مقالة منهجية

والرزن سريع فوعة جرثومية المستندة إلى الصور استخدام أميبا

DOI:

10.3791/57844

⸱

يونيو 27, 2018

 , 
1Department of Physics and Astronomy, University of California, 2Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لقياس ضراوة البكتيريا العوالق أو المرفقة بالسطح باستخدام ديسكويديوم دال (الاميبا) كمضيف. فوعة يقاس مدى ح 1 والمضيف مما أسفر عن مصرع هو كمياً باستخدام التحليل المجهري والصورة الفلورية. علينا أن نظهر هذا البروتوكول باستخدام بكتيريا P. الزّنجاريّة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحوصات الفوعة الجرثومية التقليدية تنطوي على التعرض لفترة طويلة للبكتيريا على مدى عدة ساعات للخلايا المضيفة. وخلال هذا الوقت، يمكن أن البكتيريا تغيرات في الفسيولوجيا بسبب التعرض لبيئة النمو المضيف ووجود خلايا المضيف. لقد طورنا فحص لقياس سرعة حالة ضراوة من البكتيريا التي تقلل من مدى التي تنمو فيها البكتيريا حضور الخلايا المضيفة. البكتيريا الزحارية مختلطة معا ومعطلة على متن طائرة واحدة تصوير باستخدام جهاز pad أجار. يستخدم الإجراء تصوير fluorescence خلية واحدة مع إستر كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص) كمؤشر على صحة الخلية المضيفة. ويتم تحليل الأسفار الخلايا المضيفة بعد ح 1 من التعرض للخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي. صورة تحليل البرمجيات المستخدمة لحساب مؤشر قتل مضيف. وقد استخدمت هذا الأسلوب لقياس ضراوة داخل العوالق والمرفقة بالسطحية الزائفة الزّنجاريّة السكان الفرعية خلال المرحلة الأولى من تشكيل بيوفيلم ويمكن تكييفها للبكتيريا الأخرى والمراحل الأخرى من النمو بيوفيلم. هذا البروتوكول يوفر طريقة سريعة وقوية من قياس ضراوة ويتجنب العديد من التعقيدات المرتبطة بالنمو والحفاظ على خطوط خلايا الثدييات. تعمل الفوعة تقاس هنا باستخدام الزحارية قد صودق باستخدام الماوس الضامة. على وجه الخصوص، هذا التحليل كانت تستخدم لإنشاء ذلك فوعة أوبريجولاتيس مرفق السطحية P. الزّنجاريّة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العدوى البكتيرية واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات في الإنسان والحيوانات1،2. القدرة على قياس ضراوة البكتيريا في ثقافات أو الأغشية الحيوية مهم في إعدادات الرعاية الصحية والبحوث. هنا، يمكننا وصف أسلوب تنوعاً وسريعة وبسيطة نسبيا لقياس الفوعة الجرثومية. وتستخدم الكائنات الحية حقيقية النواة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم (الاميبا) كنموذج الكائن المضيف. دال-ديسكويديوم قد استخدمت كمضيف لتحديد عوامل الفوعة في الزائفة الزّنجاريّة (P. الزّنجاريّة)3،،من45 والأخرى البكتيريا6،7 ،8 وهو عرضه لالي حد كبير عوامل الفوعة ذاتها التي تقتل خلايا الثدييات بما في ذلك النوع الثالث إفراز9،10. وأشركت فحوصات الفوعة السابقة باستخدام ديسكويديوم دال- التعرض المطول للبكتيريا مع الخلايا ديسكويديوم دال- على مدى ساعات3،،من45. ويقدم البروتوكول، هنا، طريقة سريعة لتحديد ضراوة استخدام هذا الاميبا. هذا البروتوكول (الشكل 1) ويصف كيفية: (1) تنمو الزحارية أكسينيكالي (في عدم وجود البكتيريا)، (2) تنمو البكتيريا للمقايسة، (3) إعداد البكتيريا والخلايا المضيفة للفحص المجهري، (4) إجراء الفحص المجهري ابيفلوريسسينسي، و (5) تحليل أميبا الأسفار.

في البداية الزحارية السنة اللهب أثناء الخروج من الأرصدة المجمدة وتزرع في حديقة من الإشريكيّة القولونية (كولاي)، حيث تنتج الزحارية الجراثيم. التقطت هذه الجراثيم وتلقيح إلى وسيلة إثراء لنمو أكسينيك. يتم الاحتفاظ في الزحارية من خلال النمو أكسينيك في ظروف الغنية بالمغذيات حتى أنهم على استعداد لتكون مختلطة مع البكتيريا لتقييم الفوعة الجرثومية. البقاء أو موت الزحارية هو كمياً عن طريق قياس الأسفار من كالسين-أسيتوكسيميثيل (كالسين-ص)، وهو المشقوق من استيراسيس داخل الخلايا، وبالتالي تنشيط للأسفار11،12. الزحارية لايف يحمل الأسفار القليل أو لا بينما أكد وخلايا الموت فلوريس مكثف. هذه النتيجة بسبب إدراج قليلاً أو لا كالسين-صباحا إلى الزحارية صحية والتأسيس والانقسام من الركازة في الزحارية أكد13. يعتبر هذا السلوك خاصة متميزة من الأسفار كالسين-صباحا في خلايا الثدييات11،14،،من1516.

وتزرع البكتيريا التي سيجري تقييم لضراوة كل على حدة. هنا، نحن تصف كيفية قياس ضراوة من مسببات الأمراض الانتهازية الزّنجاريّة P. وتفاصيل كيفية تحديدها كمياً ضراوة من العوالق (سباحة) والسكان الفرعية المرفقة بالسطح. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لاختبار ضراوة البكتيريا الأخرى. في مقطع النتائج الممثل، نظهر أن ضراوة تنشيط في الخلايا المرفقة بالسطح ومنخفضة في الخلايا العوالق، التي ذكرت سابقا13. تنشيط الفوعة المرفقة بسطح P. الزّنجاريّة يقتل الزحارية بينما الخلايا العوالق غير الخبيثة يتم استهلاكها بواسطة الزحارية. إذا كان هو فقط يجري جزيئي ضراوة البكتيريا العوالق، يمكن أن تكون البكتيريا المستزرعة في أنابيب الثقافة عادية بدلاً من استخدام أطباق بيتري كما هو مبين في البروتوكول.

يجب أن يكون نمو الزحارية والثقافات P. الزّنجاريّة منسقة مثل الثقافات P. الزّنجاريّة التوصل إلى مرحلة النمو المقصود في حين تتزايد الزحارية في حالة مستقرة في ظروف الغنية بالمغذيات. ويتطلب هذا الشرط عادة الثقافات الزحارية أن تضعف قبل 1 يوم على الأقل عندما كانت مختلطة مع البكتيريا. الزحارية والبكتيريا هي معطلة باستخدام منصات أجار، وهي شاركت المحتضنة ح 1، وتصويرها باستخدام دقة منخفضة (10 X، الفتحة العددية 0.3) بتصفية البروتينات الفلورية الخضراء، وموضوعية (التجارة والنقل)، وكاميرا تصوير. تحليل يمكن أن يؤديها باستخدام برمجيات ImageJ متاحة بحرية، أو تخصيص برنامج تحليل الصور. تم إجراء تحليلنا باستخدام البرمجيات الخاصة بنا مكتوبة باستخدام حزمة تحليل علمي13. ينبغي إنشاء قناع باستخدام الصورة التباين المرحلة البرنامج واستخراج القيم الأسفار من مجالات الملثمين في الصورة الفلورية. يتم حساب متوسط القيم الأسفار عبر خلايا على الأقل 100، أسفر عن مؤشر قتل مضيف عددي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع الإجراءات التجريبية في جامعة كاليفورنيا في إيرفين.

1-المخازن المؤقتة والحلول

  1. إعداد مرق ليسوجيني (رطل) في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 25 غراما مزيج رطل-ميلر في 1 لتر الماء المقطر مزدوجة (ddH2س). لاطباق بيتري، إضافة 20 غراما إضافية من أجار. اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل متوسطة أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. تخزين وسائل الإعلام السائلة في درجة حرارة الغرفة ولوحات أجار في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد لوحات ببتون الخميرة جلوكوز (جيب) في زجاجة زجاج 1 لتر من خلط ز 1 د-الجلوكوز، وانتزاع ز 2 من ببتون، 0.25 غرام خميرة، 4.2 ز خ2ص4، ز 5.1 غ2هبو47 ح2س، و 25 جرام من أجار في 1 لتر من ddH2 سين اﻷوتوكﻻف لتعقيم. صب 25 مل أجار المنصهر في أطباق بتري سم قطرها 10 والسماح لترسيخ في درجة حرارة الغرفة. مخزن في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد متوسطة ببتون S (PS) في زجاجة زجاج 1 لتر بمزج 10 جرام ببتون، واستخراج 7 غرام خميرة، ز 15 د-الجلوكوز، ز 0.12 Na2هبو47 ح2س، ز 1.4 من خ2ص4، 40 ميكروغرام من فيتامين ب12 ، و 80 ميكروغرام من حمض الفوليك في 800 مل ddH2سين معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
    1. قياس درجة الحموضة PS المتوسطة باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 لضبط درجة الحموضة إلى 6.5. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام عامل تصفية O. ddH2تعقيم 0.22 ميكرومتر فراغ تصفية باستخدام وتخزين في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
  4. إعداد 10 × التنمية المخزن المؤقت لرئيس الوزراء (DB ') مخزن في زجاجة زجاج 1 لتر بإضافة 3.4 ز خ2ص4، ز 13.4 غ2هبو4 7 ح2س، و ddH2س إلى إجمالي حجم 800 مل. معايرة مقياس الأس الهيدروجيني إلكترونية استخدام الأس الهيدروجيني 4 ودرجة الحموضة 7 المعايير إذا لم يستخدم مقياس الأس الهيدروجيني خلال يوم واحد.
    1. قياس درجة الحموضة من المخزن المؤقت باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني الإلكترونية. قم بضبط درجة الحموضة إلى 6.5 بلطف إضافة 5 م كوه أو م 5 ح3ص4 حسب الحاجة. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر باستخدام ddH2س وتعقيمها قبل التعقيم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الحذر مع التعديلات الأس الهيدروجيني بارتداء المعدات الواقية، بما في ذلك القفازات والملابس الواقية، وحماية العين، وتواجه الحماية.
  5. جعل 1 × التنمية المخزن المؤقت (DB) بخلط 100 مل 10 × DB ' المخزن المؤقت مع 1 مل من تعقيم مجكل م 22، و 1 مل من تعقيم كاكل 1 م2. ضبط الحجم النهائي إلى 1 لتر في زجاجة 1 لتر باستخدام ddH معقم يعقم2"مخزن سين" في درجة حرارة الغرفة.
  6. إعداد متوسطة PS:DB في زجاجة زجاج 1 لتر بخلط 100 مل من تعقيم PS المتوسطة، وتعقيم 100 مل من 10 × DB ' المخزن المؤقت، وتعقيم ddH2س إلى إجمالي حجم 1 ل. الملحق مع 1 مل من تعقيم مجكل م 22 و 1 مل من تعقيم 1 م كاكل 2-مخزن في 4 درجات مئوية.
  7. إعداد الحل الأسهم صباحا كالسين بإضافة 50 ميليلتر من [دمس] إلى 50 ميكروغرام من كالسين-صباحا في حاوية بلاستيكية تم توفيره بواسطة الشركة المصنعة. مخزن في-20 درجة مئوية.

2-النمو والحفاظ على الزحارية

  1. تنمو سلالة كولاي B/r17 كمصدر لغذاء الزحارية خلال فترة النمو الأولى. الانتصارات كولاي B/r من أسهم مجمدة مخزنة في-80 درجة مئوية على صفيحة أجار رطل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها للحصول على مستعمرات واحدة.
  2. تطعيم مستعمرة واحدة من كولاي B/r إلى 2 مل متوسطة رطل واحتضان في طبل اسطوانة أو شاكر على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تجلب بين عشية وضحاها كولاي الثقافة إلى درجة حرارة الغرفة. باستخدام عصا خشبية، تطعيم الزحارية من أسهم مجمدة تحفظ في-80 درجة مئوية إلى 750 ميليلتر للثقافة بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: استخدام ديسكويديوم دال- سلالة AX3، وقادرة على النمو أكسينيك18. لا تتطلب هذه الخطوة النمو أكسينيك، ولكن الخطوات اللاحقة له الشرط.
  4. فور إضافة 700 ميليلتر الزحارية-كولاي الخليط على صفيحة ببتون خميرة جلوكوز (جيب). نشر ثقافة بالتساوي على سطح اللوحة عن إمالة ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب حسب الحاجة. تجنب استخدام الناشرة.
  5. ضع لوحة جيب مع أجار مواجها لأعلى في مربع الذي يحافظ على رطوبة عالية. استخدام الحاويات البلاستيكية المتاح اثنين (183 سم × 183 سم × 91 سم) مكدسة أعلى بعضها البعض. ملء حاوية أسفل مع حوالي 25 مل من الماء ومكان أعلى الحاوية مع حفر من خلال الأرضيات الحاوية للسماح للرطوبة للانتقال من خزان المياه إلى أعلى الحاوية عدة ثقوب قطرها سم 0.5.
  6. احتضان لوحة جيب ومربع عند 22 درجة مئوية لمدة 4-5 أيام حتى تحترم جراثيم أميبا المتنامية بالقرب من سطح اللوحة (الشكل 2). استخدام حاضنة مبردة لاحتضان لوحات بدلاً من حضانة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: بعد أن نمت جراثيم، تظل قابلة للتطبيق على لوحات لعدة أسابيع عند تخزينها في 4 درجات مئوية. تخزين اللوحات مع الجانب أجار مواجها لأعلى. بعد 3-4 أيام للحضانة، يمكن ملاحظة مناطق لتطهير داخل الحديقة البكتيرية، التي تشير إلى بدء تبوغ أميبا.
    1. مراقبة الزحارية الصغيرة جراثيم فوق سطح اللوحة بعد 4-5 أيام للحضانة (الشكل 2).
      ملاحظة: لا تنمو الزحارية لمدة أطول من أسبوع، كما يقلل من نوعية الجراثيم خارج هذه الفترة الزمنية.
  7. جمع الجراثيم الزحارية للتحضير لنمو أكسينيك الزحارية التي تجتاح تلميح ماصة معقمة 1 مل موازية لسطح اللوحة. جمع الجراثيم من نصف 10 سم طبق بيتري.
    ملاحظة: تجنب ملامسة تلميح إلى سطح لوحة أجار كهذا الاقتراح سيتم جمع أعدادا كبيرة من كولاي.
  8. ريسوسبيند الزحارية في تلميح الماصة أغرق في التلميح إلى 1 مل من PS المتوسطة ولطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  9. نقل الخليط الملقحين في قارورة 250 مل التي تحتوي على 25 مل PS المتوسطة وتستكمل مع الحل مضاد حيوي فطري 0.25 x تركيز.
    ملاحظة: تخزين الحل مضاد حيوي فطري ك 250 ميليلتر مختبرين في-20 درجة مئوية. تجنب دورات متكررة من ذوبان الجليد وتجميد هذا الحل، وهذا قد يقلل من فعاليته.
  10. تنمو الزحارية أكسينيكالي عند 22 درجة مئوية في شاكر الدورية 100 لفة في الدقيقة. للمقايسة الفوعة في الخطوة 5، تنمو خلايا لكثافة بصرية قياس 600 نانومتر (OD600) من 0.2 إلى 0.5.
    ملاحظة: تتطلب هذه الخطوة 3-4 أيام نمو من وقت التطعيم (الخطوة 2.7). إذا كانت الخلايا نمت بكثافة أعلى، تضعف ثقافة العودة في المتوسطة PS OD600 0.05 أو أقل وتنمو مرة أخرى ل التطوير التنظيمي600 من 0.2 إلى 0.5.

3-نمو P. الزّنجاريّة

  1. اختيار مستعمرة واحدة من P. الزّنجاريّة من صفيحة رطل وتطعيم أنه في 2 مل الثقافة PS:DB، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية للتشبع.
    ملاحظة: لا إضافة الحل مضاد حيوي فطري لوسائل الإعلام PS:DB.
  2. تمييع بين عشية وضحاها الثقافة 1: 100 أو 1:1,000 في طبق بتري قطرها 6 سم باستخدام PS:DB. إذا كان هو فقط يجري جزيئي الفوعة الخلايا العوالق، تنمو الثقافات بدلاً من ذلك باستخدام أنابيب الثقافة التقليدية. اهتز الثقافة على محور دوار benchtop تعيين 100 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. حصاد الثقافات في نقطة زمنية معينة لضمان إمكانية تكرار نتائج. في 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل تقييم الفوعة، إعداد جهاز pad أجار كما هو موضح في القسم 4.
    ملاحظة: هو الناجم عن ضراوة في P. الزّنجاريّة حوالي 8 ح النمو على السطوح.
  4. لعزل الخلايا المرفقة بالسطح، إزالة المتوسطة السائل من طبق بيتري وتغسل فورا مع 1 مل من المخزن المؤقت DB لإزالة الخلايا العوالق، والشروع فورا في الخطوة 5، 1.
    تنبيه: لا تغسل أطول من 30 ثانية كهذا سوف التشويش وفصل الخلايا المرفقة بالسطح وقد تؤثر على قياس ضراوة.
  5. لعزل الخلايا العوالق، نقل 10 ميليلتر للثقافة من طبق بيتري إلى طبق بتري نظيفة والشروع فورا في الخطوة 5، 1.

4-الفحص المجهري-إعداد لوحة المفاتيح أجار

  1. إعداد منصات أجار حوالي 30 دقيقة إلى 1 ساعة قبل الزحارية على استعداد لتكون مختلطة مع P. الزّنجاريّة.
  2. الموجات الدقيقة 50 مل أجار 1% (w/v) في المخزن المؤقت DB في قارورة 250 مل. مزيج كل 20 ثانية حتى كتل من أجار تختفي.
  3. بارد أجار المنصهر بوضعه في حوض ماء مسخن 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 15 ميليلتر من الحل الأسهم كالسين-صباحا إلى 15 مل أجار المنصهر في أنبوب مخروطي. المزيج بلطف عكس الأنبوب 4-5 مرات والشروع فورا في الخطوة التالية.
    ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في أنبوب الطرد مركزي البوليبروبيلين 15 مل. عدم استخدام حاوية زجاج سميك كما سيؤدي هذا أجار يصلب بسرعة كبيرة جداً.
  5. صب الخليط المنصهر أجار على رأس لوحة زجاج 12 × 10 سم وتسمح أجار يصلب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قطع لوح أجار طدت إلى مقاطع أصغر 1.5 × 1.5 سم بوضع لوحة زجاج عبر شبكة مطبوعة وقطع على طول الشبكة باستخدام مسطرة معدنية.
  6. تبقى هلام رطب في مربع رطبة حتى يكون جاهزاً للاستخدام.

5-الفحص المجهري-إعداد نموذج الاميبا البكتيريا للتصوير

  1. للاعتداء ضراوة المرفقة بسطح الخلايا البكتيرية، إضافة 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 إلى البكتيريا التي تعلق على سطح من الخطوة 3، 4.
    ملاحظة: هذه الخطوة وصف اختلاط الزحارية مع البكتيريا.
  2. للاعتداء ضراوة الخلايا العوالق، يخلط 10 ميليلتر من خلايا الاميبا من الخطوة 2.10 10 ميليلتر من البكتيريا العوالق من الخطوة 3، 5.
    ملاحظة: لا تغسل الخلايا أميبا نابعة من أكسينيكالي (في OD600 من 0.2 إلى 0.5) قبل الاختلاط مع البكتيريا. أي نمو كولاي سيتبع في ثقافة أميبا نتيجة لاستخدام الحل مضاد حيوي فطري.
  3. فورا وضع لوحة أجار كالسين-ص 1.5 × 1.5 سم من الخطوة 4، 5 أعلى الخليط أميبا البكتيريا على سطح طبق بيتري.
    ملاحظة: وضع لوحة أجار على رأس المخلوط حركة سلسة سريعة باستخدام. لن تقلل لوحة المفاتيح ببطء على الخليط من هذه الحركة تميل إلى دفع الخلايا نحو المحيط وبعيدا عن الجانب السفلي من لوحة المفاتيح. هذه الخطوة سيتم التأكد من وجود البكتيريا والزحاريه بالتساوي مختلطة، معطلة وأن كليهما الخلية أنواع تقتصر على متن نفس الطائرة.
  4. إزالة السائل الزائد بلطف بيبيتينج بها أي سائل المتبقية المحيطة بلوحة أجار. تسمح طبق بيتري لتجف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تغطي بطبق بيتري مع غطاء واحتضان البكتيريا أميبا المعطل تداولها الخليط في درجة حرارة الغرفة لدقيقة 40 إضافية المضي قدما إلى الخطوة 6، 1.
    ملاحظة: من المهم لاحتضان جميع العينات لنفس المقدار من الوقت، كما يزيد fluorescence الخلفية مع مرور الوقت. ويوصي بفترة حضانة من ح 1. إينكوبيشنز لمدة أطول من ح 1 أقل استنساخه كما قد تبدأ الخلايا الزحارية إلى انفجار.

6-الفحص المجهري--الحصول على الصور

  1. الزحارية الصورة باستخدام مجهر الأسفار قادرة على جلب الصور الفلورية برايتفيلد والأخضر. الفلورية الخضراء، استخدام مرشحات البروتين (بروتينات فلورية خضراء) الفلورية الخضراء مع 474/27 نانومتر و 525/45 نانومتر للإثارة والانبعاثات، على التوالي. استخدم هدفا (≥0.3 فتحه عددية) X 10 للصورة في الزحارية.
    ملاحظة: سيؤدي كالسين-صباحا في أجار الزحارية الموت للأسفار في قناة الفلورية الخضراء. خلاف ذلك، لا تكون الزحارية صحية الفلورسنت.
  2. ضبط أوقات اكتساب للتباين المرحلة، قنوات التجارة والنقل الحد من الضيائية، وتحسين النطاق الديناميكي لكثافة الصورة. تحل محل التباين مرحلة التباين (DIC) فرق التدخل إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: استخدام ms 100-200 التعرض لمرحلة التباين والأسفار بروتينات فلورية خضراء إذا كان ذلك ممكناً. الاحتفاظ بإعدادات التعرض والصك دون تغيير طوال هذه التجربة كاملة. هذا أمر بالغ الأهمية للحوسبة في فهرس قتل المضيف.
  3. الحصول على الصور لخلايا الاميبا على الأقل 100 بغية الحصول على إحصاءات جيدة لحساب المضيف فهرس القتل.

7-صورة مؤشر قتل المضيف والتحليل

  1. أداء تحليل الصور باستخدام إيماجيج.
  2. فتح ملف الصورة التباين المرحلة في إيماجيج عن طريق النقر على الملف | فتح وتحديد الصورة. ضبط العتبة بالنقر فوق صورة | تحليل | عتبة. ضبط العتبة السفلي والعلوي لتحديد ذروة شدتها فقط (الشكل 3أ).
  3. تحويل الصورة إلى ثنائي بالنقر فوق عملية | ثنائي | جعل ثنائي. ملء الثغرات عن طريق تحديد عملية | ثنائي | ملء الثقوب.
    ملاحظة: باستخدام الصورة في الشكل 1 كالمصدر، ستنتج الخطوات 7.1 7.2 صورة تظهر فيها الزحارية والمرفقة بسطح البكتيريا كمناطق مظلمة (الشكل 3ب).
  4. ضمان أن يتم التحقق من المربعات المنطقة و يعني قيمة الرمادي في تحليل | تعيين قياسات. قياس الحجم التقريبي الزحارية بتحديد أداة البيضاوي على شريط الأدوات الرئيسي. انقر فوق تحليل | قياس وملاحظة منطقة الزحارية الممثل.
  5. إنشاء أقنعة الزحارية عن طريق النقر فوق تحليل | تحليل الجزيئات. في مربع الحجم، قم بإدخال المنطقة التي سوف تدرج في الزحارية لكن استبعاد البكتيريا. حدد أقنعة في شريط القوائم المنسدلة إظهار الخيار. تأكد من أن يتم التحقق من المربع إضافة إلى مدير .
  6. انقر فوق موافق وصورة تظهر فقط في الزحارية وهو مدير العائد على الاستثمار سوف يظهر مربع حوار (الشكل 3ج).
  7. فتح الصورة الفلورية باستخدام الملف | فتح واختيار الملف المناسب. تحديد جميع المناطق في إدارة العائد على الاستثمار بالضغط باستمرار على المفتاح Shift والنقر على كل منطقة في القائمة (الشكل 3د).
  8. انقر فوق زر الإجراء في إدارة العائد على الاستثمار. سيؤدي هذا إلى فتح إطار نتائج عرض قيمة كثافة يعني كل أميبا.
  9. نسخ قيم الأسفار كل أميبا في برنامج جدول بيانات وحساب المضيف قتل المؤشر بأخذ متوسط جميع الأسفار القيم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نمت البرية من نوع P. الزّنجاريّة سلالة PA1419 أو Δﻷسر سلالة20 في نفس الخلفية PA14 في أطباق بتري سم قطرها 6 وجزيئي الفوعة من العوالق والمرفقة بسطح الخلايا. الثقافات تم تلقيح من مستعمرات واحدة في الثقافات PS:DB، نمت بين عشية وضحاها في أنابيب الثقافة في طبل اسطوانة في 37 درجة مئوية للتشبع، والمخفف 1: 100 في PS:DB، نمت عن ح 8 في 6 أطباق بيتري قطره سم الهز 100 لفة في الدقيقة، والعوالق والمرفقة بالسطح السكان الفرعي P. ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول وصف أسلوب سريع والكمية الاعتداء الفوعة في P. الزّنجاريّة. ويمكن اختبار هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى. ومع ذلك، من المهم أن نأخذ في الاعتبار أن متوسط النمو ينبغي أن تكون متوافقة مع ظروف النمو أميبا. على وجه الخصوص، نحن الأمثل البروتوكول باستخدام PS:DB كوسيلة النمو الجرثومي. إذا كان يتم استخدام وسائل الإعلام الأخرى، قد يكون ضروريا لتنفيذ عنصر تحكم وسائل الإعلام فقط نمو التي توجد فيها أي من الخلايا البكتيرية الحالية للتحقق من أن المتوسط متوافق مع الزحارية.

ويمكن توسيع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KP وكما كتب وتنقيح هذه المخطوطة. KP إجراء التجارب والتحليل. وأيده هذا العمل على "جائزة الانتقال الوظيفي المعاهد الوطنية للصحة" (NIH) (K22AI112816) إلى as.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Recodes
Bacto agar ، مجففBD Difco214010
Antibiotic-Antimicotic (100X)Life Technologies15240062Aliquot < 1 مل وتخزينها عند -20 درجة ؛ C
كالسيسين-أسيتوكسي ميثيل إستر (كالسين-AM)Life TechnologiesC34852الكالسين أسيتوكسي ميثيل (AM)
كلوريد الكالسيوم ، اللامائيسيجما ألدريتشC1016
D-جلوكوزفيشر الكيميائيةD16500سكر العنب
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتشD5879
حمض الفوليكسيجما ألدريتشF8758
LB-MillerBD Difco244620
كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM8266
مستخلص الخميرةOxoidLP0021
الببتون الخاصOxoidLP0072
هيروكسيد البوتاسيومفيشر الكيميائيP250
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة   ؛سيجما ألدريتشP0662
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي هيدراتفيشر كيميكالS373
فيتامين ب 12سيجما ألدريتشV2876
<قوي>سلالات< قوية> مختبر
الديكتيوستيليومسيريابورنسلالة AX318< / sup>
الإشريكية القولونيةمختبر Siryapornسلالة B / r 17 < / sup>
Pseudomonas aeruginosaمختبر Siryaporn مختبرPA14PA14 سلالة 19< / sup>
Pseudomonas aeruginosa & Delta ؛ lasRSiryaporn labAFS20.1PA14 مشتقة من سلالة 20< / sup>
Supplies< / strong>
0.22 & micro ؛ مرشح M ميليبور SCGPT01REلتعقيم الفلتر
أنبوب مخروطي ، 15 ملزجاجات تخزين زجاجية 352097
كورنينج بيركس13951 لتر250 مل ، 500 مل ، 1000 مل
طبق بتري ، قطر 6 سم351007 كورنينج60 × 15 مم ألواح البوليسترين طبق
بتري ، قطر 10 سمFB0875712فيشر ألواح البوليسترين 100 × 15 مم
حاويات بلاستيكية بغطاءZiploc2.57E + 09حاويات مربعة سعة 3 أكواب أطباق
زجاجيةBio-Rad1653308لتحضير وسادات الأجار. يمكن استخدام ألواح زجاجية أخرى بأبعاد مماثلة.
عصي خشبيةفيشر23-400-102 
<قوي> المعدات< قوي>
Eclipse Ti-E المجهر إعداد مجهرMEA53100نيكون
10X خطة Fluor Ph1 objective  0.3 NAمجهرMRH20101 نيكون
مصدر الإثارة الفلوريةمحرك ضوء LumencorSolaإعداد المجهر
مجموعة مرشح التألقSemrockLED-DA/FI/TX-3X3M-A-000 إعداد المجهر
Orca Flash 4.0 V2 CameraHamamatsu77054098إعداد المجهر
ImageJNIHv. 1.49برنامج لتحليل الصور
MATLABMathworksR2013برنامج لتحليل الصور
حاضنة شاكر مداريVWR89032-092لنمو البكتيريا عند 37 درجة ؛ C
منصة شاكرفيشر13-687-700لنمو الأميبات عند 22 درجة ؛ C
مقياس الطيفBiochromUltrospec 10
حاضنة مبردة UndercounterFisher97990Eلنمو الأميبات عند 22 درجة ؛ C
Isotemp waterbath فيشر15-462-21Qلتبريد الوسائط إلى 55 درجة ؛ ج
إعداد الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rasko, D. A., Sperandio, V. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease. Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).
  2. Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).
  3. Alibaud, L., et al. Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model. Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).
  4. Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).
  5. Cosson, P., et al. Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System. Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).
  6. Pukatzki, S., et al. Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).
  7. Steinert, M., Heuner, K. Dictyostelium as host model for pathogenesis. Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).
  8. Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella. Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).
  9. Matz, C., et al. Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae. ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).
  10. Hauser, A. R. The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).
  11. Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58(1990).
  12. Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes. Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).
  13. Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).
  14. Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).
  15. Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).
  16. Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality. Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).
  17. Witkin, E. M. Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).
  18. Loomis, W. F. Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues. Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).
  19. Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals. Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).
  20. O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AM Pseudomonas aeruginosa

مقالات ذات صلة