مقالة منهجية

استخدام البروتينات النووية الذاتية من الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج بالانزيم Co-إيمونوبريسيبيتيشن

17.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57836

⸱

أغسطس 2, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 2Singapore Eye Research Institute (SERI), Singapore General Hospital, 3The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, 4Cancer and Stem Cell Biology Program, Duke-NUS Medical School, 5Department of Cell and Molecular Biology, Karolinska Institutet

في هذه المقالة

ملخص

هنا يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co لدراسة البروتين-بروتين التفاعلات بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. هذا الأسلوب مناسبة للمظاهرة للتفاعلات بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك في نقص.

الملخص

مستويات الأوكسجين المنخفضة (نقص) يؤدي إلى مجموعة متنوعة من استجابات التكيف مع عامل نقص إيندوسيبلي 1 (منطقياً-1) معقدة تعمل كمنظم رئيسي. منطقياً-1 تتألف من وحدة فرعية α تنظم الأكسجين هيتيروديميريك (كحلول'-1α) ومؤثراً أعرب عن الوحيدات بيتا (منطقياً-1β) يعرف أيضا باسم أريل هيدروكربون مستقبلات النووية ترانسلوكاتور (ارنت)، تنظيم الجينات المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية ، تكون الكريات الحمر وتحلل. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 مفتاح لفهم نقص إشارات الطريق. إلى جانب تنظيم الاستقرار 1α منطقياً، يؤدي نقص أيضا إزفاء النووية للعديد من عوامل النسخ بما في ذلك 1α سكانية وارنت. جدير بالذكر أن معظم الأساليب الحالية المستخدمة لدراسة هذه التفاعلات البروتين-بروتين (القياسية) تستند إلى نظم حيث يتم زيادة مستويات البروتين مصطنع من خلال أوفيريكسبريشن البروتين. بروتين أوفيريكسبريشن وكثيراً ما يؤدي إلى نتائج غير الفسيولوجية الناجمة عن التحف الزماني والمكاني. هنا يصف لنا co-إيمونوبريسيبيتيشن تعديل البروتوكول بعد علاج نقص استخدام البروتينات النووية الذاتية، و كدليل على المفهوم، لإظهار التفاعل بين 1α سكانية وارنت. في هذا البروتوكول، كانت تحصد الخلايا التاكسج تحت ظروف التاكسج ودولبيكو المخزن المؤقت ليغسل المالحة فوسفاتيبوفيريد (دببس) كان أيضا قبل متوازن لظروف التاكسج قبل الاستخدام للتخفيف من حدة تدهور البروتين أو بروتين معقد الانفصال من خلال ريوكسيجينيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، استخرجت الكسور النووية في وقت لاحق إلى التركيز واستقرار البروتينات النووية الذاتية وتجنب نتائج زائفة ممكن غالباً ما ينظر خلال overexpression البروتين. يمكن استخدام هذا البروتوكول لإظهار التفاعلات الذاتية وأصلي بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج.

المقدمة

نقص يحدث عندما يتم تزويد عدم كفاية الأكسجين إلى الخلايا والأنسجة في الجسم. أنها تلعب دوراً حاسما في مختلف العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل تمايز الخلايا الجذعية، التهاب وسرطان1،2. بمثابة عوامل نقص إيندوسيبلي (التنظيم) heterodimers تتألف من وحدة فرعية α الأكسجين وينظم ووحدة فرعية β أعرب مؤثرا المعروف أيضا ارنت3. وقد حددت isoforms ثلاث مفارز منطقياً-α (منطقياً-1α، 2α سكانية ومنطقياً-3α) وثلاث مفارز منطقياً-β (ارنت/منطقياً-1β و ARNT2 و ARNT3) حتى الآن. هي أعربت 1α سكانية وارنت أوبيكويتوسلي، بينما 2α سكانية ومنطقياً-3α و ARNT2 و ARNT3 وقيدت أكثر أنماط التعبير4. البروتين 1 سكانية معقدة هي الجهة الرئيسية لنقص استجابة. تحت ظروف التاكسج، 1α سكانية يصبح استقرت، ثم translocates إلى النواة وديميريزيس مع ارنت5. في وقت لاحق، هذا المجمع بربط النيوكليوتيدات المحددة المعروفة بنقص استجابة عناصر (HREs) وينظم الجينات المستهدفة المتورطين في عمليات متنوعة بما في ذلك الأوعية، وتكون الكريات الحمر وتحلل6. وبالإضافة إلى هذا الرد "المتعارف عليه"، مسار مما يشير إلى نقص كما هو معروف للحديث المتبادل مع الاستجابة الخلوية متعددة مما يشير إلى مسارات مثل الشق والنووي كابا عامل ب (NF-κB)7،8،9.

تحديد البروتينات المتفاعلة رواية منطقياً-1 مهم لفهم أفضل لنقص إشارات الطريق. على عكس ارنت، وغير مبال بمستويات الأوكسجين وأعرب مؤثرا، محكم ينظم مستويات الأوكسجين الخلوية مستويات البروتين منطقياً-1α. في نورموكسيا (الأكسجين 21%)، البروتينات منطقياً-1α هي سرعة المتدهورة10،11. ويقدم نصف عمر قصيرة منطقياً--1α في نورموكسيا التحديات التقنية المحددة للكشف عن البروتين من مقتطفات الخلية، وكذلك للتعرف على البروتينات منطقياً-1α-التفاعل. وعلاوة على ذلك، ترانسلوكاتي عدة عوامل النسخ بما في ذلك مجمع منطقياً-1 إلى النواة تحت ظروف التاكسج12،،من1314. يتم تنفيذ معظم الأساليب الحالية المستخدمة للدراسات PPI استخدام overexpression غير الفسيولوجية للبروتينات. قد أبلغت هذه overexpression البروتين يسبب تشوهات الخلوية المختلفة من خلال آليات متعددة بما في ذلك الحمل الزائد للموارد واختلال المقايسة والتفاعلات منحل ومسار التعديل15،16. فيما يتعلق بالدراسات PPI، overexpression البروتين يمكن أن يؤدي إلى سلبية إيجابية، أو حتى كاذبة كاذبة، النتائج اعتماداً على خصائص البروتين ووظائف البروتينات أوفيريكسبريسيد. ولذلك، الأساليب الحالية للدراسات PPI تحتاج إلى تعديل كي تكشف القياسية ذات الصلة فسيولوجيا تحت ظروف التاكسج. قد أثبتنا سابقا بالتفاعل بين منطقياً-1 وعامل النسخ الأسرة Ets GA-ملزمة البروتين (جابب) في التاكسج P19 الخلايا، مما يسهم في رد المروج Hes1 على نقص17. هنا، يمكننا وصف بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن co للدراسة القياسية بين البروتينات النووية الذاتية تحت ظروف التاكسج. ويرد كدليل على مفهوم التفاعل بين 1α سكانية وارنت. هذا البروتوكول مناسبة لإثبات أوجه التفاعل بين عوامل النسخ والنسخي المنظمين المشارك تحت ظروف التاكسج، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا المقطع البروتوكول، الذي يستخدم الكلي الجنينية البشرية 293A الخلية (HEK293A)، s يتبع المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية في جامعة نانيانغ التكنولوجية، وسنغافورة.

1-تنظيم دورات تعريفية لنقص في الخلايا HEK293A

  1. إعداد أربعة أطباق 10 سم والبذور 3 – 5 × 106 HEK293A الخلايا الواحدة وطبق في 10 مل دولبيكو لتعديل المتوسطة النسر (دميم، الجلوكوز 4.5 غرام/لتر) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)، 2 مم L-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 110 مغ/لتر والبنسلين يو/مليلتر 100 100 مغ/ ستربتوميسين مل. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 حاضنة.
    ملاحظة: الخلية البذر ينبغي أن يتم في مجلس الوزراء سلامة بيولوجية (BSC). يجب أن تزول أسطح جميع المواد لتوضع في بكالوريوس العلوم مع الإيثانول 70%.
  2. 24 ساعة بعد البذر، عندما وصلت إلى الخلايا كونفلوينسي 80 – 90%، وضع الأطباق اثنين في سوبتشامبير نقص في الدرج الأمامي الحاضنة (انظر الجدول للمواد) مع % 1 س2 و 5% CO2 في 37 درجة مئوية، وتبقى أطباق أخرى اثنين في نورموكسيا (21% O 2، 5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 4 h. استخدام مجموعة واحدة من الخلايا التاكسج ونورموكسيك لتقييم علاج نقص به لطخة غربية والاستفادة من مجموعة أخرى من الخلايا للتجارب إيمونوبريسيبيتيشن co.
    ملاحظة: يمكن تعيين مستويات الأوكسجين في 0 – 5%، ومدة علاج نقص يمكن أن تختلف تبعاً لنوع الخلية ودراسة الهدف.

2-كل خلية واستخراج النووية

ملاحظة: انظر الجدول 1 للحصول على معلومات حول المخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول.

  1. حصاد الخلايا التحكم نورموكسيا.
    1. قم بإزالة وسائط الثقافة بالطموح وشطف الخلايا مع 10 مل دببس (PH 7.0-7.2) باستخدام ماصة 10 مل.
      ملاحظة: تجنب لمس المونولاير الخلية مع الماصة. أثناء الغسيل، بلطف "الماصة؛" دببس أسفل الجدار للوحة الثقافة الخلية لتجنب فقدان الخلية.
    2. "الماصة؛" 5 مل دببس المثلج إلى اللوحة وكشط الخلايا خارج سطح اللوحة في برنامج تلفزيوني المثلج مع مكشطة خلية.
    3. نقل تعليق خلية في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والحفاظ على الجليد.
  2. حصاد الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج.
    1. قبل حجته دببس لشروط التاكسج بوضع كشف 1مل 00 تجربة كاشف زجاجة مليئة دببس في سوبتشامبير نقص (1% O2 و 5% CO2 في 37 درجة مئوية) ل 24 ساعة مقدما.
    2. مكان تقريبا 1 ح قبل الحصاد الخلايا، ونقص العلاج جليد مربع يحتوي على الجليد في تجهيز غرفة الدرج الأمامي، الذي قد تم اكويليبراتيد إلى % 1 س2 و 5% أول أكسيد الكربون2. نقل زجاجة تحتوي على دببس التاكسج متوازن مسبقاً من سوبتشامبير نقص إلى الدائرة تجهيز ووضعه على الجليد.
    3. 4 ح بعد نقص العلاج، نقل الخلايا من سوبتشامبير نقص إلى دائرة التجهيز الذي تم مسبقاً متوازن إلى % 1 س2 و 5% أول أكسيد الكربون2.
    4. قم بإزالة وسائط الثقافة بالطموح وشطف الخلايا مرة واحدة مع 10 مل المثلج دببس التاكسج متوازن مسبقاً مع 10 مل "الماصة؛".
    5. إضافة 5 مل المثلج دببس قبل متوازن مع 5 مل "الماصة؛" وإزاحة الخلايا بالقشط مع مكشطة خلية.
    6. إمالة لوحة الثقافة الخلية وجمع الخلايا المنفصلة باستخدام ماصة 10 مل. نقل تعليق خلية في دببس في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والحفاظ على الجليد.
    7. فتح الباب بين المخزن المؤقت لتجهيز دوائر الدرج الأمامي، سواء التي كانت قبل متوازن إلى 1% O2 و 5% CO2. نقل الأنابيب المخروطية 15 مل على الجليد التي تحتوي على خلايا نقص تعامل من تجهيز الدائرة إلى دائرة المخزن المؤقت. فتح باب الغرفة العازلة وإزالة الخلايا تماما من الدرج الأمامي.
  3. بيليه كلا من الخلايا نورموكسيك من 2.1 والخلايا التاكسج من 2.2 بالطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. تعد الخلية كلها مقتطفات.
    1. ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميليلتر من إذاعة المثلج إيمونوبريسيبيتيشن المقايسة (ريبا) تحلل مخزن يحتوي على 50 مم هيدروكلوريد تريسامينوميثاني (تريس-HCl) pH 8.0، كلوريد الصوديوم 150 مم (كلوريد الصوديوم)، تيرجيتول 1% من نوع NP-40 (NP-40)، ديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.5%، و الصوديوم 0.1% دوديسيل كبريتات (SDS)، وتستكمل مع 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل (انظر الجدول للمواد) التي بيبيتينج الكريات خلية صعودا وهبوطاً عدة مرات.
    2. نقل ليساتيس الخلية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة والحفاظ على الجليد لمدة 30 دقيقة مع فورتيكسينج عرضية.
    3. الطرد المركزي ليساتيس خلية في س 13,000 ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. جمع ميليلتر 50 طافية، اليكووت من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  5. إعداد المقتطفات النووية تستخدم استخراج نووية كيت (انظر الجدول للمواد).
    1. بلطف ريسوسبيند الكريات الخلية في 500 ميليلتر من تحلل المخزن المؤقت NL تستكمل مع 1 x مثبط البروتياز كوكتيل و 0.1 M ديثيوثريتول (DTT) التي بيبيتينج الكريات خلية صعودا وهبوطاً عدة مرات.
    2. إضافة 25 ميليلتر من المنظفات حل الحزب الوطني إلى تعليق خلية ودوامه 10 s بأقصى سرعة ممكنة.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. جمع المادة طافية (مقتطفات هيولى)، الكوة ميليلتر 50 من المادة طافية إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب، وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    5. ريسوسبيند بيليه الذي يحتوي على نواة الخلية في 500 ميليلتر من تحلل العازلة NL تكملها مع 1 x مثبط البروتياز كوكتيل و 0.1 م DTT فورتيكسينج ل 5 ق بأقصى سرعة ممكنة.
    6. الطرد المركزي في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وحفظ بيليه النووية.
    7. ريسوسبيند بيليه النووية في 50 ميليلتر من NX1 المخزن المؤقت الاستخراج تكملها مع 1 × مثبطات البروتياز كوكتيل بيبيتينج بيليه صعودا وهبوطاً عدة مرات.
    8. احتضان 30 دقيقة على الجليد، وفورتيكسينج لمدة 10 ثانية كل 5 دقائق بأقصى سرعة ممكنة.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
  6. تحلية مقتطفات النووية.
    1. جمع المادة طافية من الخطوة 2.5.9 ونقلها إلى أجهزة الغسيل الكلوي مصغرة بحجم الحد أقصى من 100 ميليلتر كل وحدة.
    2. أجهزة الغسيل الكلوي ميني كاب ووضعها في جهاز التعويم.
    3. وضع الجهاز التعويم في كوب يحتوي على 500 مل من المخزن المؤقت ليبرد قبل الغسيل الكلوي (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، والغليسيرول 20%، كلوريد البوتاسيوم 100 مم (بوكل)، 0.2 مم الإيثيلين أسيد (يدتا)، 0.2 مم فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد (بمسف) و 0.5 مم DTT) واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية مع إثارة لطيف.
      تنبيه: بمسف من خطرة. تجنب الاتصال المباشر مع الجلد أو الاستنشاق.
    4. جمع العينات من الزاوية لأجهزة الغسيل الكلوي مصغرة ونقل إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب جديدة.
    5. الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق عند 4 درجة مئوية، الكوة ميليلتر 25 لكل المادة طافية في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، وتخزينها في-80 درجة مئوية.

3-تقييم علاج نقص بالكشف عن التعبير البروتين وتوطين منطقياً-1α سوبسيلولار

  1. تحديد تركيز البروتين للخلية كله أو مقتطفات النووية/هيولى استخدام الفحص الميكروسكوبية بيسينتشونينيك الحمضية (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم مجموعة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة18.
  2. تمييع ليساتيس خلية في المخزن المؤقت عينة x Laemmli 1 التي تحتوي على 5% 2-Mercaptoethanol ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    تنبيه: لا تلمس سطح كتلة التدفئة، حيث أنها قد تسبب الحروق.
  3. فصل البروتينات بالصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة).
    1. تحميل كميات متساوية من البروتين (25 ميكروغرام) في كل بئر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجاهزة التدرج الجل (4 – 20%)، جنبا إلى جنب مع 3 ميليلتر علامة الوزن الجزيئي.
    2. تشغيل الهلام في تشغيل المخزن المؤقت الذي يحتوي على 2.5 ملم تريس، 19.2 مم جليكاين، الحزب الديمقراطي الصربي 0.01 ٪، PH8.3 لمدة 30 دقيقة في 200 V.
  4. نقل البروتينات إلى من الهلام إلى الغشاء النيتروسليلوز.
    1. تجميع ساندويتش نقل (ورق الترشيح-جل-غشاء-تصفية الورق) مع الهلام على الجانب اﻷنود والغشاء إلى الجانب السالب من الكاسيت.
    2. ضع الكاسيت في خزان نقل مليئة بنقل المخزن المؤقت الذي يحتوي على تريسامينوميثاني 2.5 ملم (تريس)، 19.2 مم جليكاين و 20% ميثانول.
      تنبيه: الميثانول هو قابل للاشتعال ويجب تخزينها داخل تخزين السوائل القابلة للاشتعال مجلس الوزراء.
    3. القيام بالنقل عن ح 1 في 100 الخامس في غرفة باردة.
  5. كتلة وصمة عار في 10 مل حظر مخزن يحتوي على 50 مم تريس Cl (درجة الحموضة 7.6)، 150 مم كلوريد الصوديوم، والحليب غير الدسم توين 20 و 5% 0.1 ح 1 في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
  6. احتضان وصمة عار مع الأضداد المضادة-منطقياً-1α (تمييع 1/500) في المخزن المؤقت حظر نفسه بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. غسل وصمة عار 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع 50 مل تبس-ت.
  8. احتضان وصمة عار مع الفجل البيروكسيديز (HRP)-الجسم المضاد الثانوي مترافق (تمييع 1/1,000) في 10 مل تي تبس التي تحتوي على 5 في المائة غير الدسم الحليب الجاف ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  9. غسل وصمة عار 3 مرات لمدة 5 دقائق في كل مرة مع 50 مل تبس-ت.
  10. ميكس 500 ميليلتر كل من تشيميلوميسسينت المحسنة (القامة) الكاشف A و B في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل ودوامه بإيجاز.
  11. تطبيق الركيزة مسافنة لوصمة عار واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  12. التقاط إشارات تشيميلومينيسسينت استخدام جهاز اقتران (CCD) نظام التصوير القائم على الكاميرا.
    1. واستنزاف فائض مسافنة الركيزة لمس حافة الغشاء مع ورقة الأنسجة بوضع الغشاء في حامية ورقة.
    2. ضع الغشاء الموجود على علبة عينة من اتفاقية مكافحة التصحر نظام التصوير القائم على الكاميرا.
    3. إطلاق برامج معالجة الصورة (انظر الجدول للمواد)، والتقاط الصور مع الإعدادات التالية: ملف ← جديد بروتوكول ← قناة واحدة ← "إعداد بروتوكول" ← هلام التصوير (التطبيق: Chemi؛ مجال التصوير: الأحيائي راد جل جاهزة؛ التعرض التصوير: البرنامج سوف تحسين تلقائياً وقت التعرض لعصابات مكثفة) ← تشغيل البروتوكول
      ملاحظة: وقت التعرض يمكن تعيين يدوياً تحقيق الصور الأمثل.

4-إيمونوبريسيبيتيشن والكشف عن البروتينات إيمونوبريسيبيتاتيد

  1. أغسل 50 ميليلتر من البروتين سيفاروسي A/G الخرز في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت TBS في أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وبيليه الخرز بالطرد المركزي في س 3,000 ز لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت TBS.
  3. إضافة 2 ميليلتر من الماوس ارنت مكافحة [مونوكلونل] جسم (1.4 ملغ/مل) أو الماوس "ز الغلوبولين المناعي" (IgG) (1.4 ملغ/مل) الذي أعده تشكيل الماوس 0.7 ملغ مفتش في 500 ميليلتر تبس العازلة.
  4. وضع أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل يحتوي على الخرز في دوار أنبوب واحتضانها ح 2 10 لفة في الدقيقة في غرفة باردة.
    ملاحظة: التعامل مع الأنابيب برفق والحفاظ على تعليق يحتوي على الخرز في الجزء السفلي من الأنبوب.
  5. بيليه الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل في سوبيرناتانتس.
  6. تمييع 200 ميكروغرام من البروتين النووي ليستي التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.6.5 في 800 ميليلتر من المخزن المؤقت الملكية الفكرية تتألف من 50 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4)، 180 ملم كلوريد الصوديوم، الجلسرين 20%، 0.2% مثبط البروتياز NP-40 و 1 x كوكتيل. احتضان مع الخرز إلى جانب الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها في الخطوة 4، 5 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  7. بيليه الخرز بالطرد المركزي في 3,000 س ز 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتجاهل سوبيرناتانتس وتغسل حبات 3 مرات مع 1 مل تبس المثلج يحتوي على 0.2% NP-40.
  8. يغلي الخرز في 50 ميليلتر لايملي عينة العازلة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. الطرد المركزي الخرز في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية، وتجاهل الخرز.
    ملاحظة: يمكن تخزين المادة طافية في 4 درجات مئوية لفترة قصيرة أو-20 درجة مئوية لفترة طويلة.
  10. الكشف عن وجود 1α منطقياً من مجمعات البروتين إيمونوبريسيبيتاتيد بوصمة عار الغربية كما سبق ذكره في الخطوة 3، 3 فصاعدا.
    ملاحظة: غير مطلوب البروتين التحديد الكمي لهذه الخطوة. تحميل حجم كامل (50 ميليلتر) من المادة طافية كل عينة في كل بئر من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الجاهزة التدرج الجل (4 – 20%)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم الاستجابة الخلوية لنقص، التعبير تم فحص مستويات والتعريب سوبسيلولار المكونات لعلاج نقص التالية المعقدة منطقياً-1. HEK293A الخلايا المزروعة تحت ظروف التاكسج ح 4 أو أبقى في نورموكسيا كعناصر تحكم. تم فحص مستويات البروتين 1α سكانية وارنت في خلية كاملة أو النووية/هيولى مقتطفات من لطخة غربية. ومثلما كانت مستويات منطقياً-1α المتوقعة، ومجموع upregulated من نقص، بينما مستويات ارنت في مجموع ليساتيس الخلوية لم تكن كبيرة تغيير (الشكل 1A). وباﻹضافة إلى ذلك، نقص النا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

مجمع منطقياً-1 هو منظم رئيسي للتوازن الأكسجين الخلوية وينظم عدد كبير جينات المشتركة في الاستجابات التكيفية الخلوية المختلفة لنقص. تحديد البروتينات المتفاعلة منطقياً-1 رواية مهم لفهم توصيل الإشارة التاكسج. تجارب Co-إيمونوبريسيبيتيشن تستخدم عادة للدراسات القياسية لتحديد مسارات توصيل الإشارات الخلوية. ومع ذلك، overexpression البروتين يستخدم على نطاق واسع وقد يؤدي هذا إلى التحف التجريبية. وباﻹضافة إلى ذلك، منطقياً-1α بروتين غير مستقرة ويصبح سرعة المتدهورة من خلال إعادة الأوكسجين11. وبالإضافة إلى ذلك، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ونشكر أستاذ مشارك الخطيئة أونغ تيونغ لاستخدام محطة العمل نقص. أيد هذا العمل ما يلي: سنغافورة وزارة التعليم، وزارة التربية والتعليم 1T1-02/04 و MOE2015-T2-2-087 (إلى Y.A.)، لي كونغ عجزا كلية الطب، جامعة نانيانغ التكنولوجية بدء المنحة M4230003 (إلى p.o.b.)، "مجلس البحوث السويدية"، مؤسسة بيرسون إرلينغ الأسرة، مؤسسة نوفو نورديسك، Stichting af مؤسسة جوتشنيك والرابطة السويدية لمرض السكري، وشركة التأمين وكالة، وأبحاث السكري ومؤسسة العافية، ومؤسسة مرسى فون كانتزوو، برنامج البحوث الاستراتيجية في مرض السكري في معهد كارولينسكا، المنسق منسق الإغاثة الطارئة-2013-مساعد المدير العام 338936-بيتالماجي، ومؤسسة والنبرغ أليس كنوت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد< / قوي>
1.0 M Tris-HCl Buffer ، درجة الحموضة 7.4   ؛1st BASE1415
بروتين A / G Sepharose الخرزAbcamab193262
الماوس الطبيعي IgG بروتينAbcamab198772
EDTABio-Rad1610729
2x Laemmli عينة عازلةBio-Rad1610737
2-MercaptoethanolBio-Rad1610710
النيتروسليلوز غشاء    Bio-Rad1620112
Blotting-Grade BlockerBio-Rad1706404حليب جاف خالي الدسم لتطبيقات النشاف الغربي
10x Tris Buffered Saline (TBS)Bio-Rad1706435
10٪ Tween 20Bio-Rad1610781
10x Tris / Glycine / SDSBio-Rad1610732
10x Tris / Glycine Buffer   ؛معايير Bio-Rad1610771
Precision Plus Protein Dual ColorBio-Rad1610374
IgG المضادة للأرانب ، إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة بHRP 7074
IgG المضادة للفأر ، الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP   ؛إشارات الخلية7076
خليةكاشف ECL6883
Dulbecco's Fossil-Buffered Phosphate-SaltCorning21-030-CV
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Merck Millipore52332
ARENT / HIF-1 beta Antibody  Novus BiologicalsNB100-124 التركيز: 1.4 ملغم/مل
HIF-1 ألفا الأجسام المضادةNovus BiologicalsNB100-479التركيز: 1.0 مجم / مل
YY1 الجسم المضادNovus BiologicalsNBP1-46218التركيز: 0.2 مجم / مل
Qproteome مجموعة البروتين النوويQiagen37582يتم توفير المخزن المؤقت للتحلل NL و Extraction Buffer NX1 في المجموعة
GAPDH الأجسام المضادةسانتا كروزsc-47724التركيز: 0.2 مجم / مل
الجلسرين (> 99٪)SigmaG5516
كلوريد البوتاسيومSigmaP9541
RIPA عازلةSigmaR0278
كلوريد الصوديوم (NaCl)Sigma71376
NP-40Sigma127087-87-0
Dulbecco ' s النسر المعدل s متوسط (DMEM ، 4.5 جم / لتر جلوكوز) ثيرموفيشر 11995065
ديثيوثريتول (DTT)ثيرمو فيشر ScientificR0861
مصل الأبقار الجنينيثيرمو فيشر العلمي10270106
الخليةHEK293A Thermo Fisher ScientificR70507
الميثانول & nbsp ؛ثيرمو فيشر Scientific67-56-1
البنسلين - ستربتومايسينثيرمو فيشر 15140122
العلم بيرس أقراص مثبطات البروتياز  Thermo Fisher Scientific88660
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23225
QSP هلام تحميل تلميح  Thermo Fisher ScientificQSP # 010-R204-Q-PK1-200 uL
< قوي > المعدات / الأداة < / ورق
سميك ، قطع مسبق ، 7.5 × 10 سمBio-Rad1703932
Mini-PROTEAN   ؛ خلية الرحلان الكهربائي العمودي Tetra للمواد الهلامية الصغيرة مسبقة الصب ، مع Mini Trans-Blot   ؛ الوحدة النمطية وPowerPac Basic Power SupplyBio-Rad1658034
4 & ndash ؛ 15٪ Mini-PROTEAN TGX جل البروتين مسبقة الصبBio-Rad4561083
ChemiDoc XRS + SystemBio-Rad1708265
I-GloveBioSpherixI-Glove
Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader   ؛BioTekBTS1LFTA
Costar 5 مل Stripette ماصات مصليةكورنينج4487
كوستار 10 مل ستريبيت ماصات مصليةكورنينج4488
كوستار 25 مل ستريبيت ماصات مصليةكورنينج4251
كورنينج 96 بئر قاع شفاف أسود البوليسترين المجهريكورنينج3631
15 مل ارتفاع أنابيب الطرد المركزي المخروطيةالوضوح Corning352095
مكشطة خلية صغيرةCorning3010
Gilson & nbsp ؛ طقم Pipetman L 4 ماصات جيلسونF167370P2 ، P20 ، P200 ، P1000 وملحقاتها
1.5 مل أنابيب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلينGreiner Bio-One & nbsp ؛616201
PIPETBOY acu 2 PipettorINTEGRA Biosciences155 000  
خزانات تخزين السوائل القابلة للاشتعال JustriteJustrite Manufacturing Co.896000
دوامة خلاطLabnetS0200
CO2 حاضنةNuAireNU-5820
الهزازات المداريةستيوارتSSL1
أنبوب دوار SB3ستيوارتSB3
MicroCL 21R أجهزة الطرد المركزيالدقيقة الحرارية فيشرالعلمية 75002470
سورفال ST 16 الطردالمركزي الحراري 75004240
العلمي (100 مم)Thermo Fisher Scientific150350
Slide-A-Lyzer جهاز غسيل الكلىThermo Fisher Scientific6958010K MWCO ، 0.1 مل
عوامات عائمة ل 0.1 مل Slide-A-Lyzer MINI أجهزة غسيل الكلىThermo FisherScientific 69588
LSE سخانات الحمام الجاف الرقميةThermo Fisher علمي1168H25
حراري علمي  1300 Series A2 Class II ، خزانات السلامة الحيوية من النوع A2Thermo Fisher Scientific13-261-308
Software< / strong>
Image Lab SoftwareBio-Rad1709691
إشارات خط ترشيح قوي > PP شركة أطباق زراعة الأنسجة فيشر

المراجع

  1. Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine. Cell. 148 (3), 399-408 (2012).
  2. Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).
  3. Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).
  4. Semenza, G. L. HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia. J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).
  5. Kallio, P. J., et al. Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha. EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).
  6. Ke, Q., Costa, M. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).
  7. Gustafsson, M. V., et al. Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state. Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).
  8. Zheng, X., et al. Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).
  9. D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses. FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).
  10. Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).
  11. Zheng, X., et al. Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization. Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).
  12. Depping, R., et al. Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway. Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).
  13. Wei, H., et al. Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition. Tumour Biol. 39 (5), (2017).
  14. Chang, H. Y., et al. Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON. Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).
  15. Moriya, H. Quantitative nature of overexpression experiments. Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).
  16. Prelich, G. Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation. Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).
  17. Zheng, X., et al. A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells. Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).
  18. Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials. J Vis Exp. (110), e53819(2016).
  19. Chilov, D., et al. Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha. J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).
  20. Yin, S., et al. Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP. Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).
  21. Holmquist-Mengelbier, L., et al. Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype. Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).
  22. Koh, M. Y., Powis, G. Passing the baton: The HIF switch. Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).
  23. Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization. Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).
  24. Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia. J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).
  25. Caradec, J., et al. Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia. Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HIF 1 ARNT AG

مقالات ذات صلة