مقالة منهجية

نهجاً الطفرات تشبع رواية: وصف خطوة مفردة بروتين تنظيمي ملزم مواقع في الجيش الملكي النيبالي باستخدام فوسفوروثيواتيس

DOI:

10.3791/57816

⸱

أغسطس 21, 2018

1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado at Boulder

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتينات التي تربط تسلسل معين من الحمض النووي الريبي تلعب أدواراً حاسمة في التعبير الجيني. وصف مفصل لمواقع الربط هذه الأهمية الحاسمة لفهمنا لتنظيم الجينات. ويرد هنا، اتباع نهج خطوة واحدة للطفرات تشبع مواقع ربط البروتين في الجيش الملكي النيبالي. وهذا النهج ذات الصلة لجميع مواقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في التنمية. ربط العديد الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات على تسلسلات الهدف مع خصوصية عالية للتحكم في التعبير الجيني. هذه البروتينات التنظيمية التحكم في التعبير الجيني أما على مستوى الحمض النووي (النسخ) أو على مستوى الحمض النووي الريبي (الربط مرناً قبل بوليادينيليشن، ومرناً، والانحلال والنقل والترجمة). تحديد تسلسل تنظيمي يساعد على فهم ليس فقط كيف يتم تبديل جين أو إيقاف تشغيله، ولكن أيضا الجينات المصب التي ينظمها بروتين تنظيمية خاصة. وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظيم الجينات يلعب دوراً هاما في مجال البيولوجيا. الجينات يمكن أن تنظم على مستوى النسخ، مرناً قبل الربط، 3 ' تشكيل نهاية، تصدير الجيش الملكي النيبالي، والترجمة، التعريب مرناً، تسوس، بوستترانسلاشونال التعديل/الاستقرار، إلخ كلا البروتينات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الملزمة تلعب أدواراً رئيسية في الجينات التنظيم. بينما حددت التحليلات الجينية الجزيئية البروتينات التنظيمية العديدة، اتسمت فقط مجموعة فرعية صغيرة من لهم تماما للوظائف الخلوية أو ربط المواقع في فيفو. تحليل تسلسل النشوء والتطور والطفرات نقدم نهج تكميلية لوصف التفاعلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي البروتين.

الجيش الملكي النيبالي ملزم البروتينات هامة في العمليات الإنمائية، بما في ذلك التمييز الجنسي. البروتين المورفولوجية الجنس الفتاكة (SXL) أو البروتين الرئيسي تبديل الجنس غائبا في الذكور، ولكن الوقت الحالي في الإناث. أنه يعترف بتسلسل الغنية uridine أو بيريميدين-مساحات المتاخمة لمواقع الوصلة المحددة في أهداف مرناً قبل المصب (المحولاتو الجنس الفتاكة، و lethal2 الخاصة بالذكور) في الخلايا الجسدية1،2 ،،من34. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه ينظم الموقع بوليادينيليشن التبديل بواسطة الربط إلى تسلسل محسن بوليادينيليشن الغنية أردين في5،نص محسن من بدائية (e(r))6. SXL المحتمل ينظم أهداف إضافية في germline الإناث التي لا يزال يتعين تحديد1،،من78،،من910،11، 12 , 13.

عادة، يشمل توصيف موقع الربط الطفرات، على سبيل المثال، بحذف أو استبدال واحد أو متعددة النيوكليوتيدات. كل موقع ملزم المسخ، بالنسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي البرية من نوع، ثم يتم تحليل استخدام سلسلة من تركيزات البروتين لتحديد ما تقارب ملزم (الانفصالكد أو التوازن المستمر) لبروتين الاهتمام؛ كد هو تركيز البروتين اللازم للحصول على ربط الحمض النووي الريبي 50%. تتضمن هذه العملية ذات العمالة الكثيفة للطفرات مفصلة توليد وتحليل لطفرات عديدة – ثلاثة النيوكليوتيدات-نوع البرية لكل وظيفة في موقع الربط. وبالتالي، هناك حاجة إلى نهج بديل للطفرات تشبع أسرع وأبسط، وغير مكلفة لمواقع ربط بروتين في الجيش الملكي النيبالي.

وهنا يصف لنا اتباع نهج خطوة واحدة يتيح الطفرات التشبع من موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي. أنها تنطوي على تعاطي المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات غير-نوع البرية داخل الموقع ملزم، توليف للكشف منفصلة مع كل من النوكليوتيدات فوسفوروثيواتي، وعزله في كسر ملزمة بعد الحضانة مع البروتين. تدخل من نوع البرية غير النيوكليوتيدات النتائج في استبعادهم تفضيلية من الكسر البروتين زمنياً. ويرصد هذا التفريد جل عقب انشقاق الكيميائية انتقائية مع اليود سندات فوسفوديستير التي تحتوي على فوسفوروثيواتيس (الطفرات فوسفوروثيواتي أو PTM). يعتبر هذا الأسلوب الطفرات تشبع خطوة واحدة تنطبق على وصف أي موقع ملزمة البروتين في الجيش الملكي النيبالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: الشكل 1 يوفر لمحة عامة عن الطفرات فوسفوروثيواتي ويوجز الخطوات الرئيسية في هذه العملية.

1-إنشاء مكتبة لطفرات – المنشطات قالب الحمض النووي مع النيوكليوتيدات-نوع البرية

  1. توليف T7 التمهيدي (-جتاتاكجاكتكاكتاتاج 5 '-3') بالتوليف الكيميائي على المزج الحمض النووي.
  2. توليف اليغنوكليوتيد مخدر (حبلا التكميلية) بالتوليف الكيميائي على المزج الحمض النووي المقابلة للموقع ملزمة البروتين. استخدام مزيج مناسب من فوسفوراميديتيس خلال التوليف الكيميائي لكل موقع من المنشطات (العاشر أدناه) بنسبة 90% A النوكليوتيدات البرية من نوع و 10% T النوكليوتيدات-نوع البرية (انظر نتائج تمثيلية لمزيد من التفاصيل حول هذه النسبة).
    ملاحظة: هنا، هو تسلسل اليغنوكليوتيد مخدر CC 5 '--جتكاكتاكاكتكسجأكساكساكساكسكاكسككساكساكسجكستجكتاتاجتجاجتكجتاتاك-3'. التسلسل المسطر هو تكملة عكس SXL البروتين ملزمة الموقع، بالإضافة إلى النيوكليوتيدات إضافية خارج الموقع الملزمة التي توفر عناصر مفيدة تؤكد أن ليس كل تغيير في الجيش الملكي النيبالي يؤثر ملزمة، كما يتم تحميل عناصر التحكم مقارنة وتطبيع النيوكليوتيدات داخل الموقع ملزم. تسلسل الموقع ملزم SXL أوووووجووجوووووووو، وموجودة في محول مرناً قبل14،15،،من1617، استخدمت لوضع المنهجية المقترحة. تسلسل بالخط المائل هو مكملة لتسلسل التمهيدي T7 والمروج T7 للنسخ في المختبر .

2-تجميع الجيش الملكي النيبالي

  1. توليف الحمض النووي الريبي في رد فعل نسخ 20 ميليلتر، كما هو موضح سابقا18.
    1. المخزن المؤقت للنسخ T7 ميكس و 1 ميكرومتر T7 اليغنوكليوتيد، 1 ميكرومتر يخدر اليغنوكليوتيد، ديثيوثريتول 10 ملم (DTT)، 2 مم غتب، 1 مم ATP الأداء النظري المركب، و UTP (جانسين، أدينوسين، سيتيديني، واردين ثلاثي) و 2 يو/ميليلتر T7 رنا بوليميراز.
    2. إضافة، في اثنين ميكروسينتريفوجي منفصلة أنابيب، الايثير ATP أو مم 0.05 α α-الايثير مم 0.167 UTP لإدماج الكشف فوسفوروثيواتيس (انظر الخطط في الشكل 2).
      ملاحظة: لبروتوكولات بديلة، إضافة 0.2 مم α-الايثير CTP أو 0.2 مم α-الايثير أنشئ لفعل نسخ مناسبة التي تحتوي على اليغنوكليوتيد مخدر لاختبار بدائل النوكليوتيدات المتبقيين.
    3. احتضان الخليط رد فعل توليف الحمض النووي الريبي ح 2 في 37 درجة مئوية.
  2. إضافة 2.5 ميليلتر الحرارة مجا الفوسفاتيز القلوية وميليلتر 2.5 10xphosphatase المخزن المؤقت إلى عينة الجيش الملكي النيبالي. احتضان هذا الرد 25 ميليلتر لمدة 10 – 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة 5 ' الفوسفات.
  3. إلغاء تنشيط إنزيم الفوسفاتيز القلوية بتدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق.
  4. راديولابيل 5 ' نهاية ديفوسفوريلاتيد الحمض النووي الريبي (5 بمولي) باستخدام 1 ميليلتر T4 بولينوكليوتيدي كيناز و 1 ميليلتر γ-32ف ATP في حجم رد فعل 10 ميليلتر. احتضان هذا المزيج رد فعل لمدة 30 – 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إلغاء تنشيط إنزيم كيناز بولينوكليوتيدي T4 بتدفئة في 65 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
  6. هلام تطهير الجيش الملكي النيبالي بالتفريد في 10 ٪ يشوه جل بولياكريلاميدي. تحديد موقع الجيش الملكي النيبالي على الجل أوتوراديوجرافي. المكوس جل الشريحة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي راديولابيليد وسحق في أنبوب ميكروسينتريفوجي بالضغط على الجدران مع تلميح ماصة، ونقع في المخزن المؤقت ك (PK) البروتيناز (100 مم تريس، درجة الحموضة 7.5، 12.5 مم يدتا، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% الصوديوم دوديسيل كبريتات). قم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة من 2 (ح) بين عشية وضحاها.
  7. الطرد المركزي الملاط جل وتجاهل الجل وجمع الحل المخزن المؤقت.
  8. استخراج الحل مرتين مع تساوي حجم الفينول كلوروفورم ومرة مع كلوروفورم وجمع المرحلة مائي.
  9. إضافة إلى أن حجم المرحلة المائية 0.1 م 3 خلات الصوديوم، 5.2 درجة الحموضة، حاملة الحمض الريبي النووي النقال أو الجليكوجين، وحجم 2.5 من الإيثانول. الاحتفاظ العينة في-80 درجة مئوية ح 1.
  10. الطرد المركزي العينة لمدة 5 – 10 دقيقة في ميكروسينتريفوجي سرعة عالية في س 16,873 ز. إزالة الحل المخزن المؤقت/الإيثانول بعناية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي.
  11. أغسل بيليه مع الإيثانول 70% والطرد المركزي على الإيثانول إزالة 2 – 5 دقيقة بعناية. بيليه في الهواء الجاف.
  12. ريسوسبيند بيليه في 20 – 50 ميليلتر إثيل بيروكاربوناتي (ديبك)-المياه المعالجة. تخزين في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات مع الحمض النووي الريبي راديولابيليد استخدام الاحتياطات المناسبة ودرع شبكي للحماية من الإشعاع. في الوقت الحاضر، هي أعمدة الدوران أكثر شيوعاً وأكثر ملاءمة لإزالة الإشعاع الفردية، كبديل لتنقية جل من الجيش الملكي النيبالي.

3-البروتين ملزمة الرد وفصل من الجيش الملكي النيبالي منضم

  1. التعبير عن البروتين المؤتلف في وتنقية من كولاي.
  2. تقدير تركيز البروتين المؤتلف كانت أو فصل في جل الحزب الديمقراطي الصربي-polyacrylamide جوار بروتين معروفة القياسية، والبقر ألبومين مصل (BSA). تمثيل البروتين الفائدة وجيش صرب البوسنة الموحدة تلطيخ الجل مع R-250 "أخذ الزرقاء الرائعة". كوانتيتاتي البروتين بالمقارنة مع كميات معروفة لتخفيف جيش صرب البوسنة على جل نفسه.
    ملاحظة: تخزين البروتين المؤتلف في-80 درجة مئوية وحتى الاستخدام وتمييع في 20 مم 4-(2-هيدروكسيثيل) الببرازين-1-اثانيسولفونيك حامض (حبيس)، الرقم الهيدروجيني 8.0، ديثيوثريتول 1 مم (DTT)، 0.2 مم حمض الإيثيلين (يدتا)، 0.05% NP-40، 20% والغليسيرول. استخدام 0.5 – 1.0 مم فينيلميثاني مثبط البروتياز فلوريد السلفونيل (بمسف) اختياري.
  3. القيام برد فعل ملزم الحمض النووي الريبي (20 – 100 ميليلتر) في 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 1 مم DTT، 50 مم بوكل، 0.5 مثبط رناسي وحدات/ميليلتر، 0.09 ميكروغرام/ميليلتر أسيتيلاتيد ألبومين المصل البقري، 1 مم يدتا، 0.15 ميكروغرام/ميليلتر الحمض الريبي النووي النقال والجيش الملكي النيبالي 5 '-نهاية راديولابيليد ميليلتر 6 التركيز المناسب (أ التركيز الذي يربط ~ 50% من الحمض النووي الريبي للبروتين) من البروتين.
    ملاحظة: يعمل هذا المخزن المؤقت ملزم لثلاثة الحمض النووي الريبي – ملزم البروتينات (SXL، U2AF65، و PTB)، ولكن يجب أن تكون موحدة وتين فائدة. تقدير تركيز البروتين تجريبيا، استخدام تخفيف مختلفة لإعداد بروتين معين، ما هو مطلوب للحصول على ما يقرب من 50 ٪ ملزمة الجيش الملكي النيبالي. ويمثل هذا الشرط أو كد الجزء الأكثر حساسية من المنحنى ملزم الجيش الملكي النيبالي.
  4. تبني رد فعل ملزم البروتين لمدة 20-30 دقيقة عند 25 درجة مئوية (أو على الجليد).
  5. فصل الكسر الحمض النووي الريبي البروتين زمنياً من الكسر غير منضم باستخدام واحد من هذين النهجين:
    1. تصفية النيتروسليلوز ملزمة
      1. تطبيق رد فعل ملزم (20 – 100 ميليلتر) على عامل تصفية النيتروسليلوز متصلاً مشعب فراغ في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: فقط مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين هو الإبقاء على عامل تصفية وغير منضم الحمض النووي الريبي التدفقات من خلال عامل تصفية. نهج ربط عامل تصفية يسمح استرداد أعلى من الجيش الملكي النيبالي المنضم وهو أسرع وأبسط، مقارنة بمقايسة تحول التنقل هلام. عن طريق وضع غشاء دي تحت التصفية النيتروسليلوز من الممكن أيضا جمع الكسر الحمض النووي الريبي غير منضم أو مجاناً الحمض النووي الريبي للمقارنة مع الكسر منضم.
      2. قص جزء تصفية النيتروسليلوز التي تحتوي على يحتفظ الجيش الملكي النيبالي المشعة إلى أجزاء أصغر لتناسب في أنبوب ميكروسينتريفوجي، نقع في كافية من المخزن المؤقت PK (300 – 500 ميليلتر تحتوي على 10 – 20 ميكروغرام PK) أن تزج القطع عامل التصفية، والوت الجيش الملكي النيبالي من عامل التصفية 2 – 3 ح أو بين عشية وضحاها.
      3. استخراج مع الفينول-كلوروفورم، كلوروفورم، وجمع المرحلة مائي. إضافة خلات الصوديوم والإيثانول، وبعد حضانة في الثلاجة، الطرد المركزي، ويغسل، الجافة وريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة ديبك. اتبع الخطوات كما هو مفصل في خطوات 2.10 إلى 2.14 أعلاه.
    2. تحول التنقل هلام
      1. إعداد وبلمره هلام polyacrylamide أصلية 5% (شاهقا Acrylamide:bis-اكريلاميد) في 0.5 x TBE (من المخزن المؤقت تريس-بورات-يدتا القياسية) قبل البدء في رد فعل ملزم، كبديل لأسلوب ربط عامل تصفية.
      2. قبل تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة على 250 الخامس في غرفة باردة (4 درجات مئوية).
      3. تحميل كل رد فعل ملزم (أعلاه) في آبار منفصلة من جل ما قبل التشغيل أعلاه.
        ملاحظة: يوفر المخزن المؤقت تخزين البروتين والغليسيرول كافية لتحميل عينة في الآبار.
      4. فصل الجيش الملكي النيبالي البروتين مرتبط بالتفريد جل في غرفة باردة في 250 الخامس ح 1 إلى 2، تبعاً لحجم الجيش الملكي النيبالي والبروتين محددة.
      5. تحديد موقع مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين على الجل من أوتوراديوجرافي. المكوس جل الشريحة التي تحتوي على مجمع الجيش الملكي النيبالي بالبروتين. الوت الجيش الملكي النيبالي من شريحة هلام بسحق شريحة جل ونقع في المخزن المؤقت لكية.
      6. استخراج مع الفينول-كلوروفورم، كلوروفورم، وجمع المرحلة مائي. إضافة خلات الصوديوم والإيثانول، وبعد حضانة في الثلاجة، الطرد المركزي، يغسل، الهواء الجاف، وريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في المياه المعالجة ديبك. اتبع الخطوات كما هو مفصل في خطوات 2.10 إلى 2.14 أعلاه.

4-تحليل المنتجات فوسفوروثيواتي المشقوق اليود للكشف عن مواقع النوكليوتيدات متحولة

  1. إضافة اليود 1 مم في 20 ميليلتر ديبك معاملة المياه التي تحتوي على يصل إلى 10 ميكروغرام الناقل الحمض الريبي النووي النقال تهزم الكشف (الكشف التام وغير المنضمة) في مواقع فوسفوروثيواتي التأسيس. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: مزيد من التفاصيل عن انشقاق اليود مع ظروف مختلفة قليلاً-إيودوثانول 7% (v/v)، تدفئة في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق — يمكن العثور في غيش & اكستين 198819.
  2. يعجل رنا ملصوق بإضافة خلات الصوديوم/الإيثانول، كما هو موضح أعلاه. ريسوسبيند بصبغة تحميل ليشوه المواد الهلامية. الحرارة وتحميل عينة لفصل الأجزاء رنا بالتفريد في جل polyacrylamide يشوه 15 – 20%.
  3. كشف جل polyacrylamide لأفلام الأشعة سينية.
  4. الكشف عن عصابات في الكسر منضم مقابل مجموع تجمع باستخدام أوتوراديوجرافي.
    ملاحظة: تنفيذ جميع الخطوات مع اليود في غطاء عادم. لفصل الحمض النووي الريبي هو موضح هنا، يعمل جل على شكل آسفين، الذي يتحقق من خلال مضاعفة سمك الفواصل كلا في الجزء السفلي من لوحات جل بإدخال فاصلة إضافية بوصة طويلة في الجزء السفلي من الجل. ويسمح هذا الشكل مزيد من التباعد موحدة أو أوثق بين الأجزاء رنا أقصر. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام فوسفوريماجير بدلاً من أفلام الأشعة السينية للكشف عن وكوانتيتيشن للنشاط الإشعاعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مبدأ الطفرات التشبع باستخدام المنشطات:

لنسبة مولى مناسبة البرية من نوع وغيرها النيوكليوتيدات، استخدم خليط متساو من النيوكليوتيدات الأربعة جميع إلا إذا كان موقف واحد يتم تحليلها. ومع ذلك، إذا كان يتم تحليل مواقف متعددة في نفس الوقت، يجب تعديلها النسبة من نوع غير البرية إلى البرية من نوع النيوكليوتيدات، أي خفض. خلاف ذلك، بالإضافة إلى استبدال واحد، الذي هو المطلوب، كما سيكون هناك قوالب مع متعددة-نوع البرية النيوكليوتيدات في ج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطفرات منذ فترة طويلة تستخدم لوصف مواقع ربط بروتين. أولاً، يمكن تبني سلسلة من طفرات واختبار فردي في ملزمة فحوصات لتحليل آثارها على ملزمة تقارب. بينما يقدم نهجاً الطفرات قياسية طريقة لتحليل عدة سلاسل، خطوات متعددة تشترك في نهج قياسية، مثل تشييد طفرات وأداء سلسلة ملزما ردود الفعل لكل متحولة وشاقة وتستغرق وقتاً طويلاً وقد لا تسمح الطفرات التشبع، خاصة بالنسبة لتسلسل أطول. ثانيا، يمكن أن تكون عشوائية تسلسل والتجمع تستخدم لدورات متعددة للربط وبوليميريز سلسلة ردود الفعل التضخيم (PCR). وسيكون هذه التسلسلات التي تربط البروتين ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلف لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعاهد الوطنية للصحة لتمويل الماضية وذلك بفضل مقدم البلاغ وذلك بفضل مايكل ر الأخضر لتوليف النوكليوتيد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Uridine 5 'a-thio triphosphateNEN (بوسطن, ماساتشوستس)NLP-017
أدينوزين 5' a-thio ثلاثي الفوسفاتNEN (بوسطن, ماساتشوستس)NLP-016
فراغ مشعبفيشر ScientificXX1002500Millipore  25  مم الزجاج التحليل المجهري فراغ تصفية
فراغ مشعبMilliporeXX2702552 1225 أخذ العينات فراغ المشعب
النيتروسليلوزميليبورHAWP
النيتروسليلوزSchleicher & PROTRAN
NEBM0508
T4 بولي النوكليوتيدات كينازNEBM0201S
بروتيناز KNEBP8107S
T7 RNA polymeraseNEBM0251S
RNasinPromegaRNase مثبط
الألواح الزجاجيةالقياسية
معدات الرحلان الكهربائي الهلاميةالقياسيةالقياسية
القياسية
حلول هلام بولي أكريلاميدالقياسية القياسية
طقم إزالة الفوسفور Schuell أفلام الأشعة السينية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schutt, C., Nothiger, R. Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects. Development. 127 (4), 667-677 (2000).
  2. Mahowald, A. P., Wei, G. Sex determination of germ cells in Drosophila. Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).
  3. Steinmann-Zwicky, M. How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm. Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).
  4. Salz, H. K. Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary. Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).
  5. Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline. Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).
  6. Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins. PLoS One. 2 (6), e520(2007).
  7. Samuels, M. E., et al. RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo. Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).
  8. Fujii, S., Amrein, H. Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology. EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).
  9. Kelley, R. L., et al. Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila. Cell. 81 (6), 867-877 (1995).
  10. Hager, J., Cline, T. Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination. Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).
  11. Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B. Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).
  12. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary. Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).
  13. Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).
  14. Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins. Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).
  15. Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal. RNA. 6 (6), 901-911 (2000).
  16. Sakashita, E., Sakamoto, H. Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection. Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).
  17. Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA. EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).
  18. Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase. Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).
  19. Gish, G., Eckstein, F. DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry. Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA T7 DEPC

مقالات ذات صلة