مقالة منهجية

أسلوب الغازية لتفعيل المغزلي المسنن الماوس بتحفيز عالية التردد

7.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57857

⸱

يونيو 2, 2018

 , 
1Department of Neurobiology, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, 2Key Laboratory of Neuroregeneration, Co-innovation Center of Neuroregeneration, Nantong University

في هذه المقالة

ملخص

هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد طريقة أسر موثوقة في الفئران. يتم تحفيز الخلايا العصبية في جميع أنحاء المغزلي المسنن هيبوكامبال كهربائياً بأسر مباشرة وغير مباشرة في فيفو. نشاط الخلايا العصبية والإشارات الجزيئية هي دراسة ج-المنحدر وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت Notch1، على التوالي؛ هو كمية الخلايا من بروموديوكسيوريديني وسم المقايسة.

الملخص

وقد ثبت التحفيز عالية التردد الكهربائي (أسر)، استخدام أقطاب مزروع استهداف مناطق مختلفة في الدماغ، كعلاج فعال للاضطرابات العصبية والنفسية المختلفة. أسر في المنطقة العميقة من الدماغ، وتسمى أيضا تحفيز الدماغ العميق (DBS)، تزداد أهمية في التجارب السريرية. وقد بدأ التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجال عالية التردد (HF-DBS) DBS الجراحة انتشار إمكانية الاستفادة من هذا الأسلوب الغازية في حالات أخرى، مثل العلاج لاضطراب الاكتئاب الكبرى (MDD)، الوسواس القهري (OCD)، وما إلى ذلك في.

وعلى الرغم من هذه المؤشرات الآخذة في التوسع، تظل الآليات الكامنة من الآثار المفيدة للتردد DBS ملغز. ولمعالجة هذه المسألة، هو نهج واحد استخدام أقطاب مزروع بتنشيط الفئات السكانية الفرعية الموزعة من الخلايا العصبية من أسر قليلة. وأفيد أن أسر في نواة المهاد الأمامي يمكن أن تستخدم لعلاج الصرع المقاوم للحرارة في العيادة. قد تكون مرتبطة بالخلايا زيادة الآليات الكامنة وتغيير نشاط الخلايا العصبية. ولذلك، نحن مهتمون باستكشاف التغيرات الفسيولوجية بالكشف عن نشاط الخلايا العصبية، فضلا عن الخلايا في الماوس المغزلي المسنن (DG) قبل وبعد العلاج أسر.

في هذه المخطوطة، يصف لنا منهجيات لأسر لاستهداف التنشيط للمدير العام في الفئران، مباشرة أو غير مباشرة وعلى نحو حاد أو مزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد شرائح المخ ج-المنحدر و Notch1 إيممونوفلوريسسينت تلطيخ لمراقبة نشاط الخلايا العصبية والإشارات التنشيط وبروموديوكسيوريديني (بردو) وضع العلامات لتحديد الخلايا بعد التعريفي DBS التردد. تفعيل نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد العلاج HF DBS توفر دليل مباشر على العصبية الحيوية والفوائد العلاجية. وخاصة هذه المنهجية يمكن تعديلها وتطبيقها لاستهداف المناطق الدماغ المهتمة الأخرى مثل ganglia القاعدية والمناطق سوبثالاميك لاضطرابات الدماغ محددة في العيادة.

المقدمة

DBS التردد هو تقنية الجراحة العصبية للتحفيز الكهربائي في الدماغ، والتي وضعت منذ 1870s1. في أواخر الثمانينات، أولاً كأسر تدخل علاجي محتمل لمرض باركنسون واضطرابات الحركة الأخرى2. في العقود القليلة الماضية، استخدمت HF DBS أكثر وأكثر على نطاق واسع في علاج اضطرابات الدماغ التي حاليا غير قابل للعلاج باستراتيجية علاجية تقليدية. خاصة، نظراً لتحسين دقة مسرى أسر ونتائج فعالة للغاية، والحد الأدنى من الآثار الجانبية، اضطرابات الدماغ يعالجها DBS التردد إلى حد كبير زاد العدد على مدى عقود3،4، 5. على سبيل المثال، وافقت DBS التردد "لنا الغذاء" والدواء (FDA) لعلاج مرض باركنسون (PD) ونوع الخرف مرض الزهايمر والهزة الأساسية وأنواع أخرى من حركة اضطرابات2،6، 7. في المرضى PD، يخفض الدواء تتميز تصل إلى 50% خلال DBS التردد8. بالإضافة إلى نجاح العلاج من اضطرابات الحركة، أثبت DBS التردد أيضا لها آثار قوية في علاج الأمراض النفسية في العيادة، والتعزيز المعرفي ك9جيدا2،، 10 , 11-تجدر الإشارة إلى أن البحوث المتعلقة بأمن الأسرة المعيشية الغذائي لعلاج الاضطرابات النفسية الأخرى في مراحل مختلفة، تقدم الكثير من الوعود للمرضى12.

على الرغم من أن العديد من الدراسات أظهرت أن أسر المحورية قد الآثار البعيدة والمحلية في جميع أنحاء الدماغ13، تظل الآليات العصبية والجزيئية للآثار بعيدة المنال2،14. تطبق DBS HF العلاجية في العيادة، عادة بطريقة طويلة الأجل للعلاج مرض باركنسون، والألم المزمن، إلخ وتطرح العديد من الآراء لشرح تحسين تولدها معاملة DBS التردد، بين فيه إمكانية واحدة أن أمن الأسرة المعيشية الغذائي الحالي ينظم نشاط شبكة الخلايا العصبية، ربما قبل ديبولاريزيشن متكررة من محاور عصبية محيط القطب أسر مزروع. أو DBS التردد قد يتغير معدل أداء الخلايا العصبية النواتج والأهداف المتوقعة. أيضا، قد يؤدي التردد DBS التغييرات متشابك طويلة الأجل، بما في ذلك التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) والاكتئاب الطويل الأجل (المحدودة)، والتي قد تسهم في حدوث تحسن أعراض. وحتى الآن، أنها مازال من غير الواضح ما إذا كانت عمليات أسر influences الأحداث الرئيسية الجزيئية التي تنظم الخلوية مثل كالكبار الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت عدة أسطر من الدراسات أن أسر في القوارض يمكن أن تحاكي مماثلة الاستجابات العصبية سريرياً التطبيقية DBS15،16. لفهم الآليات الخلوية الكامنة من التردد-DBS، في هذه الدراسة، نحن أولاً إعداد في فيفو أسر المنهجية في الفئران في الحادة (يوم واحد) أو طريقة المزمن (خمسة أيام). ثانيا، نحن إعداد منهجية تحليل التنشيط لتحديد تغيير نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد تسليم DBS التردد.

نظراً لأن إنتاج الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية وفيرة أثناء التطور الجنيني ولكن يستمر طوال حياة الكبار، منطقة سوبجرانولار هيبوكامبال هي واحدة من المجالات الرئيسية التي تحدث فيها الخلايا. عملية الخلايا يتأثر بالعديد من العوامل الفسيولوجية والمرضية. وفي بعض الحالات الصرع، هو الخلايا هيبوكامبال انخفاض كبير17،18. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج اليكتروكونفولسيفي واحد إلى زيادة كبيرة في إنتاج الخلايا العصبية في المغزلي المسنن19. هذه الملاحظات تشير إلى أن النشاط الكهربية يلعب دوراً حاسما في تنظيم الخلايا الكبار واللدونه متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال. ولذلك، زيادة توضيح آثار DBS التردد على نشاط الخلايا العصبية والخلايا، أولاً نقوم بتنفيذ مقايسة immunostaining من فوري مطلع الجينات (IEG) ج-المنحدر الذي علامة معروفة لنشاط الخلايا العصبية القصيرة الأجل الناجمة عن تجربة20. أيضا يتم الكشف عن الإشارات Notch1 لمراقبة تفعيل إشارات بعد21،التسليم أسر22. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا الكشف عن إنتاج الخلايا العصبية قبل بردو وسم التحليل بعد التعريفي DBS التردد بطرق مختلفة، على الرغم من تلطيخ بردو يمكن أن يكون أيضا علامة على جليوجينيسيس.

في هذه الدراسة، منهجيتين أسر يتم تكييفها لاستهداف تفعيل هيبوكامبال المدير العام مباشرة وغير مباشرة. مسرى مزروع إلى المدير العام مباشرة أو مزروع في المسار بيرفورانت الآنسي (PP) الذي يرسل إسقاطات لتنشيط الخلايا العصبية المديرية العامة. لتحريض DBS التردد، يرد مشجعا لبرمجة لتحفيز مستمر عبر مسرى الثابتة إلى رأس الماوس. لتحديد آثار أسر على تنشيط الخلايا العصبية، والخلايا، يمكننا الكشف عن التعبير عن ج-المنحدر و Notch1 بصبغة إيمونوفلوريسسينت وعدد بردو إدراج الخلايا العصبية الإيجابية في منطقة المديرية العامة هيبوكامبال، على التوالي، بعد علاج أسر. خاصة، هي مقارنة آثار التردد-DBS على الخلايا في المدير العام بين الحادة وطريقة تحفيز مزمنة، أو بين مباشر وطريقة تحفيز غير مباشر، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الإجراءات التجريبية الحيوانية المبادئ التوجيهية المؤسسية في "بكين معهد للعلوم الطبية الأساسية" (بيجين، الصين) واللوائح الحكومية الصينية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الفئران (26 من الذكور، الكبار ~ 30 جرام) تم إيواء وتحفظ في درجة حرارة ثابتة من 23 درجة مئوية، مع الماء والغذاء إعلانية libitum، تحت 12-ح دورة الظلام الضوء/12-ح (الأنوار في الساعة 07:00 ص). وأجريت جميع الإجراءات التجريبية خلال دورة خفيفة.

1-إعداد الجراحية

ملاحظة: قطب كهربائي مخصص كانت محلية الصنع باستخدام الأسلوب تعديل من هالبيرن للتقرير23.

  1. استخدام 2 مايكرو-الأسلاك النحاسية (مع قطر خارجي من 200 ميكرومتر) كمسري القطبين موازية. التفاف الأقطاب حول بعضها البعض لتشكل أقطاب أسطواني للتحفيز.
    ملاحظة: هنا، قد تباينت طول قطب كهربائي داخل PP أو المديرية العامة حسب عمق النواة التشريحية.
  2. تعقيم أقطاب كهربائية باستخدام وزراء تطهير أكسيد الإيثيلين. معالجة وتخزين أقطاب كهربائية صغيرة من الأسلاك 2-قناة محلية الصنع دون أي تلوث. ينبغي أن تكون الأقطاب دقة تعقيمها قبل أي زرع جراحية.
  3. اﻷوتوكﻻف الأدوات الجراحية.
  4. قبل الجراحة، حقن الماوس مع بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ) إينترابيريتونيلي، لتحقيق طائرة جراحية التخدير.
  5. حقن الماوس مع تعليق والبروكايين عقيمة بنسلين G (75,000 يو، الدردشة) وعامل مسكن لتقليل خطر الإصابة بالالتهابات والألم، على التوالي24(والايبوبروفين، 0.05-1 مغ/كغ، اتفاقية استكهولم).
  6. بعد التخدير الحيوانية، تطبق تشحيم عين لكلتا العينين لمنع جفاف العين. ضمان إدخال التخدير وعمق التخدير بردود الفعل للحيوان في الاستجابة أخمص القدمين معسر، والمضي قدما في هذه العملية فقط عند حدوث أي استجابة.
    ملاحظة: مرهم الطبيب البيطري خيار آخر لمنع جفاف العين.
  7. حلق معظم الفراء على قمة رأسه الماوس مع مقص الشعر كهربائية أو شفرة حلاقة وتعقيم منطقة حلق مع ثلاثة يدعك متناوبة من محلول الكحول وتدين 70% والمضي قدما في العملية بعد تدين قد جفت على الجلد.

2-عالية التردد التحفيز جراحة25،26

ملاحظة: في هذه الخطوة، قطب مزروع من جانب واحد إلى المديرية العامة الظهرية أو الآنسي PP منطقة أو جزء من الحصين بأدوار حاسمة في العرضية التعلم والذاكرة.

  1. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على الإطار المناظير باستخدام الأشعة. للاحتفاظ برأس الماوس غير متحرك، محاذاة أشرطة الإذن بشكل صحيح وتثبيتها بسرعة. تشديد القضبان الإذن بلطف حيث أن دعم رئيس مركزة وتأمين الماوس قليلاً.
  2. استخدم وسادة ترموستاتي للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان في 37 ± 0.5 درجة مئوية.
  3. استخدام الملقط لفهم الجلد عرفت آذان الفأر وقطع عليه مع مقص معقم لإزالة حول منطقة 1 سم2 من الجلد على رأس الجمجمة الماوس.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة كمية صغيرة من النزيف على طول حواف قطع الجلد.
  4. إزالة العضلات والمرفقات الأخرى تعلوها الجمجمة مع مسحه القطن تعريض سطح الجمجمة. استخدام مسحه القطن وازميل تشريح لتنظيف جميع السمحاق والاوتار والأنسجة الضامة من السطح تماما للتعرف السهمي في الجمجمة وخطوط خيوط لامدا.
  5. تحديد بريجما ونقطة لامدا. تقاطع خياطة كرونال وخياطة السهمي في الجزء الأوسط متفوقة كالفاريا حيث يقع بريجما. تقاطع خياطة لامبدويد بخياطة السهمي حيث مرئياً لامدا. استخدم في بريجما كنقطة الأصل لتعيين الموضع نواة أخرى.
  6. بعد تحديد موقف بريجما وامدا في الجمجمة، ضبط هاتين النقطتين في المستوى الأفقي. تأكد من أن ارتفاع هاتين النقطتين هو نفسه تقريبا في الاتجاه الظهري البطني (أي أخطاء ينبغي < 0.05 مم). أيضا، تأكد من أن الجمجمة مستوى في الاتجاه الجانبي الآنسي ب الطريقة ذاتها26.
  7. لعملية جراحية في جانب واحد، جبل قطب 2-قناة نحاس أسلاك صغيرة محلية صنع في حامل القطب التناوب على الإطار جراحي المناظير باستخدام الأشعة.
  8. ضع مسرى رأسياً أعلى نقطة بريجما في البداية، ووضعه في الموقع الأصلي. استخدام الرقمية عرض الإطار جراحي المناظير باستخدام الأشعة للإشارة إلى الأمامي الخلفي (AP)، الآنسي الجانبي (حركة التحرير)، ومواقع دورسو البطني (DV).
    ملاحظة: لمنع الحصول على بنت مسرى، لا تلمس طرف القطب على الجمجمة أثناء العملية.
  9. نقل مسرى بلطف إلى الموضع الصحيح (الشكل 1A، AP-2.1/ML ± 1.0 للمديرية العامة ووكالة اسوشييتد برس-3.8/ML ± 3.0 لمؤتمر المندوبين المفوضين، على التوالي)27 أعلاه الجمجمة دون أي اتصال. عندما تم تحديد الموقع المطلوب للإدراج القطب، استخدام التعديلات المناظير باستخدام الأشعة دورسوفينترال إلى أعلى حامل الأقطاب، ووضع علامة على موضع علامة سوداء.
    ملاحظة: قد تختلف الموقع الدقيق إشارة إلى إحداثيات ستيريوتاكسيك بضغط الماوس، والوزن، والجنس. وينبغي استخدام الفئران البالغين من نفس الجنس التقليل إلى أدنى حد من أي تباين في الموقع. إذا كان ذلك ممكناً، ينبغي أن تستخدم الأشعة التشريحية السابقة للتشغيل لتحديد موقع أساس موضوع فردية27.
  10. استخدام حفر ميكرومانيبولاتور ساعد اليد (لدغ الحجم = 0.5 مم) لجعل الثقوب لدغ في موقف واضح التحديد. تعقيم غيض لدغ مع الإيثانول 70% قبل الحفر. تحريك لأعلى مثقاب مصغرة من خلال الجمجمة على طول محور ع 0.8-1.0 مم دون تغيير موقفها س-ص. استخدم من القطن معقم لوقف أي نزيف أثناء العملية.
    ملاحظة: لتجنب توليد الحرارة المفرطة والإفراط الحفر أثناء الحفر، ضمان سرعة الحفر 15,000-18,000 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة)، وكثيراً ما تسحب مثقاب من ثقب لدغ كل s 8-10.
  11. الاحتفاظ بالحفر حتى يتم كشفها في بلده دوراً. استخدام إبرة عازمة على إزالة أي قصاصات العظام التي يتم إنشاؤها أثناء الحفر وجعل ثقب في بلده دوراً دون إلحاق الضرر بالانسجة الناعمة الدماغ الكامنة.
    ملاحظة: لتجنب إتلاف أنسجة المخ، الإبرة كليلة بنت يمكن أيضا الاستعاضة ملقط حادة غرامة.
  12. للتأكد من أن الثقوب لدغ بذلت بشكل صحيح عند الموضع المطلوب، الحد من ارتفاع القطب بتعديل الإطار جراحة المناظير باستخدام الأشعة والتأكد من أنه يمكن إدراج مسرى بسلاسة من خلال ثقب لدغ دون لمس أي عقبات. إذا كان الأمر كذلك، ببطء إدراج الأقطاب بعمق 1.8 مم للمدير العام (أو 3.0 ملم ل PP) من سطح الجمجمة يقع في PP الآنسي إلى المدير العام (PP-المديرية العامة).
    ملاحظة: تمحو أي النخاعي أو الدم إلى الخارج من الثقوب لدغ مع القطن المعقمة أثناء عملية زرع قطب كهربائي.
  13. بعد إدراج الصغرى-السلك الكهربائي في ثقب الجمجمة، الاحتفاظ بها في مكان مع الأسمنت الأسنان الكافية باستخدام ملعقة صغيرة. كما يمسك الأسمنت، العفن حول القطب المدرج ومسامير شكل قبعة ناعمة لطيفة. ديبريدي وتطهير حواف الجرح.
  14. فك الارتباط من صاحب القطب الكهربائي. إزالة الماوس من الإطار المناظير باستخدام الأشعة وإعادته إلى قفص حارة.
    ملاحظة: بعد الجراحة، وانتظر بإعادة الحيوانات إلى اقفاصها حتى أنهم شفوا تماما من التخدير مع الوعي الكافي.
  15. واسمحوا الماوس تتحرك بحرية والسماح لها باستعادة لمدة يومين في القفص. ثم، الاتصال الكهربائي مزروع في الماوس يؤدي الدماغ إلى مشجعا لبرمجة عن طريق . إعداد واجهة البرنامج كما وردت في الشكل 2. تعيين معلمات أسر كسلسلة 6 قطارات 6 6 نبضات في 400 هرتز (الشكل 1ب، 100 مللي ثانية بين القطارات، 20 ثانية بين السلسلة)28. تعيين كثافة التحفيز 200 μA.
  16. تسليم أسر للفترة الزمنية المحددة المطلوب. تقديم تحفيز 2 x يوم من الساعة 08:00 ص والساعة 08:00 م
  17. لمجموعة المراقبة، زرع أقطاب كهربائية في الفئران ولا تقوم تحفيز.
  18. لتلطيخ ج-المنحدر ، حفز الفئران التجريبية حادة (x 2 في اليوم الواحد). لوسم بردو، تقسيم الفئران التجريبية إلى فريق تحفيز حادة (تطبيق x 2 في اليوم الواحد) ومجموعة تحفيز مزمن (تطبيق x 10 في 5 أيام، x 2 في اليوم الواحد). أثناء التنشيط، تأكد من الفأر مستيقظا. تذكر لضمان لا يتم الملتوية العملاء المتوقعين.
    ملاحظة: في اليوم الأخير من الإجراء، الفئران في المجموعة التحفيز الحادة قد حفز في نفس الوقت.
  19. عندما يتم التنشيط، بعناية قطع دبوس القطب صاحب القطب وموصل نظام التسجيل.

3-الفلورة تلطيخ وبروموديوكسيوريديني وسم29

  1. ج-المنحدر وتلطيخ Notch1، حوالي 3 ح بعد تنشيط DBS التردد الأخير، تخدير الفئران عن طريق حقن بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ، القائمة) لتحقيق طائرة جراحية التخدير.
  2. لوسم بردو، تعطي حوالي 12 ساعة بعد تنشيط DBS التردد الأخير، 6 حقن بردو لعنصر التحكم وحفز الفئران على فترات 2-ح (50 مغ/كغ في المحلول الملحي 0.9 ٪، القائمة). ح 36 بعد الحقن الماضي، تخدير الفئران عن طريق حقن بينتوباربيتال (20-50 مغ/كغ، القائمة) لتحقيق طائرة جراحية.
  3. جعل شقوق باستخدام مشرط عن طريق القفص الصدري لفضح القلب وثم تمرير إبرة 22-قياس التروية حادة إلى البطين الأيسر. إجراء شق صغير في الاذين الأيمن. ترانسكارديالي نتخلل أنه مع 50 مل من البرد مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) تليها 50 مل من البرد بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x (الرقم الهيدروجيني 7.4).
    ملاحظة: التبديل في برنامج تلفزيوني لمنهاج عمل بيجين عندما يتم استبداله الماوس الدم في فيفو ويعمل السائل واضحة. يمكن الحكم التروية جيدة بتطهير الكبد. يجب أن تتوقف التروية بمجرد التثبيت الهزات قد لوحظت30.
  4. قطع رأس الماوس مع مقص العيون، وجعل شق في الجلد وفضح الجمجمة. استخدام الملقط، رقاقة قبالة الجمجمة قليلاً وتشريح الدماغ الماوس كله بعناية. الوظيفة-fix الدماغ في بارافورمالدهيد 4% لمدة 2 يوما إضافيا، وأنه نقل إلى حل سكروز 30% في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  5. استخدام كريوستات، قطع العقول إلى أقسام الاكليلية 20 ميكرومتر. نقل وتحميل المقاطع على الشريحة الزجاجية بواسطة فرشاة وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    ملاحظة: سيتم استبعاد الحيوانات مع ميسبلاسيمينتس قطب كهربائي أو المفرطة أضرار ميكانيكية من التحليل اللاحق.
  6. نقل الشرائح إلى برنامج تلفزيوني العادي (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.4) التي تحتوي على لا مثبت. تغسل الشرائح مع برنامج تلفزيوني ل x 3-4 لمدة 5 دقائق في كل منهما لإزالة أي مثبت الزائدة. المجموعة المسماة بردو، احتضان المقاطع في HCl 2-N لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وشطف لهم في المخزن مؤقت بورات 0.1-M (pH 8.4؛ 10 دقيقة). ثم تغسل شرائح 2 x لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: ثم يتم تنفيذ إيمونوستاينينج.
  7. التعامل مع الشرائح بالحضانة في عرقلة الحل (مصل الماعز العادي 1%، 3% ألبومين المصل البقري < جيش صرب البوسنة >، 0.5% Triton X-100 و 0.02 في المائة الصوديوم أزيد في برنامج تلفزيوني 1 x) ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT).
  8. احتضان الشرائح مع مكافحة-ج-المنحدر [بولكلونل] جسم (1: 500؛ أرنب) أو الأجسام المضادة Notch1 (01:50؛ والماعز) أو جسم بردو المضادة (1:800؛ فأر) في عرقلة الحل في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  9. تغسل شرائح 3 x في برنامج تلفزيوني، ثم احتضانها لهم مع أليكسا فلور 568 مترافق الأرنب المضادة (1: 500)، الماعز المضادة مترافق أليكسا فلور 488 (1:1، 000)، أو جسم أليكسا فلور 488 مترافق مكافحة الفئران (1: 500) الثانوية ح 1 في الرايت
  10. تغسل العينات 3 x في برنامج تلفزيوني (10 دقيقة في كل مرة). وتغطي الأجزاء الدماغ المسمى المناعية استخدام وسيلة تصاعد كاشف تتلاشى المضادة التي تحتوي على DAPI. واسمحوا شرائح أيردري وتخزينها في محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
  11. الحصول على صور للمناطق هيبوكامبال من الجانبين unstimulated وحفز الدماغ مع قناة متعددة عالية الدقة (متسلسلة) المسح مجهر [كنفوكل]. تعيين معلمات التصوير دائماً بين السيطرة والمجموعات التجريبية.
  12. القيام تصوير فسيفساء استخدام هدفا عالية التكبير (X 20 الهواء الهدف، نا 0.45) للحصول على الصور (XYZ) 3D المستمر من الحقول المتاخمة للعرض باستخدام مرحلة يجهز والاستفادة من البرامج المناسبة لغرزة معا لجعل مركب كبير الصور.
    ملاحظة: تشمل وظائف التبليط خياطة صحيحاً وتجانس الخيارات لتحسين الصور سلس. مركب الصور بسرعة وسهولة تعد باستخدام الدالة خياطة، لتشكل صورة على امتداد منطقة واسعة.
  13. ج-المنحدر وتلطيخ Notch1، القيام بتحليل كمي نوى إيجابية ل الكثافة إيمونوفلوريسسينت21 من الصور مخيط. عشوائياً تحديد 3 مناطق في المناطق الفرعية DG هيبوكامبال روسترال والظهري والبطني وقياس كثافة إيمونوفلوريسسينت بطريقة مزدوجة أعمى استخدام ي الصورة البرمجيات (http://rsb.info.nih.gov/ij/)31.
  14. بردو وضع العلامات، تحليل الشرائح حول نقطة الحفر عن طريق الحصين الظهرية (مم-1.70 مم-2.70 بالنسبة بريجما) بطريقة مزدوجة أعمى.
  15. عد فقط بردو-إيجابية الخلايا العصبية في المدير العام. وتشمل الخلايا الواقعة داخل أقطار 2-خلية من الخلايا الحبيبية في العد.
    ملاحظة: هنا، عد أجرى استخدام 40 × الهدف الجوي. عشوائياً، أحصى أبواب 3-5 للحيوان الواحد، وبلغ متوسط التهم والتعبير عنها كوسيلة للمديرية العامة19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد تنشيط DBS التردد إلى منطقة هيبوكامبال المديرية العامة مباشرة أو PP المنطقة دون الإقليمية تفعيل المديرية العامة شكل غير مباشر عن طريق إدراج أقطاب استخدام التعديلات المناظير باستخدام الأشعة، القوارض تم تخديره مع بينتوباربيتال وأخذت منها عينات ح 3 بعد تنشيط DBS التردد الماضي ج-المنحدر و Notch1 immunostaining. لتلطيخ بردو، ح 36 بعد حقن بردو الماضي بعد يوم 1 أو 5 أيام من التحفيز DBS التردد، وتم تخديره القوارض مع بينتوباربيتال للتحضير لأقسام الدماغ. ويبين

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قد استخدمت تقنية DBS التردد على نطاق واسع كأداة قوية لعلاج العديد من الاضطرابات العصبية منذ التسعينات. حتى الآن، عمل تاريخي DBS التردد لعلاج مرض باركنسون والهزة الأساسية، التي جذبت الكثير من الاهتمام والمصلحة في العيادة والمجتمع العلمي على حد سواء. وهناك أنواع مختلفة من الدراسات الجارية بالتردد-DBS بالعديد من المجموعات للتطبيق ذات التردد العالي-DBS العلاجية في بعض الاضطرابات العصبية والنفسية32،33. وبعض هذه الدراسات حاليا في مراحل مختلفة من التجارب السريرية

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بإعلان.

شكر وتقدير

وبدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية لمنح الصين 31522029 و 31770929 و 31371149 (إلى وو هايتاو)، برنامج 973 (2014CB542203) من برنامج الدولة الإنمائية الرئيسية للبحوث الأساسية للصين (إلى هايتاو وو)، ومنحة Z161100000216154 من بكين البلدية لجنة العلم والتكنولوجيا (إلى هايتاو وو). يشكر المؤلفون جميع أعضاء المختبر هايتاو وو لتشجيعهم والمناقشات. الكتاب ممتنون جداً جينوي ليو لمساعدته مع التصحيح على جهاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أداة تجسيمية للدماغStoelting51730Dزرع تجسيمي داخل الجمجمة لأنظمة
محفزالفأرنموذج 3800MultiStim 8-Channel محفز قابل للبرمجة
حفار الأسنانSaeshin Precision Co.، LtdSTRONG 90للحفر وبضع التكرين   ؛
بورمايسينجرHM1 005 #للحفر وبضع التلوين   ؛
Digidata 1550 DigitizerMolecularDevices AXON 1550الحصول على البيانات عالية الدقة
CryotomeThermo Fisher ScientificThermo Cryotome FSEقطع الأجزاء المجمدة من العينات
المجهر متحد البؤرOlympusFV-1200اليابان ، مع هدف 20x (NA 0.45)
أدوات جراحة الفأرFST14084-08،11254-20،16109-14مقص ، ملقط ، قاطع عظام ، حوامل ، إلخ.
بنتوباربيتال الصوديومR & أنظمة D457920-50 ملغ / كجم لحقن
IP. البنسلين G & nbsp ؛Sigma-AldrichP303275,000 U لحقن
IM CarprofenSigma-AldrichSML17135-10mg / kg ، لحقن SC
4٪ Paraformaldehyde (PFA) BeijingSolarbio Sci-Tech Co.   ؛P1110لتثبيت الأنسجة
عازلة الفوسفات (PBS)Invitrogen10010023pH7.4 ، 500 مل في تخزين
Tissue-Tek O.C.T. مركبSakura4583تركيبة الجليكول والراتنجات القابلة للذوبان في الماء
الأجسام المضادة BrdUAbcamab6326التخفيفات: 1/800
الجسم المضاد المضاد ل c-fosAbcamab209794التخفيفات:1/500
الماعز المضاد للأرانب IgG (Alexa Fluor 568)Thermo Fisher ScientificA11036التخفيفات: 1/500
الحمار المضاد للفئران IgG (Alexa Fluor 488)Jackson ImmunoResearch712-546-150التخفيفات: 1/500
وسيط تركيب مضاد للبهتان معمختبرات ناقلاتH-1200مضاد للبقع مع
الجسم المضاد DAPI المضاد للشق 1 (C-20)سانتا كروز للتكنولوجياالحيويةSC-6014التخفيفات: 1/50
الحمار المضاد للماعز IgG (Alexa Fluor 488)Abcamab150073التخفيفات: 1/1000
محلول تخزين DAPI

المراجع

  1. Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
  2. Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
  3. Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214(2014).
  4. Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
  5. Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
  6. Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
  7. Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson's disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
  8. Garcia, L., D'Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson's disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
  9. Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
  10. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
  11. Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
  12. Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
  13. McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
  14. Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric - principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
  15. Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
  16. Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457(2015).
  17. Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, Suppl 5 26-41 (2008).
  18. Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
  19. Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
  20. Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35(2010).
  21. Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
  22. Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
  23. Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
  24. Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266(2016).
  25. Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066(2015).
  26. Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
  27. Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6(2007).
  28. McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
  29. Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
  30. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  31. Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220(2014).
  32. Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2(2012).
  33. Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
  34. Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer's disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
  35. Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
  36. Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. 2015 (11), Cold Spring Harbor Protocols. 951-969 (2015).
  37. Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37(2014).
  38. Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
  39. Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BrdU c fos Notch1

مقالات ذات صلة