية لحجب المواضيع غير المستجيب للتجارب السريرية ويهدف إلى حفز adipocytes بيج/البنى والأبيض لعلاج السمنة والمراضات المشارك.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتبين الأدلة الأخيرة أن الفئران والبشر، يمكن أن تكون متباينة مجموعة فرعية خلايا يقطنون المفرج الأنسجة الدهنية إلى أما أبيض أو بيج/بني adipocytes1،2،3. النمط الظاهري لهذه الخلايا موضوع الخلاف، مع الأدلة المؤيدة لخلايا بطانية أو العضلات الملساء/بيريسيتي، أو طائفة من وسيطة تعمل4،5،،من67. وكان نطاق تطوير هذه المنهجية لاختبار إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + غشائي الخلايا المعزولة من مستودعات الدهون المختلفة من البشر يعانون من السمنة المفرطة. وتركز دراسات أخرى في الأدب على أديبوجينيك المحتملة في كسر الأوعية الدموية stromal مجموع أو adipocyte المعروفة المتكفل2،،من89. منذ التكنولوجيات الموجودة حاليا يمكن أن تستهدف على وجه التحديد خلايا الأنسجة الدهنية بطانية للمخدرات تسليم10، فهم إمكانات هذه الخلايا للخضوع أديبوجينيك توجيهي نحو adipocytes أبيض أو بيج من المهم العلاجات المستهدفة مستقبلا.

وذكرت مجموعات مختلفة مزيج علامات CD31 و CD34 كالأمهات البديلات عزل خلايا بطانية من الأنسجة الدهنية البشرية11،،من1213. عادة، يتم العزل استخدام اثنين من الخطوات المتسلسلة وتشكيله إيجابية باستخدام الخرز المغناطيسي. واستخدمت في هذا التقرير، إيمونوسيباريشن استخدام CD34 + الخرز المغناطيسي جنبا إلى جنب مع الخرز البلاستيك CD31. وجدنا هذا الأسلوب متفوقة على إيمونوسيباريشن المغناطيسي متسلسلة فيما يتعلق بالحفاظ على مورفولوجيا غشائي حصاة كبيرة نموذجية. أيضا، كنا قادرين على توليد ما يكفي من خلايا المطلوبة لتحريض التوسع وأديبوجينيك بدءاً من أقل من 1-2 غرام الدهون. خزعة عينة صغيرة من الدهون تحت الجلد ما يكفي لإنتاج الكمية المطلوبة من الخلايا للتطبيقات المتلقين للمعلومات. هذا الجانب يحتمل أن تكون هامة، لا سيما إذا كان هذا الأسلوب سوف تستخدم للكشف عن استجابة لتحريض أديبوجينيك في البشر.

خلافا لأنظمة أخرى ذكرت في الأدبيات، يستخدم هذا الأسلوب فقط هما مكونان لتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + الخلايا: مؤثر PPARγ – روزيغليتازون – والإنسولين البشري. الأهم من ذلك، كمية الأنسولين المستخدمة يقع ضمن النطاق العادي/عالية لتعميم بوستابسوربتيفي الأنسولين في البشر14. درجة القدرة على الاستجابة للأنسولين من الخلايا في المختبر، تقاس الفسفرة Akt، ترتبط بمدى قدرتها على الاستجابة لتحريض كوكتيل. من المثير للاهتمام، استخدام هذه الشروط التعريفي كوكتيل والتجريبية، مزيج خلايا البيضاء والبيج/براون تم الحصول عليها كما تحدد حجم وعدد قطرات داخل الخلايا الدهنية والتعبير عن المؤشرات الجزيئية. يسمح هذا البروتوكول تعريفية بسيطة وفعالة من حيث التكلفة إلى جانب التقييم الكمي للنمط الظاهري لخلايا المستجيب (الأبيض مقابل بيج) لفحص العوامل التي يمكن أن يحتمل أن يغير موازين متباينة بيج : الأبيض adipocytes.

كما يوفر هذا الأسلوب نهجاً متعدية لفهم الآليات الكامنة أديبوجينيسيس فروعه غشائي الأوعية الدموية في الأنسجة الدهنية للإنسان. باستخدام هذه التقنية المحددة العزلة/التمايز، يمكن استجواب المحققين المسارات المختلفة المسؤولة عن أديبوجينيسيس في مجموعة فرعية خلايا البطانية الوعائية من شتى مخازن الدهون في البشر الهزيل والسمنة المفرطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت "لجنة استعراض المجلس المؤسسية" في مدرسة الطب في فيرجينيا الشرقية بالأبحاث وجمع عينات الأنسجة الدهنية البشرية المستخدمة في هذه الدراسة. وجمعت من المرضى موافقة خطية مستنيرة.

1-إعداد المخازن المؤقتة، ووسائط الإعلام، والصكوك

  1. إعداد حل Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (كربس): 135 ملم كلوريد الصوديوم، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، سلفات المغنيزيوم 1 مم، 0.4 مم بوتاسيوم فوسفات مائي، الجلوكوز 5.5 ملم، الادينوسين 1 مم، مزيج المضادات الحيوية/فطري 0.01 ٪ (50 ميكروغرام/مل من البنسلين، 50 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 30 ميكروغرام/مل من الجنتاميسين، 15 نانوغرام/مليلتر من الامفوتريسين) و 10 ملم حبيس (pH = 7.4). هذا الحل هو أعدت طازجة كل الوقت لجمع الأنسجة والهضم.
  2. تعد حلاً كولاجيناز طازجة: 1 ملغ/مل كولاجيناز، اكتب 1، في كربس؛ جعل 3 مل/غرام الدهون. قبل الحارة الحل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل هضم الأنسجة.
  3. إعداد المخزن مؤقت عزل الخلايا CD34: 2% مصل بقرى الجنين (FBS) و 1 مم يدتا في المحلول الملحي المعقم مخزنة الفوسفات (PBS).
  4. تعد وسائل الإعلام أديبوجينيسيس: DMEM/F12، 5% FBS، 50 ميكروغرام/مل البنسلين/ستربتوميسين و 1.25 ميليلتر/مل من الأنسولين البشري (5 ميكروغرام/مل أو 144 mU/mL) 0.36 ميليلتر/مل من 2.8 مم روزيقليتازون (1 ميكرومتر).
  5. تحضير حل أسهم س أحمر نفط (أورو) 0.3% (وزن/حجم) بتذويب 0.3 غرام الذهب إلى 100 مل الكحول.

2-الدهنية كسر الأوعية الدموية Stromal العزلة

ملاحظة: شملت الدراسة مجموعة مستعرضة سقيم البدناء النوع 2 السكري (T2D) والمواضيع غير مرضى السكري، الذين تتراوح أعمارهم بين 18 65 عاماً، تشهد جراحات في سينترا الأيض ومركز جراحة فقدان الوزن (المجموعة الطبية سينترا، نورفولك، فرجينيا). وتشمل معايير الاستبعاد أحد أمراض المناعة الذاتية بما في ذلك السكري من النوع 1، الظروف التي تتطلب المعالجة الكابتة للمناعة المزمنة أو الأدوية المضادة للالتهابات، ثيازولينينديونيس، وتعاطي التبغ النشطة، الالتهابات الحادة أو المزمنة أو تاريخاً خبيثة تعامل خلال الأشهر ال 12 الماضية. وعرف أنه بلازما جلوكوز أثناء صوم من 126 ملغ/دل أو أكثر، جلوكوز من 200 mg/dL أو أكثر بعد اختبار تحمل جلوكوز ح 2، أو استخدام الأدوية antidiabetic T2D.

  1. جمع أومينتال البشرية (OM) والأنسجة الدهنية (SC) تحت الجلد (AT) من البشر تمر جراحات.
  2. الاحتفاظ باوم وفي اتفاقية استكهولم في قنينات منفصلة تتضمن "الحل" هانك الملح مخزنة مع 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين في درجة حرارة الغرفة مباشرة بعد استخراج الأنسجة.
  3. عناية تنظيف وإزالة المقاطع تليفية وكوتيريزيد للنسيج باستخدام مقص ممسوح الإيثانول 70% وملاقط عند وصول العينة إلى المختبر بعد استخراج الأنسجة.
  4. وزن الأنسجة الدهنية وقسم تكنولوجيا المعلومات في 5 غ (أو أقل) مختبرين لهضم كولاجيناز.
  5. فرم ناعما 5 غ AT في 5 مل من حل كولاجيناز في قنينة التﻷلؤ في درجة حرارة الغرفة، باستخدام اثنين من أزواج من المقص.
  6. إضافة 10 مل إضافية لحل كولاجيناز للأنسجة مفروم لمجموع 15 مل.
  7. هضم العينات ح 1، في 37 درجة مئوية، في حمام مائي مع الرج المستمر.
  8. قطع بلاغ المحاقن 20 مل لجعل وضع نهاية غير حادة.
  9. قص مربع 9 × 9 سم من شبكة 250 µm ويدفع به في منتصف الطريق في أنبوب 50 مل مخروطية استخدام المحاقن نهاية غير حادة.
  10. صب العينات في محقنة 20 مل نهاية حادة وتصفية من خلال 250 ميكرون النايلون في أنبوب 50 مل المخروطية لفصل adipocytes وخلايا الأوعية الدموية stromal من الأنسجة عسر الهضم.
    ملاحظة: لا تستخدم أكثر من 5 غ ات الواحدة 50 مل الأنبوبة المخروطية، كما سيتم الحصول على انسداد الشبكة نظراً لفائض المواد تليفية عسر الهضم.
  11. تغسل القنينة التﻷلؤ مع 10 مل كربس ومن أجل ذلك من خلال عامل التصفية لجمع الخلايا المتبقية.
  12. احتضان هذه العينات التي تمت تصفيتها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للسماح adipocytes إلى تعويم في الجزء العلوي من الأنبوب وبعض الخلايا والأوعية الدموية stromal ليستقر على الجزء السفلي من الأنبوب.
  13. الاستفادة من حقنه 20 مل و 20 × 6 في إبرة بيبيتينج إزالة طبقة كسر الأوعية الدموية stromal وتحويلها إلى أنبوب مخروطي نظيف 50 مل.
  14. أضف 10 مل كربس وتسمح العينات للجلوس على مقاعد البدلاء لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
  15. كرر الخطوات من 2، 12 – 2.14 مرتين.
    ملاحظة: هذه الخطوات سوف تضمن أنه لا يوجد أي تلوث من خلايا الأوعية الدموية stromal مع adipocytes العائمة.
  16. تبقى كسور الأوعية الدموية stromal من كلا مستودعات على الجليد لمزيد من المعالجة، كما هو موضح في الخطوات التالية.
    ملاحظة: لا تترك الخلايا على الجليد لأكثر من ح 1، كما قد يؤثر على بقاء الخلية. يمكن أن تكون مجمدة فلاش في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل adipocytes أو المستخدمة طازجة للتجارب.

3-عزل خلايا الأنسجة الدهنية بطانية

  1. تدور الكسور الأوعية الدموية stromal (SVF) في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
  2. إزالة العينات من أجهزة الطرد المركزي وعناية من أجل إيقاف المادة طافية؛ تبقى بيليه تحتوي على خلايا صندوق التبرعات الخاص.
  3. بلطف ريسوسبيند الكريات الخلية في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: إذا تمت معالجة أكثر من 5 غ مستودع ات إلى مختبرين متعددة (راجع الخطوة 2، 4)، تجمع الكريات الخلايا معا.
  4. تدور العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
  5. إزالة المادة طافية، ريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وحساب الخلايا.
    ملاحظة: استخدمت عداد تلقائي خلية هنا، لخلية العد. تم الحصول على بقاء الخلية بخلط 12 ميليلتر من تعليق خلية مع 12 ميليلتر محلول يوديد propidium البرتقالي/(AO/PI) أكريديني (انظر الجدول للمواد). متوسط عدد الخلايا في الغرام ات لكل مستودع: (أ) "مستودع أوم": 1.69 بوصة × 105 ± 4.51 x 104؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.24 س ± 6، 45 × 105 104. كان بقاء الخلايا من كلا مستودعات > 90%.
  6. بيليه العينات من 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: بروتوكول اختيار إيمونوماجنيتيك CD34 (انظر الجدول للمواد) تم تكييفها للخطوات 3.7 – 3.15.
  7. ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر CD34 عزلة المخزن المؤقت.
    ملاحظة: عدد خلايا مجموع تتطلب إعادة تعليق وحدات التخزين التالية: (أ) < 2 × 107 الخلايا: ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر؛ (ب) 2 x 108–5 x 108 خلايا: ريسوسبيند بيليه في 1 مل. في خطوات 3.9 – 3.16، وحدات تخزين الكواشف المستخدمة تم تقليصها < 2 × 107 الخلايا.
  8. إضافة 10 ميليلتر من CD34 كوكتيل واحتضان العينة لمدة 15 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
  9. إضافة 5 ميليلتر من حبات مغناطيسية واحتضان العينة لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
  10. إضافة 2.5 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت لكل عينة ووضع العينات في المغناطيس، لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
  11. عكس المغناطيس ل 5 ق صب إيقاف المخزن المؤقت العزلة.
  12. إزالة العينات من المغناطيس وكرر الخطوتين 3، 10 و 3.11 x 4.
  13. إزالة الأنبوب من المغناطيس وإضافة 2 مل CD34 عزلة المخزن المؤقت.
  14. بيليه الخلايا في 500 x ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
  15. ريسوسبيند الكريات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت لعزل CD34 وحساب الخلايا.
    ملاحظة: هنا، متوسط عدد الخلايا كل غرام في: (أ) "مستودع أوم": 4.75 × 104 ± 3.36 × 104؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 1.06 × 10 ± 9.53 x 104 3. بروتوكول إيمونوبيد بلاستيك CD31 تم تكييفها للخطوات 3.16 – 3.34 (انظر الجدول للمواد).
  16. بيليه الخلايا عند 500 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند بيليه في 250 ميليلتر من "المخزن المؤقت ب" و 250 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  17. دقة ريسوسبيند الخرز CD31 من فورتيكسينج الأنبوبة.
  18. إضافة 20 ميليلتر من الخرز CD31.
    ملاحظة: بسبب خلية إجمالي حساب > 1 × 106وحدة التخزين تم تقليصها وفقا للإدخال الخاص بالشركة المصنعة.
  19. احتضان العينة مع هزاز مدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  20. إرفاق مصفاة لأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل.
    ملاحظة: يجب أن تكون افتتاح أكبر مصفاة الأعلى.
  21. قبل فصل الخلية، قم بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي حجته المصفاة. تطبيق الخليط التي تم إنشاؤها ضمن الخطوة 3.16 إلى المصفاة.
  22. أغسل المصفاة مع 5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في حركة دائرية لإجمالي حجم 20 مل. توصيل الموصل بأنبوب مخروطي عقيمة 50 مل وإغلاق نظام القفل.
  23. إرفاق المصفاة للموصل. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي على طول الجدار المصفاة. أضف 1 مل من المخزن المؤقت المنشط د على طول الجدار المصفاة. دوامة العينة بلطف واحتضان عليه لمدة 10 دقائق، في درجة حرارة الغرفة.
  24. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي. فصل الخلايا من الخرز من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 10 x.
    ملاحظة: تجنب توليد فقاعات الهواء.
  25. فتح قفل اللوير والسماح بالتدفق في أنبوب 50 مل المخروطية الخلايا المنفصلة. أغسل مصفاة 10 x مع 1 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في كل مرة.
  26. تجاهل موصل ومصفاة والطرد المركزي العينات من 300 x ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 2 مل من "الوسائط" الغير عادية-2 كاملة للثقافة.
    ملاحظة: متوسط عدد الخلايا في الغرام ات عند هذه النقطة: (أ) "مستودع أوم": 5.92 × 103 ± 4.27 × 103؛ (ب) مستودع اتفاقية استكهولم: 4.12 × 10 ± 2.1 × 103 3. صلاحية الخلايا من مستودعات على حد سواء كان أكثر من 90%.

4-تنظيم دورات تعريفية أديبوجينيسيس في خلايا بطانية معزولة

  1. تنمو الخلايا الموجودة في لوحات المعالجة بزراعة الأنسجة 6-جيدا مع الوسائط الغير عادية-2 كاملة في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة. استبدال وسائط الإعلام كل 3 – 4 أيام حتى تصل الخلايا إلى التقاء 80 – 90%.
    ملاحظة: تضاعف السكان ما بين 2-3 أيام.
  2. توسيع نطاق الخلايا بالطلاء لهم على أطباق بيتري 100 مم وتقسيم الخلايا مرة واحدة في 1:3. وفي هذه المرحلة، الخلايا على المرور 2.
  3. عد الخلايا باستخدام خلية تلقائية مكافحة (انظر الجدول للمواد).
  4. خلايا البذور حوالي 100 – 200,000 في لوحات 6-كذلك ضمان آبار المكررة لكل مستودع والثقافة لهم في إكمال وسائط EGM-2 لمدة يومين.
  5. نضح إيقاف أي وسائط النمو واستبدله مع 2 مل من DMEM/F12 مع 5% FBS و 50 ميكروغرام/مل من البنسلين/ستربتوميسين للسيطرة على الخلايا واستبدله مع 2 مل من أديبوجينيسيس وسائل الإعلام (راجع الخطوة 1، 4) لعلاج الخلايا.
  6. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 حاضنة لمدة 13 يوما، الاستعاضة عن وسائل الإعلام كل منهما كل 3 إلى 4 أيام.
    ملاحظة: سوف تبدأ الخلايا تتراكم الدهون بعد 4 أيام علاج.
  7. إجراء أورو والنيل الأحمر تلطيخ وفقا لأساليب نشر15–17.
  8. لعزل الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، قم بإزالة الوسائط من لوحات تعريفية 6-جيدا وغسله مع 1 مل PBS العقيمة.
  9. إضافة 350 ميليلتر من حل ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم جوانيديوم (انظر الجدول للمواد) لكل خير واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 – 10 دقائق.
  10. تتخلص من الخلايا خارج اللوحة مكشطة خلية باستخدام ونقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات في الثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي ومزيد من المعالجة في وقت لاحق.
  11. استخراج مرناً من العينات باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي تكييف البروتوكول (انظر الجدول للمواد).
  12. القيام الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-PCR) لتقييم التعبير الجيني باستخدام المسابر التالية: الاديبونكتين، الأعراف والممارسات الموحدة-1، وسيدة (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: هنا، إجراءات RT-PCR نفذت باستخدام بروتوكول القياسية التالية: تمسخ (95 درجة مئوية؛ 15 s)، الصلب، وملحق (60 درجة مئوية؛ 1 دقيقة) لدورات 40. العينات التي أعرب عنها الجينات مع قيم جT > 35 اعتبرت غير قابلة للكشف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدينا بروتوكول يهدف إلى توفير نهج في المختبر لتحديد إمكانات أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا الأوعية الدموية من مستودعات مختلفة من الأنسجة الدهنية البشرية. ويبين الشكل 1Aرسم تخطيطي انسيابي مبسطة. الخطوة الأولى استخدام تحديد إيجابي CD34 معربا عن الخلايا يؤدي > 95% CD34 + الخلايا في سكان الخلايا المعزولة حديثا (الشكل 1A). الأهم من ذلك، أن هذه العلامة يتم فقدان بعد تستزرع الخلايا لاثنين من الممرات. منذ CD34 علامة شائعة لفر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركز هذه الورقة تقديم منهجية للعزل والتوسع وتحريض أديبوجينيك CD34 + CD31 + خلايا بطانية من مستودعات الحشوي وتحت الجلد من الأنسجة الدهنية البشرية.

وقد تم الإبلاغ عن المنهجيات لعزل خلايا بطانية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة من القوارض أو البشر التي تنطوي أساسا على تقنيات استخدام الأجسام المضادة CD31 أما فلوريسسينتلي المسمى أو بالإضافة إلى حبات مغناطيسية18، 19 , 20 , 21

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون أن نشيد ماركيز بيكي، منسق السريرية في مركز بارياتريك سينترا، لمساعدتها في عملية للمريض الفحص والموافقة. وأيد R15HL114062 إلى Anca دال دوبريان هذا البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
< ص><قوي > معدات كبيرة < / قوي >< / ص >
< ص>خزانة السلامة الحيوية< / ع> < ص>Nuaire< / ص> < ص>nu-425-400< / ص>
< ص>حاضنة ثقافة الخلايا< / ص> <ص>ثيرمو-فيشر العلمي <ص>800 درهم
<ص>حمام مائي < / ص>

Forma Scientific< / p>

2568< / p>

شاكر متبادل< / p>

RT-PCR آلة< / p>

BIO-RAD< / p>

< ص>CFX96-C1000< / ع>
< ص>صندوق الرحلان الكهربائي< / ع> < ص>BIO-RAD< / ع> <ص> ميني بروتين 3 خلية< / ع>
<ص>صندوق ترانسبلوت< / ص > < ص > BIO-RAD < / ص > < ص > خلية صغيرة عبر اللطخة < / ص >
< ص > مزود طاقة الرحلان الكهربائي < / ص >< ص > BIO-RAD < / ص > < ص > PowerPac Basic < / p ><
p > ELISA Reader < / p >< p > الأجهزة الجزيئية < / ص > < p>SpectraMax M5< / p>

Blot Reader< / p>

< ص > ليليو < / ص > < ص > أوديسي < / ص > < ص > بالقرب من الأشعة تحت الحمراء < / ص >
< ص > جهاز طرد مركزي مبرد< / ص > < ص > إيبندورف < / ص >< ص > 5810 ص < / ص
< ص > جهاز طرد مركزي منضدي < / ص > < ص > إيبندورف < / ص > < ص > ميني سبين بلس < / ص >
ص > مجهر الفلورسنت < ص / ص>

Olympus< / p>

BX50< / p>

Inverted Microscope< / p>

Nikon< / p>

TMS< / p>

KRBSS Buffer< p> <

p>HEPES< / p>

Research Products International< / p>

H75030< / p>

< ص>بيكربونات الصوديوم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص >792519< / ص >
< ص > ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > C7902 < / ص >
< ص > فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > P5655 < / ص>
< ص > كبريتات المغنيسيوم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > M2643 < / ص ><
ص > كلوريد الصوديوم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص >746398< / ص >
< ص > فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدرات < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص >< ص > S9638 < / ص >
< ص > البوتاسيوم كلوريد< / ص> < ص>سيجما ألدريتش< / ع> < ص>P9333< / ص>

الجلوكوز< / p>

Acros Organics< / p>

410950010< / p>

Adenosine< / p>

Acros Organics< / p>

164040250< / p>

Bovine Serum Albumin< / p>

GE العلوم الحيوية للرعاية الصحية< / ص>

< ص>SH30574.02< / ص>
< ص>البنسلين / الستربتومايسين< / ص> <ص>ثيرمو فيشر العلمي< / ع> <ص>15070063< ص>
<ص><قوي>هضم الأنسجة< قوي>< ص>
< ب>20 مل حقنة< / ص> <ص>جلوبال ميديكال< / ص> <ص> 67-2020< / ص>
< ص>شبكة نايلون, 250 & مايكرو; م < / ص > < ص > سيفر < / ص > < ص > 03-250 / 50 < / ص >
< ص > إبر السحب < / ص > < ص > بوبر < / ص > < ص > 7934 < / ص >
< ص > مقص دقيق < / ص >< ص > أدوات العلوم الجميلة < / ص > < ص > 14058-11 < / ص
< ص >ملقط الأنسجة< / ص > < ص> جورج تيمان & أمبير Co< / p>

160-20< / p>

كولاجيناز ، النوع الأول < / p>

ورثينجتون الكيمياء الحيوية < / p>

LS004196< / p>

Petri ، 100 مم < / p >

USA العلمي< / p>

5666-4160< / p>

TC المعالجة< / p>

Eppendorf Tubes، 1.5 مل < / ص >

< ص > الولايات المتحدة الأمريكية العلمية < / ص > < ص > 1615-5500 < / ص >
< ص > أنابيب مخروطية ، 15 مل < / ص > < ص > عش علمي < / ص > < ص >601052< / ص >
< ص > أنابيب مخروطية ، 50 مل < / ص >< ص > Nalgene < / p >< p> 3119-0050 < / ص >
< p > قوارير التلألؤ < / ص> < ص>كيمبل< / ع> < ب>74505-20< / ص> < ص>تقطيع الأنسجة< / ع>
<ص><قوي>عزل الخلايا< / قوي>< ع>

Cellometer< / p>

Nexcelom< / p>

Auto 2000< / p>

Cellometer Slides< / p>

Nexcelom< / p>

< ص > CHT4-SD100-002 < / ص >
< ص > عداد الجلوس البقعة < / ص > < ص > Nexcelom < / p > < ص > CS2-0106-5 مل < / ص > < ص > أكريدين برتقالي / دعامة اليديوم اليود < / ص >
< ص > الخرز المغناطيسي المضاد ل CD34 < / ص > < ص > تقنيات الخلايا الجذعية < / ص > < ص > 18056 < / ص > < ص > كيت < / ص >
< ص > EasySep المغناطيس < / ص > < ص >تقنيات الخلايا الجذعية < / ص > < ص > 18000 < / ص >
< ص> الخرز البلاستيكي المضاد للسي دي 31 < / ص > < ص > pluriحدد الولايات المتحدة الأمريكية < / ص >< > 19-03100-10 < / ص >
< ص > pluriحدد 10x Wash Buffer < / p >

pluriSelect USA< / p>

60-00080-10< / p>

pluriSelect حلقة الموصل

pluriحدد الولايات المتحدة الأمريكية

41-50000-03

pluriحدد المخزن المؤقت للفصل

pluriحدد الولايات المتحدة الأمريكية

60-00046-12

pluriSelect Incubation Buffer

pluriSelect USA

60-00060-12

pluriSelect S Cell Sfilter< / p>

pluriSelect USA< / p>

43-50030-03< / p>

< قوي>ثقافة الخلايا< / قوي >< / p>

6-well Plates< / p>

USA Scientific< / p>

CC7682-7506< / p>

TC المعالجة< / p>

4- شرائح ذات غرفة جيدة < / ص >

< ص > كورنينج لعلوم الحياة < / ص > < ص >354559< / ص > < ص > فيبرونيكتين مطلي < / ص >
< ص > 4 شرائح بئر < / ص > < ص > ثيرمو-فيشر العلمي < / ص >< > 154526PK < / p > < ص > زجاج غير مطلي < / ص >
< ص > الخلايا البطانية الدموية الدقيقة البشرية الدهنية (HAMVEC) < / ص> <ص>مختبرات أبحاث ساينسل< / ص> <ص>7200< / ص> <ص>خط الخلايا الأولية< / ص>
<ص>وسائط الخلايا البطانية (ECM)< / ص> <ص>مختبرات أبحاث الخلية العلمية< / ص> <ص>1001< / ص> <ص>مجموعة كاملة< / ع>

DMEM / F12 الوسائط القاعدية< / ص>

<ص>ثيرمو فيشر العلمي <ص>11320082< ص>
<ص>مصل الأبقار الجنيني (FBS)< / ص> <ص>روكي ماونتن بيولوجيكس <ص>FBS-BBT
<ص>الأنسولين <ص>ليلي <ب>U-100 <ص>هومالوج
<ص>روزيجليتازون <ص>سيجما ألدريتش < ص > R2408 < / ص >
< ص >< قوي > تحليل الخلية < / قوي >< / ص >
< ص > زيت أحمر O صبغ < / ص >< ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > O0625 < / ص > < ص> محضر في الأيزوبروبانول < / ص >
< ص > 96 ألواح البئر < / ص > < ص >الولايات المتحدة الأمريكية العلمية < / ص > < ص>1837-9600 < / ص >
< ص > 96 ألواح PCR جيدا < / ص > < ص > جينيسي العلمي < / ص > < ص > 24-300 < / ص >
< ص >استخراج الحمض النووي الريبي < / ص >< ص > Zymo Research < / p > < p >R2072 < / p >

Kit < / p >

cDNA Synthesis < / p>

< p>BIO-RAD< / p> < ص >1708841< / ص > < ص > Supermix < / p >
< p > JumpStart PCR Polymerase< / p > < p> Sigma-Aldrich < / p >< p>D9307-250UN< / p> < p> بداية ساخنة ، مع PCR Buffer N < / p
> < p> محلول كلوريد المغنيسيوم < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > M8787-5ML < / p > < ص > 3 ملي مولار نهائي في تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل < / ص >
< ص > dNTPs < / ص > < ص > Promega < / ص >< ص > U1515 < / ص >
< ص > TaqMan AdipoQ < / ص > < ص > ثيرموفيشر العلمي < / ص > < ص >Hs00605917_m1<
< ص > TaqMan CIDEA < / ص > < ص > ثيرمو-فيشر العلمي < / ص > < ص>Hs00154455_m1< / ص >
< ص >TaqMan RPL27 < / ص > < ص > ثيرمو فيشر العلمي < / ص > < ص >Hs03044961_g1< / ص >
< ص > TaqMan UCP1 < / ص > < ص > ثيرمو-فيشر العلمي < / ص > < ص >Hs00222453_m1< / ص >
< ص > BCA Assay < / p > < p> Sigma-Aldrich < / p> < p>QPBCA-1KT < / p> < ص>كيت< / ع>
< ب> ثنائي أكريلاميد < / ص > < ص > بيو راد < / ص > < ص >1610146< / ص > < ص > 40٪ محلول مخزون < / ص >
< ص > بيرسلفات الأمونيوم < / ص > < ص > BIO-RAD< / ص > < ص > 1610700 < / ص >
< ص >TEMED< / ص > < ص > BIO-RAD< / ص > < ص>1610800 < / ص >
< ص > تريس < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > T1503 < / ص >
< ص > جلايسين < / ص > < ص > BIO-RAD< / p>

1610718< / p>

كبريتات الصوديوم العشري < / p>

Sigma-Aldrich< / p>

L3771< / p> <

p>EDTA< / ص > < ص > فيشر العلمية < / ص > < ص > S311-100 < / ص >
< ص > بروموفينول أزرق < / ص > < ص > سيجما ألدريتش < / ص > < ص > B8026 < / p >
< p > Blot Membrane < / p > < p > EMD Millipore < / p > < p >IPFL00010< / p >
p > الميثانول < / ص > < ص > فيشر Scientific< / ص > < ص >A452-SK4 < / ص >
< ص > أوديسي حجب المخزن المؤقت ، تريس < / ص > < ص > ليثيوم COR< / ص > < > 927-50000 < / ص
< ص> الأجسام المضادة المضادة ل AKT < / p > < p > تقنية إشارات الخلية < / p > < p > 2920S < / p > < p > فأر أحادي النسيلة < / ص
> < p> الأجسام المضادة المضادة ل pAKT < / p> < p> تقنية إشارات الخلية< / p>

9271S< / p>

الأرنب متعدد النسيلة < / p>

الأجسام المضادة ل UCP1 < / p >

Abcam< / p>

ص<> أب10983 < / ص > < ص> الأرنب متعدد النسيلة < / ص
> < ص> الأجسام المضادة IgG المضادة للفأر< / ع> < ص> ليلي-كور< / ص> < ص>926-68070 < ص> الماعز متعدد النسيلة ، IRDye 680RD < / p >
< p> الأجسام المضادة IgG المضادة للأرانب < / ص > < p>LI-COR< / p> < p>926-32211 < / p > < p> "الماعز متعدد النسيلة ، IRDye 800CW < / p >

الأجسام المضادة IgG المضادة للأرانب < / ص >

< ص > جاكسون للأبحاث المناعية < / ص > < ص > 111-025-003 < / ص > < ص > الماعز متعدد النسيلة ، TRITC< / p>

محلول ملحي للفوسفات < / p>

Thermo-Fisher Scientific< / p>

10010049< / p>

37٪ محلول الفورمالديهايد < / p>

علوم المجهر الإلكتروني< / p>

15686 < / p> <

p>4٪ محلول لتثبيت الخلية< / p>

مصل الماعز العادي< / p>

< ص>مختبرات ناقلات< / ص> < ص> S-1000< / ص> < ص>10٪ محلول حجب < / ص>
<ص>تريتون X-100< / ص> <ص>سيجما ألدريتش< / ص> < ص>X-100< / ص> <ص>0. محلول نفاذية 1٪ < / ص >
< ص > دابي < / ص > < ص > ثيرمو فيشر العلمي < / ص > < ص > D1306 < / ص>
< ص>الكالسين AM< / p>

Thermo-Fisher Scientific< / p>

65-0853-39< / p>

Cell fluorescent Visualization< / p>

Matrigel Basement Membrane Matrix< / p>

Corning Life Sciences< / p>

356231< p> <

p> عامل النمو المخفض< / p>

DiI المسمى أستيل LDL< / p>

Thermo-Fisher Scientific< / p>

L3484< / p>

> < > / ص > < >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tang, W., et al. White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature. Science. 322 (5901), 583-586 (2008).
  2. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration. Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).
  3. Min, S. Y., et al. Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice. Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).
  4. Gupta, R. K., et al. Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells. Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).
  5. Tran, K. V., et al. The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells. Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).
  6. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  7. Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
  8. Macotela, Y., et al. Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots. Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).
  9. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).
  10. Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).
  11. Villaret, A., et al. Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence. Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).
  12. Miranville, A., et al. Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).
  13. Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells. Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).
  14. Moller, D. E., Flier, J. S. Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications. The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes. The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).
  17. Satish, L., et al. Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage. BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).
  18. Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis. The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).
  19. Burridge, K. A., Friedman, M. H. Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).
  20. Paruchuri, S., et al. Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2. Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).
  21. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).
  22. Hewett, P. W., Murray, J. C. Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization. Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).
  23. Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue. In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).
  24. Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).
  25. Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC). Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).
  26. Zhou, L., et al. In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis. PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).
  27. Curat, C. A., et al. From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes. Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).
  28. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).
  29. Traktuev, D. O., et al. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks. Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).
  30. Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis. Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).
  31. Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue. Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).
  32. Ong, W. K., et al. Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots. Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).
  33. Ong, W. K., Sugii, S. Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).
  34. Tchkonia, T., et al. Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots. American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).
  35. van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation. Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Oil Red O EGM2

مقالات ذات صلة