تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Rosi Fassler; Nufar Edinger; Oded Rimon; Dana Reichmann

doi:10.3791/57806

مقالة منهجية

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

DOI:

10.3791/57806

⸱

يونيو 7, 2018

Rosi Fassler^*¹ , Nufar Edinger^*¹ , Oded Rimon¹ , Dana Reichmann¹

¹Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram, The Hebrew University of Jerusalem

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واحد من شروط الضغط الأكثر تحديا التي تواجهها الكائنات الحية خلال حياتهم ينطوي على التراكم للتأكسد. خلال الأكسدة، خلايا تعتمد بشدة على مرافقين الجزيئية. نقدم هنا، الأساليب المستخدمة في التحقيق ينظم الأكسدة التجميع المضادة النشاط، وكذلك فيما يتعلق برصد التغيرات الهيكلية التي تنظم وظيفة وصي باستخدام HDX--مرض التصلب العصبي المتعدد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكائنات الحية بانتظام بحاجة إلى التكيف مع البيئات المتغيرة خلال دورة حياتها، بما في ذلك التغيرات في درجة الحرارة ودرجة الحموضة، التراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية، وأكثر. هذه التقلبات يمكن أن يؤدي لبروتين على نطاق واسع التي تتكشف، التجميع، وموت الخلية. ولذلك، تطورت الخلايا شبكة دينامية والإجهاد على حدة من مرافقين الجزيئية، التي تحافظ على البروتين "بصحة جيدة" خلال ظروف الإجهاد. المحرمين ATP مستقلة تشكل فئة رئيسية واحدة من مرافقين الجزيئية، التي تخدم كجزيئات الدفاع السطر الأول، حماية ضد تجميع البروتين بطريقة تعتمد على الإجهاد. هذه مرافقين تشترك في سمة واحدة هي قدرتها على الاستفادة من اللدونة الهيكلية للتنشيط الخاصة بالإجهاد، والاعتراف بها، والإفراج عن العميل تجمعات.

في هذه الورقة، ونحن نركز على تحليل واحد وصي اضطرابه جوهريا هذه، Hsp33 ينظم الأكسدة البكتيرية، التي تحمي البروتينات ضد التجميع خلال الأكسدة الوظيفية والهيكلية. هنا، نحن نقدم مجموعة أدوات تقنيات متنوعة لدراسة النشاط ينظم الأكسدة وصي، فضلا عن تعيين التغييرات conformational من الوصيفة، الكامنة وراء نشاطها. على وجه التحديد، يمكننا وصف سير عمل الذي يشمل الإعداد البروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما، يليها تحليل وصي التجميع لمكافحة النشاط في المختبر باستخدام تشتت الضوء، مع التركيز على الدرجة التجميع لمكافحة نشاط وحركية لها. للتغلب على كثرة القيم المتطرفة المتراكمة خلال فحوصات التجميع، يصف لنا استخدام كفيتس، أداة رسومية رواية التي تتيح معالجة سهلة للقياسات الحركية. يمكن بسهولة تطبيق هذه الأداة إلى أنواع أخرى من المقاييس الحركية لإزالة القيم المتطرفة والمناسب معلمات الحركية. لربط الدالة مع هيكل البروتين، يصف لنا بالإعداد وسير عمل تقنية الهيكلية الكتلي، الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي، التي تسمح برسم خرائط للتغيرات كونفورماشونال على الوصيفة و الركيزة خلال مراحل مختلفة من النشاط Hsp33. يمكن تطبيق نفس المنهجية لتفاعلات البروتين البروتين والبروتين-يجند أخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيراً ما تواجه الخلايا تراكم للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) أنتجت كمشتقات التنفس¹^،²، والبروتين والدهن الأكسدة³^،⁴عمليات إضافية⁵^، ⁶^،⁷. على الرغم من روس بدور مفيد في العمليات البيولوجية المتنوعة مثل الخلوية مما يشير إلى⁸^،⁹ والاستجابة المناعية¹⁰، اختلالاً في التوازن بين إنتاج روس وعن إزالة السموم قد تحدث، مما يؤدي إلى الأكسدة نشدد على⁷. البيولوجية وتستهد....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد بروتينات مخفضة تماما والمؤكسدة تماما

إعداد البروتين الكامل مخفضة
ملاحظة: هنا، يمكننا وصف الحد من البروتينات التي تحتوي على الزنك، واستخدام زنكل₂ الحل لاستعادة حالة البروتين أدرج الزنك، وانخفاض. يمكن الاستعاضة عن حل₂ زنكل أو إهمالها. ملاحظة أن الوقت ودرجة الحرارة في عملية الحد من يعتمد على الاستقرار البروتين ووظيفة، ومن ثم محددة كل البروتين.
1. إذابة العينة البروتين على الجليد وأنها تدور وصولاً إلى إزالة الركام. احتضان العينة على الأقل 1.5 ح في 37 درجة مئوية مع 5 مم DTT و 20 ميكرومتر زنكل₂(تصل إلى 70% من تركيز البروتين).
  ملاحظة: أن درجة الحرارة في هذه الخطوة تعتمد على البروتين وينبغي تعدي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أسلوبي عرض تجعل من الممكن لمتابعة النشاط الحركي وديناميات تفاعلات البروتين بين كوصي وعلى الركازة. وعلاوة على ذلك، يسمح بروتوكول الحد من أكسدة إعداد كوصي انخفاض تماما والمؤكسدة تماما، إعطاء فهم أكثر عمقاً لتفعيل إليه من مرافقين اضطرابه تعتمد على الأكسدة والاختزال.

أولاً، كنا تشتت الضوء من أجل دراسة نشاط تعتمد على الأكسدة والاختزال والوصيفة. أجرى على بروتين CS التشويه والتحريف كيميائيا وحراريا حضور المؤكسدة (نشطة) تشتت الضوء أو تخ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، قدمنا البروتوكولات لتحليل النشاط وصي تعتمد على الأكسدة والاختزال وتوصيف التغيرات الهيكلية على ربط بروتين العميل. هذه منهجيات متكاملة لتحديد المجمعات وصي-الركيزة المحتملة وتحليل مواقع التفاعل المحتملة.

هنا، قمنا بتطبيق هذه البروتوكولات لتحديد خصائص معقدة بين وصي ينظم الأكسدة Hsp33 مع الركازة وصي مدروسة CS. قدمنا نوعين مختلفين من البروتين تجميع التحليلات التي تختلف في حالتها الحركية والأولية: خلال تمسخ كيميائية، يبدأ الركيزة عمليتها الجارية من خلال نموذج التشويه والتحريف، بينما خل.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ممتن رادزينسكي ميتال لبلدها مناقشات مفيدة والحرج من قراءة المقالة، وباتريك غريفين وله أعضاء مختبر لمساعداتها غير محدود أثناء تأسيس منصة تحليل HDX. الكتاب ممتنون للمؤسسة الألمانية لإسرائيل (I-2332-1149.9/2012)، ومؤسسة العلوم ثنائية (2015056)، منح التكامل ماري كوري (618806)، "المؤسسة" للعلوم في إسرائيل (1765/13 و 2629/16)، و "علم الحدود البشرية" برنامج (CDA00064/2014) لتقديم الدعم المالي.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي > المواد الكيميائية والكواشف < / قوي >
الأسيتونيتريل HPLC بالإضافة إلى	سيجما ألدريتش	34998-2.5	لتر المذيبات
حمض الفورميك أوبتيما LC / MS	فيشر كيماويات	A117-50	مكمل المذيبات
كحول الأيزوبروبيل ، HPLC الصف	فيشر كيماويات	P750717	المذيبات
الميثانول	فيشر للكيماويات	A456-212	المذيبات
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان	سيجما ألدريتش	252859	عازلة
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك	سيجما ألدريتش	76-05-1	مذيب
ماء ل HPLC	سيجما ألدريتش	270733-2.5L-M	مذيب
ZnCl2 ، كلوريد الزنك	ميرك	B0755416 308	كاشف
DTT	goldbio	27565-41-9	عامل اختزال
PD مصيدة صغيرة G-25 أعمدة GE للرعاية الصحية	GE الرعاية الصحية GE الرعاية الصحية	29-9180-07	عمود تحلية
المياه فوسفات البوتاسيوم	الكيمياء الحيوية الأمريكية	20274	عازلة
بيروكسيد الهيدروجين 30٪	Merck	K46809910526	عامل مؤكسد
سيترات	سيجما ألدريتش	C3260	الركيزة
HEPES خال من الأحماض	سيجما ألدريتش	7365-45-9	عازلة
Gndcl	سيجما ألدريتش	G3272-500G	ممسخ
محلول كلوريد الديوتيريوم	سيجما ألدريتش	543047-10G	عازلة
أكسيد الديوتيريوم 99٪	سيجما ألدريتش	151882-100G	مذيب
TCEP	bioworld	42000058-2	عامل
اختزال150uL Micro-Insert مع مغزل داخلي و أقدام بوليمر ، 29 * 5 مم	La-Pha-Pack - Thermo Fischer Scientific
1.5 مل قارورة خيط قصير شفاف 9 مم ، 11.6 * 32 مم	La-Pha-Pack - Thermo Fischer Scientific
كوفيتز	كوفيت هيلما 101-QS
< قوي > أدوات < / قوي >
جاسكو FP-8500 مقياس الطيف الفلوري	جاسكو
Thermomixer Comfort	Eppendorf	13058/0
Heraeus Megafuge 16R ، أعلى مقاعد البدلاءجهاز الطرد المركزي	مقياس
الحراري ، PB-11 sartorius	Sartorius	13119/0
AffiPro عمود بيبسين ثابت (طول 20 مم ، قطر 2.0 مم).	المسبق AffiPro
Waters (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 & Aring ؛ 1.7um ، 2.1mmx5mm)	العمود التحليلي Waters
C18 (عمود ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 ، 130 Å ؛ 1.7um ، 2.1mmx50mm)
غرفة الفينيل اللاهوائية مع باب غرفة معادلة الضغط	COY
Q-exactive-orbitrap مطياف الكتلة	Thermo-Fischer نظام PAL العلمي
LHX - نظام آلي للتعامل مع عينات HDX	نظام PAL	https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000 ، مضخة XRS	مضخة مساعدة حرارية علمية
Dionex AXP-MS	الحرارية العلمية
< قوية > البرمجيات ، أدوات البرمجيات ، البحث في قاعدة البيانات < / قوي>
Kfits: بيانات تجميع تناسب	http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
برنامج Thermo Scientific Xcalibur	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune)	https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
برنامج Chronos (Axel Semrau)	http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
برنامج Proteome Discoverer V1.4	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
برنامج منضدة HDX	http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html

شركة سينسيز الأس الهيدروجيني العلمي العمود

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. <....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Hsp33 Kfits

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة