مقالة منهجية

طويلة الأمد في فيفو تتبع ديناميات الخلايا التحريضية داخل الخوادر المورفولوجية

12.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/57871

⸱

يونيو 14, 2018

 ,  ,  , 
1School of Biochemistry, Biomedical Sciences, University of Bristol, 2School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences, University of Bristol, 3MRC Centre for Inflammation Research, University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, 4School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences, University of Bristol

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لإصلاح الجرح العيش-التصوير والاستجابة الالتهابية المرتبطة بها في عالية الدقة الزمانية في فيفو. هذا الأسلوب يستخدم الخوادر مرحلة التنمية المورفولوجية لتمكين الطويلة الأجل التصوير وتعقب السكان خلية معينة على مر الزمن ومتوافق مع الجينات بوساطة [رني] كفاءة المنظمة.

الملخص

خلال الاستجابة الالتهابية السريع إلى تلف الأنسجة، وخلايا نظام المناعة الفطرية يجند بسرعة إلى موقع الإصابة. مرة واحدة في الجرح، خلايا المناعة الفطرية أداء عدد من الوظائف الأساسية، مثل مكافحة العدوى وإزالة الأنقاض نخرية، وحفز ترسب مصفوفة. أجل الفهم الكامل لإحداث إشارات المتنوعة التي تنظم هذه الاستجابة المناعية، من الأهمية بمكان أن تلتزم بالسلوكيات المعقدة (والتفاعلات التي تحدث بين) متعددة الخلية السلالات الحية، وفي الوقت الحقيقي، مع الارتفاع القرار الزمانية. الشفافية الضوئية والصوبه الوراثية للأجنة المورفولوجية أقامت المورفولوجية كنموذج لا تقدر بثمن للعيش والصورة وتشريح الجوانب الأساسية لسلوك الخلايا التحريضية، بما في ذلك آليات تشتت التنموية، إزالة الجثث أبوبتوتيك و/أو مسببات الأمراض الميكروبية، والتجنيد للجروح. بيد العمل الأخيرة قد أثبتت الآن أن تستخدم في مرحلة لاحقة في دورة حياة المورفولوجية – عذراء المورفولوجية – يوفر عددا من المزايا المتميزة، بما في ذلك تحسين كفاءة [رني]، التصوير فترات أطول و عدد الخلايا المناعية أكبر كثيرا. يصف لنا هنا بروتوكولا لإصلاح الجرح التصوير والاستجابة الالتهابية المرتبطة بدقة عالية الزمانية في العيش المورفولوجية الخوادر. متابعة دينامية إعادة ابيثيلياليزيشن والتهاب، نستخدم عدد محدد في فيفو علامات مضيئة لكل من ظهارة وخلايا المناعة الفطرية. ونحن أيضا إثبات فعالية fluorophores الصور القابلة للتحويل، مثل كايد، لأثر مجموعات فرعية محددة الخلايا المناعية، لتعقب سلوكهم عندما تهاجر إلى، والعزم من موقع الإصابة.

المقدمة

استجابة تحريضية الكفء والفعال محوري لأي كائن حي مكافحة العدوى وإزالة الأنقاض، وتنسق إصلاح أنسجة المصابين1. ورغم أن هذا الرد نتيجة حتمية لمعظم تلف الأنسجة، التهاب يتطلب التنظيم الصارم لأنه قد ربط استجابة التهابية غير ملائمة لمجموعة متنوعة من الأمراض البشرية المختلفة (بما في ذلك عدم شفاء الجروح المزمنة، تندب المفرط، والاستعداد للإصابة بالسرطان)1،،من23. ونظرا لهذه الأهمية السريرية، من الأهمية بمكان التوصل إلى فهم أكثر تفصيلاً للآليات الجزيئية والخلوية قيادة الاستجابة الالتهابية من أجل وضع استراتيجيات لعلاج طائفة من المزمنة تحريضية ومؤشرات تشخيصية جديدة الظروف التي قد تحمي الأنسجة إصلاح من التهاب مطولة وغير ضرورية.

وفي السنوات الأخيرة، أصبحت المورفولوجية نظام الراسخة والقيم نموذجية تشريح سمات أساسية للاستجابة الالتهابية المصانة من الحشرات ل البشرية4،5. وفي الوقت الراهن، يقدم المورفولوجية الصوبة الوراثية أكبر بكثير مما هو ممكن حاليا في نماذج تجريبية أخرى (مثل الفئران أو الزرد)، تسمح بالتحوير الوراثي الزمانية الدقيقة في فيفو (لإلغاء تنشيط أو الإفراط إكسبرس أي الجينات من الاهتمام داخل أنواع محددة من الخلايا عند نقطة وقت إنمائية محددة) وسهولة على نطاق الجينوم شاشات6،7. تقليديا، تم إجراء معظم الدراسات تصوير لايف لالتئام الجروح والتهاب في المورفولوجية في المراحل الجنينية، كما الأجنة غير متحركة (خلافا لليرقات المورفولوجية أو البالغين) وشفافة بصريا والتي تمكن دقة عالية لا مثيل لها في فيفو التصوير8. وقد أتاح هذا الباحثين تصور توظيف سريعة وقوية من الخلايا المناعية الفطرية المورفولوجية (هيموسيتيس) إلى موقع الجرح استجابة للإصابة الميكانيكية أو المستحثة بالليزر ل ظهارة الجنينية9، 10 , 11 , 12 , 13 , 14-بالجمع بين هذه الدراسات العيش-التصوير التلاعب بالجينات، كشفت دراسات في الأجنة المورفولوجية الكثير من بروتينات الخلية المناعية الهامة التي تتحكم في سلوك الخلية الملتهبة في فيفو. على سبيل المثال، تم التعرف على هومولوج صعقة-1 دريبر (أيتام مجال التي تحتوي على بروتين) مهم 'الضرر مستقبلات' الذي يتوسط المورفولوجية تجنيد الخلايا المناعية في ح2س2-طريقة تعتمد على مواقع تلف15. مستويات دريبر داخل الخلايا المناعية بدوره تنظمها إشارات جنك المستحثة بالكالسيوم وارتفاع المصب apoptotic الجثة استيعاب12. هيموسيتي حركية أخرى يتطلب تغييرات cytoskeletal المعقدة لتنسيق الهجرة الموجهة نحو الجرح وهذا يتوقف على نشاط المنظمين cytoskeletal مثل الأكتين تجميع البروتين فاسسين16 والأسرة رو الصغيرة راك جتباسيس ورو9.

هو المورفولوجية الحشرات هولوميتابولوس الذي يمر بمراحل اليرقات والخوادر إضافية عقب embryogenesis، قبل بلوغ سن الرشد17. وقد وضعت عذراء المورفولوجية نموذجا إضافيا لتصوير العيش غير الغازية لمجموعة متنوعة من الأحداث الخلوية الحيوية، بما في ذلك الخلية الإنمائية الهجرة18وانقسام الخلية19و نمو الخلية20والعضلات 21من الانكماش. في الآونة الأخيرة، قد أنشئ كنموذج رواية التي لدراسة ديناميات الجرح إصلاح والتهاب في فيفو22،23.

كما هو الحال في المراحل الجنينية، الخوادر المورفولوجية غير متحرك وشفافة بصريا، بعد تشريح دقيق من تلك الحالات الخوادر كامد18. باستغلال هذه الشفافية الضوئية، أحد اتباع السلوك في فيفو خلايا المناعة الفطرية (هيموسيتيس) استجابة لتلف الأنسجة داخل الأنسجة الخوادر المورفولوجية ، مثل الجناح الخوادر22. يوجد الجناح الخوادر كبنية بيلاييريد بسيطة، تتكون من ورقتين الظهارية المسطحة الكبيرة التي ترتبط حول محيط الجناح؛ المساحة خارج الخلية بين هذه اثنين من طبقات طلائي مليئة hemolymph (الحشرات الدم) وعدد كبير من هيموسيتيس متحركة24. كما هو الحال في الأجنة، مشغلات الإصابة الميكانيكية أو المستحثة بالليزر ظهارة الجناح توظيف سريع من هيموسيتيس إلى موقع الإصابة23. ومع ذلك، هذه المرحلة الخوادر يوفر بعض المزايا المميزة للتصوير على مدى المراحل الجنينية في وقت سابق. يمكن تصويرها الخوادر المصابين على مدى فترات زمنية أطول بكثير (على الأقل 5 ساعات)، ويتوفر مزيد من منطقة الأنسجة لاضطراب تجريبية (مثل جيل جروح متعددة) وهناك إعداد أكبر بكثير من هيموسيتيس في هذه المرحلة ( توفير مسارات الخلية أكثر من مسافات إضافية لتحسين القدرة الإحصائية خلال التحليل الرياضي.) وعلاوة على ذلك، هو كفاءة المنظمة [رني] بوساطة الجينات إدخال تحسين كبير في مراحل الخوادر، السماح للعديد من الجينات تكون 'طرقت إلى أسفل' في أنسجة أو بطريقة محددة زمنياً مقارنة بالنهج التقليدي أكثر كله متحولة للأجنة.

من أجل تتبع ديناميات epithelialization إعادة الجرح والاستجابة الالتهابية المصاحبة داخل هذا النموذج الجديد الخوادر، يجب تمييز اثنين خلية مختلفة السكان: ظهارة الخوادر وخلايا المناعة الفطرية (المورفولوجية هيموسيتيس). عدد من علامات مختلفة (جدول المواد) متاحة بتسمية هؤلاء السكان خلية مختلفة اثنين--ويتوقف اختيار علامة على عملية خاصة لدراستها. بمناسبة ظهارة الخوادر، المورفولوجية الأسطر التي تحتوي على أما أوبيكويتوسلي أعرب بروتينات فلورية خضراء معلم ه-كادهيرين (أي تسميات تقاطعات أدهيرينس) تستخدم بشكل روتيني للإشارة إلى مواقف هوامش الخلية، أو بدلاً من ذلك، التجارة والنقل-معلم أكتين-ربط مجال موسين (أي تسميات cytoskeleton أكتين) لتصور نتوءات خاتم والرائدة في حافة الجرح الهوس أكتين. لتسمية هيموسيتيس المورفولوجية ، خاصة هيموسيتي حزب سام رانسى-Gal425 محرك الأقراص في التعبير عن النووي طلب تقديم العروض (لتعقب النووي) أو هيولى بروتينات فلورية خضراء موسين معلم التجارة والنقل (لتسمية cytoskeleton السيتوبلازم أو أكتين، على التوالي) أو وتستخدم فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي (مثل كايد). وفي الواقع، أنها غالباً ما فائدة استخدام متعددة الخلايا المناعية علامات في تركيبة، لتمكين تحليل متزامنة حركة النووية ومورفولوجيا الخلايا (انظر نتائج تمثيلية). بيد أن هذا البروتوكول تتضمن استخدام الخوادر المورفولوجية ، إلا تركيبات للبصمات الجينية التي قابلة للتطبيق حتى يمكن الاستفادة من مراحل منتصف الخوادر. أيضا، لن تكون الأرصدة الفتاكة الجنينية مناسبة. وهذا من غير المحتمل أن يكون هناك مشكلة عند التصوير عنصر التحكم (أو البرية من نوع) الخوادر ولكن من المهم النظر عندما تكون ترسيتها الجينات أو أوفيريكسبريسيد، لتقييم أثرها على إغلاق الجرح أو التهاب. في حالة الفتك المبكرة الناجمة عن ضربة قاضية الجينات (أو أوفيريكسبريشن)، Gal80إتس يمكن استخدام بناء للحث ضربة قاضية يحركها Gal4 لاحقاً في التنمية (انظر المناقشة).

في دراساتنا الأخيرة، الانتقال إلى مرحلة الخوادر مكننا من جمع الخلايا المناعية مسار بيانات كافية لتحليل سلوك التحريضية باستخدام النمذجة الرياضية المتطورة، التي بدورها قد سمح لنا أن نستنتج رواية تفاصيل الجرح إشارات جاذبة التحريضية23. على سبيل المثال، هذا النهج كشفت أن chemoattractant الجرح ينتشر ببطء من خلال الأنسجة الملتهبة في دور في/200 ميكرومتر2دقيقة، بمعدل الآن أبطأ مما سبق أن اقترح الجزيئات الصغيرة مرشح مثل ATP، أو يقال أن ح2س2 نشر26،27،،من2829؛ هذه الجزيئات الصغيرة '' الضرر '' المرجح بدلاً من ذلك بمثابة إشارات متساهلة. وعلاوة على ذلك، باتباع سلوك الخلايا المناعية الفطرية الطويلة الأجل كما أنها حل بعيداً عن جرحا أولية ويتعرضون لثانية (التي قدمت في مختلف تيميبوينتس بعد الأول)، أننا قد كشفت فترة مؤقتة 'الحساسية' خلال الخلايا المناعية التي هي الأعمى للإصابات اللاحقة23. عن طريق استغلال إمكانات التصوير الطويلة الأجل من طراز الخوادر، جنبا إلى جنب مع المقاييس المورفولوجية الجينية، أحد اتباع سلوك السكان الخلايا المناعية المحددة (مثل فقط تلك الخلايا المناعية المعينين إلى موقع الجرح) في ردا على الإهانات اللاحقة، واستخدام فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي30 التي يمكن التعبير عنها حصرا داخل الخلايا المناعية النسب23.

هنا يمكننا وصف بروتوكول لتصور ديناميات إصلاح الجرح والاستجابة الالتهابية المرتبطة الزمانية بدقة عالية باستخدام المعيشة الخوادر المورفولوجية . ونحن نقدم منهجية مفصلة لتغطية الخطوات المطلوبة لإعداد أولية الخوادر (التشريح والتركيب) وجرح الليزر بوساطة اللاحقة والوقت الفاصل بين التصوير. ونحن أيضا وصف استخدام الصور القابلة للتحويل فلوروفوريس للسماح بوصفها من خلية معينة محصنة ضد مجموعات فرعية في فيفو. على المدى الطويل، ونحن نتصور أن هذا النموذج الخوادر المورفولوجية الجديد سيفتح آفاقاً مثيرة لتشريح إشارات الديناميات المعقدة الكامنة وراء الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. عن طريق تطبيق التحليلات الإحصائية أكثر تطورا واحداً قد كشف ميزات للرد الذي خلاف ذلك سيظل تجريبيا غير قابل للوصول، بينما يمكن تحسين كفاءة [رني] تصلح لتطبيق الفرز على نطاق الجينوم داخل الخلايا المناعية في الجسم الحي لتحديد اللاعبين الرواية التي تنظم سلوك الخلايا المناعية.

البروتوكول

هذا البروتوكول ويتكون من أربع خطوات متتابعة رئيسية: (1) إعداد الأرصدة المورفولوجية والتدريج الخوادر المورفولوجية وتشريح الخوادر (2) والتركيب، وإصابة الخوادر (3)، (4) في فيفو الوقت الفاصل بين [كنفوكل] التصوير.

1-إعداد الأرصدة المورفولوجية والتدريج الخوادر

  1. الحصول على مخزون المورفولوجية المناسبة (انظر الجدول عن الموادومقدمة).
  2. جمع الشباب الذباب الكبار صحية للنمط الوراثي المناسب.
    1. الكبار حدد الذباب باستخدام منصات غاز ثاني أكسيد الكربون لفترة وجيزة تخدير الذباب والذباب الرسام غرامة لنقل الوراثي المناسب أو نوع الجنس لقنينة جمع.
    2. إضافة 20 العذراء الإناث والذكور 20 لكل قنينة تحتوي على وسائط الإعلام الغذائي يطير القياسية (خليط دقيق الذرة-دبس السكر-أجار، انظر الجدول للمواد) وتستكمل مع الخميرة.
  3. لجيل الخوادر الأمثل، تلميح الذباب الكبار كل يوم على الغذاء الجديد في قارورة جديدة، حفظ كافة القوارير عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان يستخدم نظام Gal4-UAS31 محرك التعبير الجيني الخاصة بالنسب، جميع الخطوات ينبغي إجراء عند 25 درجة مئوية أو أعلى، كما النظام Gal4-UAS هو درجة الحرارة الحساسة.
  4. ح 18 قبل الدورة التصوير المجدولة، حدد على الأقل 10 شكلت حديثا بيضاء قبل الخوادر (الشكل 1A) من القنينات (أي ح 0 بعد تشكيل بوباريوم، الإدارة العامة الاتحادية) باستخدام الملقط أو الرسام ما يرام لإزاحة الخوادر من السطح القنينة الداخلية و نقل الخوادر بعناية إلى الجانب من قنينة بلاستيكية فارغة نظيفة.
    ملاحظة: تجول اليرقات الطورrd 3 تزحف صعودا من المتوسط الغذاء إلى الخضوع بوبيشن؛ بريبوباي الأبيض شكلت حديثا يتم التعرف عليها بسهولة كما أنها تمتلك سبيراكليس الأمامي افيرتيد وهي ثابتة (على عكس 3 يرقات الطورrd ). بشرة يتحول 'بوباريوم' (القضية الخوادر) الذي هو في البداية الناعمة والبيضاء17. يجب الحرص على تجنب إتلاف الخوادر، وهذا يمكن أن يؤدي ليس فقط إلى استجابة التهابات الناجمة عن الإصابة غير المرغوب فيها ولكن أيضا إلى تأخير إنمائية هامة.
  5. عمر الخوادر المحددة للمرحلة الإنمائية المناسبة (ح 18 الاتحادية سوف تعطي النتائج المثلى) في القنينة عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: كما وضع الخوادر، سوف تصبح القضية الخوادر تدريجيا أكثر قتامة وأكثر هشاشة.
  6. إعداد الكواشف الأخرى للخطوة التالية قبل الموعد المحدد. لجعل هيبتان الغراء، والجمع بين 20 سم طول الشريط الوجهين الظاهرة مع 20 مل هيبتان في أنبوب الطرد مركزي 50 مل، ختم مع الفيلم البارافين والصخور في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها على مقاعد البدلاء.

2-إعداد وتشريح المورفولوجية الخوادر

  1. نقل الخوادر المورفولوجية نظموا لقطعة من الشريط الملصقة على الوجهين مثبتة على شريحة زجاج. وضع في الخوادر حيث الجانب البطني عالق بثبات إلى الشريط وتواجه الجانب الظهرية صعودا (الشكل 1B).
    ملاحظة: الأمامي من عذراء سوف تكون قابلة للتحديد من spiracles اثنان بارزة من نهاية القضية الخوادر الأمامي.
  2. بعناية إزالة الخوادر من غلافها بوباريوم الواقية تحت مجهر تشريح برايتفيلد استخدام الملقط والصغرى-مقص (الشكل 1B--د).
    1. وفي البداية، جعل شق في المنطقة الأمامية أكثر من بوباريوم استخدام الملقط (الشكل 1B). ضمان أن القضية الخوادر في هذا المجال أجوف وخالية من الأنسجة الخوادر لأنه سوف تقلصت الخوادر داخل القضية خلال التنمية الخوادر في وقت مبكر.
    2. بعد هذا الشق الأول، بعناية المسيل للدموع أو قطع حالة الخوادر مفتوحة في الأمامي للاتجاه الخلفي باستخدام الملقط أو ميكروسسيسورس (الشكل 1) حتى تصبح الخادرة خالية تماما من غلاف هش كامد براون (الشكل 1).
      ملاحظة: الخوادر في هذه المرحلة هشة للغاية، ويجب الحرص على تفادي ثقب السطح الخوادر؛ ثقب الواضح كما hemolymph التسريبات بسرعة من موقع الثقب. يجب أن يتم تجاهل الخوادر مع ثقوب، مهما كان صغيراً.
  3. جبل الخوادر في صحن زجاجية باستخدام الغراء هيبتان.
    1. استخدام تلميح ماصة 20 مل لوضع قطره 10 مل من الغراء هيبتان معدّة سلفا (انظر الفرع 1-6 أعلاه) في خط على الطبق زجاجية.
    2. تسمح الغراء لتجف ل 5 s قبل نقل الخوادر تشريح بعناية على الغراء هيبتان استخدام الملقط (الشكل 1E).
    3. تيسيرا لإصابة والتصوير، يصطف الخوادر على التوالي؛ اقترحت الخوادر حوالي الساعة 5 ولكن أكثر سوف تكون قابلة للإدارة مع الخبرة.
      ملاحظة: استعمال الغراء هيبتان ينصح عند استخدام نظم التصوير تستقيم ولكن ليس من الضروري عند استخدام نظام مقلوب. إذا الغراء يخلق البصرية الانحرافات أثناء الخوادر للتصوير، يمكن وضعها مباشرة على كوفيرجلاس بدلاً من ذلك – الالتصاق الطبيعي بين الأنسجة الخوادر والزجاج سوف يكون كافياً في معظم الحالات لتصوير مستقرة، ما دام هو الحرص عند نقل التصوير طبق بين المجاهر.
  4. للحصول على أفضل النتائج، جبل الخوادر حيث يكون الجناح شقة في كوفيرجلاس مع أغلبية سطح الجناح في اتصال مباشر مع كوفيرجلاس (الشكل 1F). لفة الخوادر استخدام الملقط لتغيير موقفها لضمان الجناح يتم تحميل بشكل صحيح.
  5. لمنع الجفاف عينة أثناء فترة التصوير، إضافة قطعة من الورق تصفية ماصة غارقة في الماء المقطر إلى جانب الطبق زجاجية في نهاية المتصاعدة، مع الحرص على عدم تعكير الخوادر (الشكل 1E). تغطية الطبق مع غطاء.
    ملاحظة: الخوادر جاهزة الآن لإصابة والتصوير.

3-المستحثة بالليزر جرح المورفولوجية أجنحة الخوادر

  1. نقل الطبق زجاجية تحتوي على الخوادر المحملة مجهر واسع المجال مجهزة بنظام ليزر الانضباطي الاجتثاث.
    1. استخدام ليزر تذرية ضخ النيتروجين تبريد الهواء نبضات الأشعة فوق البنفسجية ضبطها إلى 435 نانومتر – انظر الجدول للمواد لتفاصيل11؛ دقة الطول الموجي للضوء المستخدمة للإضاءة هو المحددة من قبل المستخدم عن طريق خلية صبغ مناسبة.
  2. استخدام برايتفيلد البصريات، ضبط عناصر التحكم المرحلة المجهر لتحديد موقع الجناح الخوادر لعذراء الأولى أن أصيب (الشكل 1F).
  3. لتحقيق أفضل النتائج، استخدم عدسة هدف غمر 40 X أو 63 X نفط لكلا التصوير والليزر التذرية؛ ضمان اتساق بين الاجتثاث ونظم التصوير غمر السائل المستخدمة (النفط أو الجلسرين). ضبط المجهر للتركيز على طائرة ظهارة الجناح الخوادر أقرب ساترة زجاجية (أي التركيز على منطقة ظهارة أن جراح) باستخدام مقبض التحكم التركيز الجميلة.
  4. باستخدام مجهر مرحلة التسويات، موقف الجناح الخوادر حيث أن المنطقة لتكون إصابة مباشرة تتماشى مع المنطقة المستهدفة معروفة من الليزر التذرية.
  5. استخدام شريحة موهن كثافة الطاقة المجهزة بالمجهر لضبط مستوى السلطة على ضوء الاجتثاث يدوياً.
    ملاحظة: مربع التمرير موهن قد توقف فوق والأحكام لتحديد المستوى النسبي التوهين وتسمح باستخدام إعدادات استنساخه.
  6. باستخدام عنصر تحكم يدوي خارجي الزناد ، تنشيط التذرية الليزر باستخدام نقرة واحدة موجزة من المشغل لجعل جرح. تحقق لظهور فقاعة هواء عابر في موقع التذرية حيث سوف تكون عادة مصحوبة إصابة. تحقق إذا كان جرح المستحثة بالليزر قد نجحت باستخدام مرشحات الفلورسنت مناسب لتصور ظهارة الخوادر.
    ملاحظة: الحرص على تجنب التعرض العرضي لأشعة الليزر كما انعكاسات الشعاع يمكن أن يسبب العين شديدة أو الأضرار بالبشرة.
  7. إذا كان جرح غير ناجح، تختلف المستوى البؤري (نقل التركيز المجهر قليلاً أعلى أو أدنى من مستوى التنسيق الحالي) وكرر نقرة واحدة على الزناد الاجتثاث. بدلاً من ذلك، تزيد تدريجيا قوة الليزر استخدام الشريحة موهن حتى يتحقق حجم الجرح المرجوة.
  8. لتغيير معدل تكرار نبض الليزر التذرية، استخدام مقبض معدل الرسوب في لوحة التحكم الخلفي (الذي يتغير المعدل من أقل من 1 ذبذبة/ثانية يصل إلى 60 هرتز). لإصابة الأمثل، تعيين معدل تكرار النبضة إلى 40 هرتز.
  9. لتوليد الجروح الحجم مختلفة، استخدام الشريحة موهن كثافة الطاقة لضبط مستوى السلطة على ضوء الاجتثاث يدوياً.
  10. تمتنع عن إصابة كل من الخوادر المحملة واستخدام هذه الخوادر غير أبلاتيد كعناصر تحكم المعافين.
  11. للحصول على نتائج متسقة، بانتظام إعادة مواءمة النظام التذرية (باستخدام دليل التشغيل ذات الصلة). أيضا، تنظيف وتعبئة الخلية جهاز رنان صبغ يتحكم في الطول الموجي إخراج الليزر.

4. في فيفو الوقت الفاصل بين التصوير [كنفوكل]

  1. بسرعة نقل الطبق زجاجية مجهر مناسبة للتصوير بمرور الزمن.
    ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج، استخدام مواصفات عالية [كنفوكل] أو المجهر قرص الغزل مزودة بكاشفات الحساسة التي يمكن أن تكشف عن فلوروفوريس التجارة والنقل ومشري.
  2. لصورة الجناح الخوادر كامل، استخدم عدسة تكبير منخفضة (مثل 20 X) هدف (الشكل 2A). من أجل إصلاح صورة الجرح والاستجابة الالتهابية المصاحبة مع عالية الدقة المكانية، استخدام النفط غمر 40 س (1.3 غ) أو 63 X العدسات الهدف (1.4 غ) (انظر الصور الممثل في الشكل 2-د).
  3. فتح برنامج التقاط الصورة المناسبة المرتبطة بالمجهر.
  4. باستخدام برامج التقاط الصورة، قم بتشغيل أشعة الليزر المناسبة مثلاً 488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر لتصور fluorophores بروتينات فلورية خضراء ومشري، على التوالي (بواسطة النقر فوق في المربعات ذات الصلة) وضبط السلطة الليزر وكسب/إزاحة إعدادات لإعطاء تكفي إشارة الفلورسنت حين تجنب التشبع بكسل؛ استخدام القوة الليزر ممكن أقل (في نطاق 5-20 ٪) للتقليل من فوتوبليتشينج والضيائيه.
  5. لالتقاط كل إصلاح ظهارة وتجنيد الخلايا التحريضية، تعيين المجهر لتسجيل كدسة z استخدام المقابض التكيف التركيز غرامة على لوحة التحكم؛ لتحقيق أفضل النتائج، تعيين البرنامج (باستخدام نقرات الزر اليدوي) إلى شرائح زي السجل من خلال الجناح الخوادر (على الأقل كل 3 مم)، من الجزء العلوي من ظهارة الجرحى عن طريق إلى الفضاء خارج الخلية أسفل (تحتوي على ترحيل هيموسيتيس) لتحقيق كبير ض-المكدس (في حدود 50-100 ملم).
  6. للتصوير بمرور الوقت، سجل z-مداخن عند فواصل زمنية منتظمة (الحد الأدنى كل 30 ثانية) على الأقل 1 ح بعد إصابة.
    ملاحظة: يمثل الفاصل الزمني الدقيق بين z-مداخن اختيار مفاضلة بين أسر ديناميات الخلايا المتغيرة بسرعة وتجنب تبيض الصور عينات.
  7. الصورة الخوادر متعددة (بما في ذلك الضوابط المعافين غير أبلاتيد) في نفس الوقت، استخدم مرحلة إليه (ترفق بالمجهر) وميزة اكتساب موقف متعدد المتاحة في إطار برامج التصوير. يدوياً تعيين الموضع لكل عذراء الفردية داخل البرنامج باستخدام مقابض التحكم موقف المرحلة ثم قم بتعيين حدود المكدس z المناسبة (أعلى وأسفل) لكل عذراء الفردية يدوياً.
  8. تصور الوقت الفاصل بين الصور أثناء التقاط الصورة أو في وقت لاحق مع صورة أخصائي تحليل البرمجيات (مثل ImageJ32) استخدام الإسقاطات z-مكدس أو التقديم ثلاثي الأبعاد. على سبيل المثال، لمتابعة تحركات هيموسيتيس الفردية (كما هو الحال في الشكل 2' و د')، ونوى هيموسيتي المسار باستخدام الوصول المفتوح ImageJ بلج "تراكماتي" أو "دليل تتبع" (أساليب نشر في 33، 34).
  9. استخدام المسابير فوتوكونفيرتيبلي (مثل كايدى30) إلى فوتوكونفيرت بشكل انتقائي وتسمية مجموعة فرعية خلايا الظهارية أو الحصانة أثناء التصوير.
    1. فتح وحدات مناسبة ضمن برامج التصوير لأداء فوتوكونفيرسيون (مثل فراب، الأسفار الانتعاش بعد تبييض الصورة وحدة نمطية) وتنشيط ليزر (بواسطة النقر فوق في مربع البرامج ذات الصلة) 405nm35.
    2. حدد الخلايا لتكون فوتوكونفيرتيد داخل البرنامج فراب باستخدام أداة التحديد مربعة أو دائرية أو يدوي. داخل البرنامج فراب، تعيين الوقت الدورة فوتوكونفيرسيون (التبييض) لتكرار/إطار واحد ومجموعة 405 نانومتر الليزر في السلطة الليزر 20%. يدوياً انقر فوق بدء التجربة لأداء فوتوكونفيرسيون.
    3. الخروج من الوحدة النمطية فراب (انقر فوق إغلاق) والعودة إلى شاشة التصوير الأصلي داخل البرنامج؛ استخدام 488 نانومتر و 561 نانومتر الليزر صورة سلوك الخلايا فوتوكونفيرتيد وغير فوتوكونفيرتيد بإنشاء مكدس z وتسجيل الوقت الفاصل بين ما ذكر أعلاه.
      ملاحظة: تحقيقات فوتوكونفيرتيد تبقى مستقرة لعدة ساعات بعد فوتوكونفيرسيون الأولى، تمكين سلوك الخلايا فوتوكونفيرتيد الواجب اتباعها على مر الزمن (على الأقل 5 ساعات). على سبيل المثال، الخلايا الملتهبة في الجرح يمكن أن يكون انتقائيا فوتوكونفيرتيد (الشكل 2 واو) واتباع سلوكهم كما أنها في حل من موقع الإصابة (الشكل 2 و H).

النتائج

ويصف هذا البروتوكول إعداد الخوادر المورفولوجية لتصوير الوقت الفاصل بين ناري من الجرح إصلاح والتهاب في فيفو. باستخدام هذا الأسلوب، يجب أن يكون من الممكن لإنشاء أفلام عالية الدقة متعددة لإغلاق الجرح الخوادر وتجنيد الخلية الملتهبة بسهولة والصورة الخوادر لفترات زمنية طويلة (على الأقل 5 ساعات) بعد إصابة دون فوتوبليتشينج كبيرة.

مخطط عام لإعداد عذراء المورفولوجية

ويبين الشكل 1 الأسلوب الأمثل لإعداد الخوادر المورفولوجية للتصوير في فيفو . افيرتيد المورفولوجية تجمع الأبيض 'بريبوباي' في '0 ح' بعد تشكيل بوباريوم (الاتحادية)، كما اليرقات الزحف وقف حركية واعتماد الشكل الخوادر النمطية مع ملحقات التنفس (سبيراكليس) تظهر في نهايتها الأمامي معظم ( الشكل 1A). ح 0 الأبيض مسموح بريبوباي الاتحادية إلى وضع من أجل ح 18 في 25 درجة مئوية، وهو الوقت الذي أصبحت بوباريوم براون (الشكل 1B) وهي ثم تشريح استخدام الملقط غرامة و/أو ميكروسسيسورس (الشكل 1، إزالة حالة الخوادر الواقية) لتكشف عن عذراء شفافة بصريا داخل (الشكل 1). عقب التشريح، ستكون أجنحة الخوادر مرئية على الجانبين الأفقي من القفص الصدري الخوادر (المشار إليها باللون الأزرق، الرقم 1-د). في هذه المرحلة، أيضا أجزاء أخرى من الجسم الخوادر ملموس بسهولة، بما في ذلك العينين والساقين، والبطن (المسمى في الشكل 1). الساقين هي أيضا مناسبة لدراسات التهاب الجرح، ويمكن أن يكون أصيب باستخدام نفس الأسلوب الليزر الموصوفة أعلاه. ح 18 متعددة الخوادر APF يمكن تركيبة في نفس الوقت داخل طبق التصوير (الشكل 1E، استخدام الغراء هيبتان وورقة تصفية غارقة في المياه للتقليل من الجفاف) مع تسطحاً جزء من الجناح (أزرق المبين) على اتصال ساترة ( الشكل 1F)؛ وهذا مفيد خصوصا إذا كان مجهر التصوير مجهز بمرحلة يجهز للسماح الخوادر عدة بتسجيلها خلال فترة التصوير واحدة واحدة. يجب أن يتم تجاهل أي الخوادر التي تضررت خلال التشريح أو التركيب (مثل الخادرة الموقع الثالث في التسلسل، السهم في الشكل 1E). أجزاء أخرى من الجسم (مثل العينين والساقين، وأوجز الوردي) قد اتصل أيضا ساترة وهي متاحة لإصابة واللاحقة التصوير (الشكل 1و). لإجراء التجارب على دراسة واحدة الجروح، الأضرار التي يسببها الليزر هي عموما أفضل ألحقت مركزياً في الجناح (العلامة النجمية، الشكل 1F)، على الرغم من أن مواقع أخرى يمكن استخدامها إذا كانت الجروح متعددة دراستها.

جرح عقيم ينشط ردا قويا من التهاب في الجناح المورفولوجية الخوادر

بغية متابعة إصلاح الجرح ومصاحبة الاستجابة الالتهابية المجراة، أجنحة الجرحى الخوادر APF المورفولوجية ح 18 تم تصويرها باستخدام الفحص المجهري الوقت الفاصل بين [كنفوكل] (الشكل 2 أ-ح). وفي هذه المرحلة الخوادر، epithelia الجناح أوراق مسطحة بسيطة من الخلايا (المسماة هنا استخدام بروتينات فلورية خضراء معلم ه-كادهيرين بمناسبة حدود الخلايا الفردية، هامش الجناح المبين في الشكل 2 ألف). حتى في أجنحة المعافين (انخفاض التكبير، الأرقام 2 أ و 2 أ ')، تم العثور على إعداد كبيرة من الخلايا المناعية الفطرية المهاجرة (هيموسيتيس، المسمى باستخدام حزب سام رانسى-Gal4 مدفوعة هيولى بروتينات فلورية خضراء، خضراء، والنووية طلب تقديم العروض، أرجواني) داخل hemolymph ( دم الحشرات) تحتل المساحة الفاصلة خارج الخلية (الشكل 2A و 2A '). إصابة المستحثة بالليزر ظهارة الجناح الخوادر (هامش الجرح المبين في الأبيض، الشكل 2-د) يحفز هجرة سريعة من هيموسيتيس إلى موقع الجرح (الشكل 2-د ونوى الخلايا المناعية في الشكل 2 '--D'). وصف هيموسيتيس مع كل علامة نووية (مثل طلب تقديم العروض النووية 'الأحمر-ستينغر') في تركيبة مع علامة هيولى أو سيتوسكيليتال (مثلاً هيولى بروتينات فلورية خضراء أو معلم بروتينات فلورية خضراء موسين) مفيد خاصة أنها تتيح واحد تتبع نوى هيموسيتي (للتحليل الآلي هيموسيتي السلوك مثل الهجرة سرعة واتجاه) والتصور من مورفولوجيا هيموسيتي. هذا الأخير مهمة لأنها تسمح لنا بتحديد ما إذا كانت هيموسيتيس فاجوسيتوسينج الحطام نخرية (الشكل 2، اقحم) على حافة الجرح (أو الميكروبات في حالة العدوى)12،23 ويسمح لنا أيضا لمتابعة أن سلوكهم بارزة كما أنها تمتد غرامة فيلوبوديا أو لاميليبوديا على حافة الرائدة عندما تهاجر نحو أو بعيداً عن الجرح.

بسيطة تتبع مسارات هيموسيتي النووية باستخدام برمجيات "تحليل الصور" المناسبة32 الديناميات المعقدة الزمانية للاستجابة الالتهابية، مماثلة للتي ذكرت سابقا ليوضح (جدول المواد) إصابة الأجنة9،36 (ملونة متعددة المسارات، الشكل 2'و D'). خلال 30 دقيقة فقط من إصابة، هيموسيتيس الموقع الأقرب إلى موقع الإصابة تبدأ الهجرة الموجهة نحو الجرح (الشكل 2'). ومع ذلك، مع تزايد إصابات بعد انتهاء الوقت، هيموسيتيس يقع تدريجيا كذلك بعيداً عن موقع الإصابة أيضا تبدأ الهجرة الموجهة نحو الجرح (الشكل 2D'). وبهذه الطريقة، 'موجه' من استجابة الخلايا المناعية التي ينتشر إلى الخارج من حافة الجرح ويلاحظ، الذي نحن نتصور أن تعكس نشر chemoattractant الجرح بعيداً عن موقع الإصابة. هذه الديناميات الخلايا المناعية الزمانية المقدمة نقطة انطلاق مفيدة لدراستنا الأخيرة التي استخدمت التحليل الرياضي متطورة النمذجة (بايزي الاستدلال '') استنتاج خصائص الرواية إشارة جاذبة الجرح (طرق مفصلة نشرت في23). قبل معايرة لدينا نماذج حسابية (التي ترتبط التدرج جاذبة الجرح التحيز هيموسيتي) لتناسب المسارات المناعي الملاحظ في فيفو ، واحد يمكن استخراج الخصائص التفصيلية جاذبة الجرح من لدينا مسار هيموسيتي البيانات (مثل معدل انتشار الإشارات والمصدر، ومدة إنتاج إشارة)23.

وعلاوة على ذلك، بالتعبير عن فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي كايد داخل الخلايا المناعية نسب استخدام حزب سام رانسى-Gal4 (أخضر، الشكل 2E) تمكنا أيضا من تسمية بشكل انتقائي يتدنى لهذه هيموسيتيس الجناح الكثيرة الارتحال (مثل القيادة المعينين إلى موقع الجرح؛ ه من قبل فوتوكونفيرسيون المستحثة بالأشعة فوق البنفسجية، وواو، فوتوكونفيرسيون بوست). نحن يمكنك حينئذ اتباع سلوك هذه هيموسيتيس على مر الزمن (أرجواني، الشكل 2-H) كما أنها حل بعيداً عن موقع الجرح (الأسهم، الشكل 2 وح) وقارن كيف أن سلوكهم يختلف عن تلك غير فوتوكونفيرتيد الخلايا التي لا تصل إلى موقع الإصابة. وقد استخدمنا هذه في فيفو وسم تقنية لإثبات أن هيموسيتيس المعينين لأولى الجرح هي المتفجرات مؤقتاً لجرح ثانية التي تم إنشاؤها 90 دقيقة بعد23، على الرغم من أن هذا الأسلوب وضع العلامات التفضيلية يمكن أيضا أن العديد من التطبيقات الأخرى الثاقبة في المستقبل (انظر المناقشة).

باستخدام هذا النهج، ونحن أيضا في نفس الوقت اتبع ديناميات الزمانية لإصلاح الجرح أو كنت ابيثيلياليسيشن ' (الشكل 2-د). أعرب هنا عن أوبيكويتوسلي بروتينات فلورية خضراء معلم ه-كادهيرين تسميات الوصلات أدهيرينس الخلوية في جميع أنحاء ظهارة الجناح ويسمح للأشكال الموجودة الخلايا الظهارية الفردية الواجب اتباعها مع مرور الوقت. يسهل التعرف على حافة الجرح كنقطة التقاء بين الخلايا الظهارية سليمة المسمى بروتينات فلورية خضراء والحطام غير مسمى (خط متقطع بشرط بيضاء، الشكل 2-د). بالنسبة لمعظم الجروح، تبدأ الجرح إعادة ابيثيلياليزي ضمن ح 1 من الإصابة والداخل السلف حافة الجرح (الشكل 2D)؛ عادة سوف تلتئم الجراح بهذا الحجم داخل ح 2-3 من إصابة23. إغلاق الجرح في الأجنة والخوادر تحركها كابل الهوس أكتوميوسين جنبا إلى جنب مع الرائدة الغنية أكتين فيلوبوديا23،37؛ يمكن تصور هذه الديناميات cytoskeletal مباشرة أثناء إصلاح الجرح باستخدام المناسبة في فيفو الصحفيين، مثل معلم بروتينات فلورية خضراء السباغيتي الاسكواش (سلسلة الميوسين الخفيفة التنظيمية) أو معلم بروتينات فلورية خضراء أكتين-ملزمة موسين23. لبعض الجروح كبيرة بصفة خاصة، بيد لا تستمر كابل أكتوميوسين وفيلوبوديا الرائدة--وهذه الجروح تصبح 'المزمنة' وابدأ تماما إعادة ابيثيلياليزي23 حتى بعد فترات أطول بكثير (ما يزيد على 24 ساعة) من فيفو التصوير. من المثير للاهتمام، الاستجابة الالتهابية المرتبطة بهذه الجروح غير الشفاء مختلف اختلافاً ملحوظا عن تلك المرتبطة بالجروح الحادة العادي23 مما يوحي بأن السلوك الشاذ الخلية المناعية يمكن أن يكون علامة تشخيصية مفيدة في العيادة . في المستقبل، كذلك في فيفو التحليل من الجروح المزمنة استخدام التصوير الطويلة الأجل (أكثر من 24 ساعة) في نموذج الخوادر قد توفر ثاقبة آليا إلى أهمية هذا الشرط المنهكة.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد عذراء المورفولوجية لمما أدى إلى إصابة والعيش-التصوير. المؤشرة (A) المورفولوجية بريبوباي البيضاء التي جمعت في ح 0 الإدارة العامة الاتحادية، مع نهاية الأمامي افيرتيد التنفس الملاحق (سبيراكليس). (ب) بعد رفع ح 0 الأبيض APF بريبوباي ح 18 عند 25 درجة مئوية، يظهر بوباريوم براون. ينبغي أن يبدأ تشريح القضية الخوادر في منطقة الأمامية معظم (السهم)، يتبين من سبيراكليس افيرتيد كعذراء الصحيح غائب من هذه المنطقة، والملقط غرامة و/أو ميكروسسيسورس يستخدم لإزالة حالة الخوادر وقائية (ج). أجنحة الخوادر ستكون مرئية على الجانبين الأفقي من القفص الصدري الخوادر (الخطوط الزرقاء). (د) حالة الخوادر إزالتها تماما من ح 18 عذراء الإدارة العامة الاتحادية، هنا عذراء قد تم توالت 90 ° لإظهار الجانب الأفقي، مع الجناح تصويرها المبينة باللون الأزرق. (ه-و) شنت خمس الخوادر APF ح 18 على ساترة زجاجية داخل التصوير طبق استخدام الغراء هيبتان، مع ورقة تصفية غارقة في المياه للتقليل من الجفاف (ه). عذراء الثالثة تقع في التسلسل (السهم) يجب أن يتم تجاهل الضرر وقع أثناء إعداد. الخوادر تقام مع الجزء تسطحاً الجناح (أزرق المبين) على اتصال ساترة (F) والجروح التي يسببها الليزر يتم إنشاؤها مركزياً في الجناح (العلامة النجمية، و)، على الرغم من أن مواقع أخرى يمكن استخدامها إذا كانت الجروح متعددة ينبغي أن تدرس. الصورة في (د) مقتبس بإذن من النساجون et al., 201623. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2: تحليل دينامية في فيفو الاستجابة الالتهابية لتلف الأنسجة. الخوادر تشريح من الحالات الخوادر الواقية والتي شنت على الزجاج ساترة (A) أصيب بجروح وتصويرها في وقت لاحق باستخدام الفحص المجهري الوقت الفاصل بين [كنفوكل] (ب-ح). انخفاض عرض التكبير الجناح الخوادر المعافين (A، هامش الجناح المبين في الأبيض) الذي يحتوي على عدد كبير من هيموسيتيس الكثيرة الارتحال (A'). إصابة المستحثة بالليزر ظهارة الجناح الخوادر (ب-د، حدود الخلية المسماة استخدام معلم بروتينات فلورية خضراء المورفولوجية ه-كادهيرين؛ والجرح الهامش المبينة في الأبيض) تنشيط استجابة التهابات سريعة مع هجرة هيموسيتيس متعددة ( حزب سام رانسى-Gal4 مدفوعة التعبير النووية طلب تقديم العروض، وبروتينات فلورية خضراء هيولى والأرجواني، الأخضر) تجاه موقع الجرح (ب-د؛ إطارات الممثل من الوقت الفاصل بين فيلم الذي كل إطار إسقاطاً لشرائح 25 3 ميكرومتر). التتبع اليدوي للمسارات هيموسيتي (مسارات متعددة الألوان، ج ' و D') الإشارة إلى الديناميات المعقدة الزمانية للاستجابة الالتهابية، مماثلة للتي أبلغت عن إصابة الأجنة. هيموسيتيس البلعمه أيضا الحطام الخلوية نخرية في موقع الجرح (رأس السهم، ج واقحم أيضا). يمكن التعبير عن فلوروفوري فوتوكونفيرتيبلي كايدى في نسب الخلايا المناعية (الأخضر، الإلكترونية، استخدام حزب سام رانسى-Gal4) المعينين الجرح هيموسيتيس (السهم، ﻫ) خلطات المسمى (أرجواني، و) ويتبع مع مرور الوقت كما أنها في حل من موقع الإصابة (السهام، و زاي ، و حاء). واستخدمت الأنماط الجينية الخوادر التالية: (أ-د) ث1118؛ يو بي أي-دي-كندي-التجارة والنقل، حزب سام رانسى-Gal4 > UAS-GFP(II)؛ UAS-nRFP(III) ح ه ث1118؛ srp-Gal4(II)؛ UAS-Kaede(III). الصور تكييفها مع إذن من النساجون et al., 201623. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

استجابة الالتهابات الحادة لتلف الأنسجة هي عملية معقدة وديناميكية للغاية أن من الضروري تدبير إصلاح الأنسجة المتضررة، بما في ذلك إزالة الحطام نخرية ومكافحة العدوى. لنفهم تماما وكشف الجوانب الأساسية لهذا الرد، من الأهمية بمكان أن يتم الدراسات المنجزة في فيفو على عينات حية ثلاثية الأبعاد من أجل السلوك الدقيق والتفاعلات المختلفة الخلية الأنساب المعنية الواجب اتباعها بدقة مع مرور الوقت. يسمح تحليل في الوقت الحقيقي لهذه الديناميات خلية وصفاً أكثر تفصيلاً لتعمل متحولة من النقاط الزمنية واحد ثابت من عينات الثابتة باستخدام تقنيات immunohistochemistry الكلاسيكية. تقليديا، استخدمت معظم الدراسات العيش-التصوير باستخدام نموذج المورفولوجية وراثيا تتسم المرحلة الجنينية للتنمية فرويتفلي نظراً للشفافية الضوئية والجمود بالمقارنة مع مراحل نمو لاحق4 , 5-ومع ذلك، في الآونة الأخيرة مجموعتنا وغيرها قد وضعت عذراء المورفولوجية كنموذج جديد لأداء عالية الدقة والتصوير الطويلة الأجل لإصلاح الجرح والتهاب في نفس الوقت في فيفو8،22 ،23. هذا النهج الناشئة يوفر إمكانيات مثيرة طويلة الأجل لكشف الجوانب الأساسية لسلوك الخلية الملتهبة ويمكن تكييفها أيضا للتحقيق في السلوك الديناميكي للأنساب الخلية الأخرى (مثل adipocytes المورفولوجية 38) بعد إصابة الأنسجة.

وهناك عدد من العوامل الحاسمة أثناء إعداد وتصوير الجرحى الخوادر المورفولوجية التي ستحدد نوعية نتائج التصوير الوارد وصفها أعلاه. يمكن القول أن الخطوة الأكثر صعوبة من بروتوكول وصف هو تشريح دقيق وتحديد المواقع بدقة الخوادر قبل إصابة والتصوير. الخوادر في هذه المرحلة الإنمائية هشة للغاية وبسيطة حتى التلف العرضي الخوادر خلال مراحل إعداد سيضعف إلى حد كبير التجربة؛ يجب أن يتم تجاهل أي الخوادر التي قد تتعرض للضرر غير المقصود من التجربة منذ هذا الضرر يمكن تنشيط استجابته التحريضية التي قد تؤدي إلى مزيد من تأثيرات واسعة الانتشار (أو حتى النظامية) على سلوك الخلية الملتهبة في أماكن أخرى في عذراء. بسبب التطوير المستمر الخوادر المستخدمة في هذه التجارب (التي يمر بها أنسجة كبيرة ترتيبات جديدة لإعداد الأنسجة لسن البلوغ)، سيتم نقل الخوادر في بعض الأحيان أثناء التصوير. المتداول الخوادر، مع ذلك، أكثر من المحتمل أن يحدث إذا الخوادر لا قد تصاعدت بشكل صحيح مع السطح تسطحاً من الجناح (أو الأنسجة الأخرى تصويرها) في اتصال مباشر مع كوفيرجلاس؛ ينبغي تقليل استخدام الغراء هيبتان استقرار الخوادر في الزجاج غطاء هذه الحركة غير مرغوب فيها. لهذا السبب، يجب أيضا أن الحذر الشديد لتجنب إزاحة الخوادر من مواقفها المنحازة بعناية عند نقل العينات بين المجاهر؛ ومن الناحية المثالية، سيلحق الليزر مما أسفر عن إصابة بالمجهر نفسه لاستخدامها لتصوير مرور الزمن اللاحقة وتحويل الصور.

بالإضافة إلى إتقان التشريح الخوادر وخطوات التركيب، سيكون النمط الوراثي الدقيق الخوادر المورفولوجية المستخدمة أثرا كبيرا على نوعية تصوير البيانات الناتجة. على سبيل المثال، عدد النسخ لسائق Gal4 وثوابت UAS (مثلاً UAS-التجارة والنقل أو كايد UAS) داخل وراثي الخوادر فردية ستحدد نسبة الإشارة إلى الضوضاء أثناء تصوير اللاحقة. كقاعدة عامة، إنشاء نسخ أكثر من Gal4 أو UAS الحالي، زيادة المستوى الإجمالي للبروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل أو كايدى) داخل الأنسجة. بيد المستوى الأمثل من البروتين الفلورسنت ستكون إيجاد توازن دقيق بين رفع fluorescence الأنسجة بما فيه الكفاية للسماح للتصوير (تمكين استخدام صلاحيات ليزر أقل، الحد في فوتوبليتشينج والتصوير عبر تمديد الوقت عالية الجودة فترات) ولكن دون أن تسبب السمية الخلوية المستحثة fluorophore؛ العدد الأمثل من بنيات Gal4 و UAS في كل تجربة تختلف وفقا لبرامج معينة و fluorophores قيد الاستخدام. وينبغي الحرص على رفع الخوادر عند 25 درجة مئوية (أو أعلى، تصل إلى 29 درجة مئوية) لأن النظام Gal4-UAS هو درجة الحرارة حساسة ولن يكون فعالاً في أدنى درجات الحرارة31. من أجل تحقيق مستويات إضافية للسيطرة على الأنسجة أو خصوصية الوقت من Gal4-مدفوعة التعبير، قامع نظام Gal4 UAS Gal80 يمكن أيضا أن تدرج ضمن النمط الوراثي الخوادر39. Gal80 يمكن استخدامها أما لقمع النشاط Gal4 داخل نسيج معين (باستخدام Gal80 الخاصة بالانسجة) أو في وقت معين (باستخدام درجة حرارة Gal80 الحساسة). يمكن دمج نظام Gal4 UAS كذلك مع نظم أخرى ثنائية مستقلة (مثل ليزا-ليكساوب ونظم QF-QUAS ) لتوليد المورفولوجية التي لديها ثوابت متعددة (مثل فلوروفوريس، خطوط [رني] أو غيرها بنيات الوراثية) أعربت في وقت واحد في مجموعة من أنسجة مختلفة39.

استخدام هذا النموذج الخوادر المورفولوجية الجديد يوفر عددا من المزايا على نهج الجنين أكثر تقليدية. مقارنة لتصوير قصيرة الأجل (ما يصل إلى 3 ح) متاح في المرحلة 15 الأجنة (المرحلة الجنينية الأكثر إصابة الدراسات التي يتم تنفيذها)، يمكن تصويرها الخوادر لفترات أطول بشكل ملحوظ من الزمن (في رأس مال حتى سن البلوغ بعد 96 ساعة تنمية الخوادر ). وعلاوة على ذلك، يتم إعداد أكبر بكثير من هيموسيتيس (خلايا المناعة الفطريةالمورفولوجية ) موجودة داخل الأنسجة الخوادر (والمتاحة لتصوير) مقارنة بعدد محدود أكثر موجودة داخل الجنين وهذا سمح لنا بجمع أكبر بكثير تصوير البيانات المتعلقة بالسلوك هيموسيتي باستخدام نفس العدد الإجمالي للعينات. من الأهمية بمكان، بدوره، قد أتاح لنا تطبيق النمذجة الرياضية أكثر تطورا تحليل سلوك هيموسيتيس واستخراج ميزات الرواية عناصر الجرح واستجابة التحريضية التي أن بقيت خلاف ذلك تجريبيا يتعذر الوصول إلى23. وثمة ميزة أخرى من طراز الخوادر أكثر كفاءة بكثير من أن ضربة قاضية [رني] بوساطة الجينات في وقت سابق المراحل الجنينية، مما يتيح تحسين تحليل الأنسجة أو المنظمة الجينات محددة زمنياً باستخدام نظم ثنائي مثل نظام Gal4-UAS 39-الكفاءة [رني] في هذه المرحلة مما يفتح إمكانات لتنفيذ واسع النطاق (أو حتى غير منحازة على نطاق الجينوم) [رني] شاشات للبحث عن رواية اللاعبين المشاركين في إصلاح الجرح أو سلوك الخلية الملتهبة.

بيد الخوادر المورفولوجية واضح لا يمكن استخدامها لدراسة تعمل الناتجة عن الطفرات الوراثية التي الجنينية الفتاكة؛ ولذلك لا يزال يتعين إجراء الدراسات الفنية والتصوير ويعيش من الجينات التي تعتبر ضرورية لتطوير جنينية في الأجنة، إذا لم يكن ضربة قاضية [رني] بوساطة الجينات في الوقت أو طريقة محددة الأنسجة يسمح التنمية تحدث خلال المراحل الخوادر. ويظل الجنين أيضا نموذج الاختيار للدراسة والعيش والصورة ميزات معينة من السلوك الخلايا المناعية، منها تشتت التنموية للخلايا المناعية من أصلهم، والاتصال-تثبيط الحركة والبلعمه من الجثث أبوبتوتيك ولدت خلال النسيج التنموي النحت5،8 التي لم تراع في نماذج الخوادر. على الرغم من أن الدراسات المورفولوجية اليرقات والكبار قدمت نظرة ثاقبة هامة في الآليات التي يقوم عليها الجرح إصلاح والتهاب40،،من4142،43، وقد أثبتت الدراسات تصوير يعيش 44 في هذه المراحل صعبة بسبب طبيعتها متحركة طبيعة العينات. بينما يمكن تخديره اليرقات للسماح لفترات قصيرة للعيش-التصوير، نظراً للطابع المؤقت للتخدير، لقطات قصيرة فقط من الجرح يعيش إصلاح أو الاستجابة الالتهابية يمكن أن تصور45. الآن وضعت دراسة أجريت مؤخرا على بروتوكول محسنة التي تسمح بتصوير أطول أجلاً من اليرقات الجرح شفاء46، على الرغم من أن إعداد والتصوير لا يزال يبقى تحديا أكبر بكثير مما في الأجنة أو الخوادر. على المدى الطويل، ونحن نتصور أن باستخدام مرحلة النمو الأكثر ملاءمة لمعالجة كل مسألة محددة، دراسات في أربعة كل مرحلة من هذه المراحل المورفولوجية المختلفة-من الأجنة من خلال فترات اليرقات والخوادر إلى سن البلوغ (مع كل مزايا فريدة من نوعها والخاصة القيود)-سيوفر رؤى مكملة في الآلية الجزيئية والخلوية يقود إصلاح الجرح والتهاب.

في المستقبل، هذا البروتوكول لإصابة وتصوير طويلة الأجل الخوادر المورفولوجية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة مجموعة من الظواهر المرتبطة بالتهاب وإمكانات واسعة النطاق للكشف عن ميزات الرواية استجابة التهاب الجرح. مزيج تصوير طويل الأجل، جنبا إلى جنب مع تطبيق فلوروفوريس فوتوكونفيرتيبلي (مثل كايد)، ذات قيمة كبيرة لفهم ديناميات السلوك خلية المناعة الفطرية وعلى وجه الخصوص، أقصى أقل فهم مرحلة القرار رد التهاب الجرح. بوصفها على وجه التحديد أما الأفراد أو الفئات السكانية الفرعية من الخلايا المناعية (مثل هؤلاء المعينين لجرح) سيكون من الممكن لتحليل كيفية تأثير التعرض إلى جديلة واحدة البيئية (مثل الجثة أو إصابة) استجابة للخلية المناعية اللاحقة إلى وقت لاحق جديلة. يمكن تغيير سلوك هيموسيتيس المورفولوجية الملتهبة بالخبرات السابقة--على سبيل المثال، أنها هي تستعد للاستجابة إلى إصابة نسيج طريق البلعمه السابقة apoptotic الجثث خلال التنمية12 لكن يبقى أن نرى ما إذا كان حمل منبهات بيئية أخرى مماثلة فتيلة الأحداث. على الرغم من أن الدراسات الخوادر الجروح حتى الآن قد ركزت على استجابة الالتهابات الفطرية، الطراز الخوادر الجناح أيضا يوفر فرصة مثالية لكل صورة العيش وتشريح الآليات الأساسية لإصلاح الجرح الظهارية. وعلاوة على ذلك، يمكن أيضا تكييف هذا الأسلوب التصوير الخوادر للتحقيق في السلوك الديناميكي للأنساب خلية أخرى استجابة للأنسجة الضرر38، أما في الجناح الخوادر نفسها أو الأنسجة الأخرى الخوادر يسهل الوصول إليها (مثل العينين أو الساقين أو الصدر). أخيرا، عن طريق الجمع بين الصوبة الوراثية من المورفولوجية جنبا إلى جنب مع سهولة تصوير الخوادر طويلة الأجل، إصلاح الظهارية رواية أو المنظمين التحريضية يمكن اكتشافه من خلال التطبيق غير منحازة على نطاق الجينوم تدق لأسفل النهج.

الإفصاحات

ويعلن الكتاب لديهم لا تضارب المصالح المتنافسة.

شكر وتقدير

ونود أن نشكر أعضاء مارتن، نوبس، ريتشاردسون ومعامل الخشب لمناقشة مفيدة. ونشكر أيضا مرفق بيويماجينج وولفسون (جامعة بريستول، المملكة المتحدة)، بلومينغتون مخزون المركز (جامعة إنديانا، الولايات المتحدة الأمريكية)، ومركز الموارد المورفولوجية فيينا (بالنسبة للأرصدة المورفولوجية ) وفليبس (بالنسبة حتى الآن المورفولوجية جين التعليق التوضيحي). أيد هذا العمل "منحة المشروع لجنة نهر الميكونج" إلى بعد الظهر وقد (MR/J002577/1)، ويلكوم ترست زمالة كبار على قد وويلكوم ترست جائزة المحقق إلى بعد الظهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>ذبابة الفاكهة < / em>< / strong>stocks< / strong>
في كل مكان GFP الموسومة E-cadherin
; Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)< / em>		مركز كيوتو للمخزون ، DGRC# 109007تسلسلات المروج Ubi-p63E تقود التعبير عن ذبابة الفاكهة < / em>E-cadherin (shotgun< / em>) الموسومة في نهاية C-terminal مع GFP.
في كل مكان GFP-tagged E-cadherin
;; Ubi-p63E-shg.GFP (III)< / em>		Bloomington ذبابة الفاكهة< / em> مركز الأسهم (جامعة إنديانا)# 58742تسلسلات المروج Ubi-p63E تقود التعبير عن ذبابة الفاكهة < / em>E-cadherin (shotgun< / em>) الموسومة في نهاية المحطة C مع GFP.
في كل مكان موسومة GFP Moesin
P{sGMCA}3.1		Bloomington ذبابة الفاكهة مركز الأسهم (جامعة إنديانا)#59023يقود المروج / المحسن sqh المعبر عنه في كل مكان التعبير عن جزء من Moesin (يتضمن تسلسلات ربط الأكتين) الموسومة ب GFPS65T.
hemocyte محددة الثعبان Gal4 سائق
; srp-Gal4 ؛ < / em>		تم إنشاؤه بواسطة Katja Brucknerإنشاؤه بواسطة Katja Brucknerالتعبير عن Scer \ GAL4 المدمجة في ذيل polyA تحت سيطرة تسلسلين جينيين من المنبع من ثعبان ذبابة الفاكهة< / em>. المرجع: Brü ckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., R & oslash; rth, P., Perrimon, N. يتحكم مستقبلات PDGF / VEGF في بقاء خلايا الدم في ذبابة الفاكهة. خلية التطوير. 7 (1) ، 73 & - ndash ؛ 84 ، DOI: 10.1016 / j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP
w1118;; P{UAS-RedStinger}6		Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Centre (جامعة إنديانا)#8545 أو #8547تسلسلات UAS التنظيمية تقود التعبير عن شكل DsRed.T4 من RFP الذي تم وضع علامة عليه في نهاية المحطة C بإشارة توطين نووية
UAS-cytoplasmicGFP
;; P{UAS-GFP. S65T}< / em>		Bloomington ذبابة الفاكهة< / em> مركز الأسهم (جامعة إنديانا)مخزونات متعددة متاحة (على سبيل المثال # 1522)التعبير عن إصدار S65T من GFP بواسطة التسلسلات التنظيمية للطائرات بدون طيار ؛ يظهر متغير S65T سطوعا متزايدا.
UAS-photoconvertibleKaede
w1118;; P{UAS-Kaede.A}3		Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Centre (جامعة إنديانا)#26161ينبعث بروتين Kaede من تأليء أخضر ساطع بعد التوليف، ولكنه يتغير بكفاءة إلى مضان أحمر ساطع مستقر عند التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية.
GFP-tagged spaghetti squash
w1118;; P{sqh-GFP.RLC}		Bloomington ذبابة الفاكهة Stock Centre (جامعة إنديانا)#57145يتم التعبير عن منطقة الترميز sqh، التي تم وضع علامة عليها في الطرف C بعلامة T:Avic\GFPS65T، تحت سيطرة مروج sqh الطبيعي.
nameCompanyCatalog NumberComments
مكونات وسائط طعام الذبابFly Food Media مصنوعة وفقا للإجراءات القياسية (انظر Greenspan، R. 1997. دفع الذبابة: نظرية وممارسة ذبابة الفاكهة الوراثية. مطبعة كولد سبرينج هاربور 1-191 ص)
الذرةالشوفان البري ، بريستول ، المملكة المتحدة (أو مورد مكافئ)اتصل بالمورد دقيقالصويا العضوي
المباشر الشوفان البري ، بريستول ، المملكة المتحدة (أو ما يعادله)اتصل بالمورد مستخلصالشعير العضوي
الشوفان البري ، بريستول ، المملكة المتحدة (أو ما يعادله)بالموردالسكر العضوي
المباشر الشوفان البري ، بريستول ، المملكة المتحدة (أو ما يعادله)اتصل بنا المورد العضوي المباشر
Difco agarBD Biosciences ، Fisher ScientificDF0142-15-2لتحضير طعام الذباب
حمض البروبيونيكسيجما402907لإعداد طعام الذباب
NipagenSigma79721لتحضير طعام الذباب
خميرة الخباز المجففةRedstar ، Dutscher Scientific ، UK LTDRedstar ، Dutscher Scientific ، UK LTDلإعداد طعام الذبابة
<قوي>الاسم< / قوي><قوي>الشركة< / strong> رقم الكتالوجتعليقات
إعداد العينة وتركيبها< / strong>
ParafilmSigmaP7793-1EAلتحضير الغراء السباعي
السمور الناعم فرشاة الرسمDaler-Rowney (أو ما يعادلها)# 0 أو 1
ملقطفيشر Scientific (أو أدوات العلوم الدقيقة)NC9404145Dumont # 5
أطباق ذات قاع زجاجي للتصويرMatTekP35G-0-10-Cنقترح استخدام أطباق بتري مقاس 35 مم ، مع زجاج غطاء 10 مم على الأقل ، 0.085-0.13 مم ، غير مطلي. ستمكن الأطباق ذات الآبار الصغيرة الأكبر من تركيب أعداد متزايدة من الشرانق وتصويرها في تجربة واحدة.
HeptaneSigma51730-5MLلتحضير غراء السباعي
لاصق على الوجهين (مثل سكوتش)Agar ScientificAGG263لتحضير أنبوب الغراء السباعي
50 مل (لغراء السباعيأنابيب الصقر من فيشر Scientific14-432-22لتحضير غراء السباعي
المجهر الزجاجيAgar ScientificAGL4244لتشريح ذبابة الفاكهة < / em> شرانق
تشريح مجهر ستيريو باستخدام لايكا (أو ما يعادلها)M50لتشريح <م >ذبابة الفاكهة < م > الشرانق
مقص دقيقجون فايس الدولي103123مقص أبحاث مصغرة جون فايس الدولي (مستقيم)
<قوي>الاسم < / قوي> <قوي>شركة < / قوي ><قوي> رقم الكتالوج<قوي>تعليقات
<قوي>الاستئصال بالليزر والتصوير
ليزر استئصال النيتوجينطيف الفيزياء (أو ما يعادله أندور)موديل VSL-337ND-Sللجرح، يجب إرفاق هذا بنظام تصوير واسع
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر متعدد الليزر (CLSM)Leica (أو ما يعادله)TCS AOBS SP8 أو SP5-II متصل بمجهر Leica DMi8 المقلوب epifluorescence (أو ما يعادله)من الناحية المثالية بما في ذلك مرحلة آلية للمسح الضوئي متعدد المواقع و "الفسيفساء" ، بالإضافة إلى ' هجين' كاشفات GaAsP (التي توفر حساسية أكبر بكثير وتعزيز الإشارة المنخفضة)
في الغرفة البيئية(أو ما يعادلها)"نظام التحكم في درجة حرارة المجهر"متصل بالمجهر متحد البؤر للتحكم في درجة الحرارة أثناء التصوير
<قوي>الاسم < / قوي ><قوي>الشركة< / قوي ><قوي>رقم الكتالوج < / قوي ><قوي> تعليقات< / strong>
برنامج تحليل الصور< / قوي >
FRAP وحدة البرمجياتLeica (أو ما يعادلها)CLSM FRAP وحدة البرمجياتلإجراء التحويل الضوئي للفلوروفورات القابلة للتحويل الضوئي مثل Kaede
ImageJ (برنامج تحليل الصور) المعاهدالوطنية للصحة (NIH)https://imagej.nih.gov/ij/شنايدر ، سي إيه ، راسباند ، دبليو إس ، إليسيري ، ك.د. "صورة المعاهد الوطنية للصحة إلى ImageJ: 25 عاما من تحليل الصور". طرق الطبيعة 9, 671-675, 2012.
المساعد ImageJ "التتبع اليدوي"المعاهدالوطنية للصحة (NIH)https://imagej.net/Manual_Tracking
المساعد ImageJ "TrackMate"ImageJ, NIHhttps://imagej.net/TrackMateTinevez, JY. بيري ، ن. & أمبير Schindelin، J. et al. (2016) ، "TrackMate: منصة مفتوحة وقابلة للتوسيع لتتبع الجسيمات الواحدة." ، الطرق 115: 80-90 ، PMID 27713081
Volocity (برنامج تصوير ثلاثي الأبعاد عالي الأداء) PerkinElmerVolocity 6.3لتحليل الصور
IMARIS (برنامج تحليل الصور)BitplaneIMARIS لعلماء الأحياء الخلويةلتحليل الصور
تم المباشراتصل دبس شريط ) شرائح النطاقخدمات تصوير الحياة البرنامج البرنامج

المراجع

  1. Eming, S. A., Wynn, T. A., Martin, P. Inflammation and metabolism in tissue repair and regeneration. Science. 356 (6342), 1026-1030 (2017).
  2. Crusz, S. M., Balkwill, F. R. Inflammation and cancer: advances and new agents. Nature Reviews Clinical Oncology. 12 (10), 584-596 (2015).
  3. Martin, P., Nunan, R. Cellular and molecular mechanisms of repair in acute and chronic wound healing. British Journal of Dermatology. 173 (2), 370-378 (2015).
  4. Razzell, W., Wood, W., Martin, P. Swatting flies: modelling wound healing and inflammation in Drosophila. Disease Model and Mechanism. 4 (5), 569-574 (2011).
  5. Wood, W., Martin, P. Macrophage Functions in Tissue Patterning and Disease: New Insights from the Fly. Development Cell. 40 (3), 221-233 (2017).
  6. Mohr, S. E., Smith, J. A., Shamu, C. E., Neumüller, R. A., Perrimon, N. RNAi screening comes of age: improved techniques and complementary approaches. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (9), 591-600 (2014).
  7. Muñoz-Soriano, V., López-Domenech, S., Paricio, N. Why mammalian wound-healing researchers may wish to turn to Drosophila as a model. Experimental Dermatology. 23 (8), 538-542 (2014).
  8. Weavers, H., Wood, W. Creating a Buzz about Macrophages: The Fly as an In Vivo Model for Studying Immune Cell Behavior. Developmental Cell. 38 (2), 129-132 (2016).
  9. Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. Journal of Cell Biology. 168 (4), 567-573 (2005).
  10. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biolog. 173 (3), 405-416 (2006).
  11. Razzell, W., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Calcium flashes orchestrate the wound inflammatory response through DUOX activation and hydrogen peroxide release. Current Biology. 23 (5), 424-429 (2013).
  12. Weavers, H., Evans, I. R., Martin, P., Wood, W. Corpse Engulfment Generates a Molecular Memory that Primes the Macrophage Inflammatory Response. Cell. , (2016).
  13. Stramer, B., Winfield, M., Shaw, T., Millard, T. H., Woolner, S., Martin, P. Gene induction following wounding of wild-type versus macrophage-deficient Drosophila embryos. EMBO Reports. 9 (5), 465-471 (2008).
  14. Matsubayashi, Y., Coulson-Gilmer, C., Millard, T. H. Endocytosis-dependent coordination of multiple actin regulators is required for wound healing. Journal of Cell Bioliogy. 210 (3), 419-433 (2015).
  15. Evans, I. R., Rodrigues, F. S. L. M., Armitage, E. L., Wood, W. Draper/CED-1 Mediates an Ancient Damage Response to Control Inflammatory Blood Cell Migration In Vivo. Current Biology. 25 (12), 1606-1612 (2015).
  16. Zanet, J., Stramer, B., Millard, T., Martin, P., Payre, F., Plaza, S. Fascin is required for blood cell migration during Drosophila embryogenesis. Development. 136 (15), 2557-2565 (2009).
  17. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66, 57-80 (1981).
  18. Ninov, N., Martín-Blanco, E. Live imaging of epidermal morphogenesis during the development of the adult abdominal epidermis of Drosophila. Nature Protocols. 2 (12), 3074-3080 (2007).
  19. Gho, M., Bellaïche, Y., Schweisguth, F. Revisiting the Drosophila microchaete lineage: a novel intrinsically asymmetric cell division generates a glial cell. Development. 126 (16), 3573-3584 (1999).
  20. Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
  21. Berh, D., Scherzinger, A., Otto, N., Jiang, X., Klämbt, C., Risse, B. Automatic non-invasive heartbeat quantification of Drosophila pupae. Computers in Biology and Medicine. 93, 189-199 (2018).
  22. Sander, M., Squarr, A. J., Risse, B., Jiang, X., Bogdan, S. Drosophila pupal macrophages--a versatile tool for combined ex vivo and in vivo imaging of actin dynamics at high resolution. European Journal of Cell Biology. 92 (10-11), 349-354 (2013).
  23. Weavers, H., Liepe, J., Sim, A., Wood, W., Martin, P., Stumpf, M. P. H. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26 (15), 1975-1989 (2016).
  24. Fristrom, D., Wilcox, M., Fristrom, J. The distribution of PS integrins, laminin A and F-actin during key stages in Drosophila wing development. Development. 117 (2), (1993).
  25. Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Development Cell. 7 (1), 73-84 (2004).
  26. Berg, H. Random Walks in Biology. , Princeton University Press. Available from: http://press.princeton.edu/titles/112.html (1993).
  27. Diehl, H., Ihlefield, H., Schwegler, H. Physik fur Biologen. , Springer-Verlag. (1991).
  28. Stewart, P. S., McFeters, G. A., Huang, C. T. Biofilm control by antimicrobial agents. Biofilms II Process Analysis and Application. , 373-405 (2000).
  29. Milo, R., Phillips, R. Cell Biology by the Numbers. , Garland Science. Available from: https://books.google.com/books?id=9NPRCgAAQBAJ&pgis=1 (2015).
  30. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceeding of National Academy of Science U S A. 99 (20), 12651-12656 (2002).
  31. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Cordelières, F. Manual tracking. National Institutes of Health. , Available from: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2015).
  34. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  35. Grueber, W., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
  36. Wood, W., Faria, C., Jacinto, A. Distinct mechanisms regulate hemocyte chemotaxis during development and wound healing in Drosophila melanogaster. Journal of Cell Biology. 173 (3), 405-416 (2006).
  37. Wood, W., et al. Wound healing recapitulates morphogenesis in Drosophila embryos. Nature Cell Biology. 4 (11), 907-912 (2002).
  38. Franz, A., Wood, W., Martin, P. Fat Body Cells Are Motile and Actively Migrate to Wounds to Drive Repair and Prevent Infection. Developmetal Cell. 44 (4), 460-470 (2018).
  39. del Valle Rodríguez, A., Didiano, D., Desplan, C. Power tools for gene expression and clonal analysis in Drosophila. Nature Methods. 9 (1), 47-55 (2012).
  40. Losick, V. P., Fox, D. T., Spradling, A. C. Polyploidization and Cell Fusion Contribute to Wound Healing in the Adult Drosophila Epithelium. Current Biology. 23 (22), 2224-2232 (2013).
  41. Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proceedings of National Academy of Science U S A. 105 (29), 10017-10022 (2008).
  42. Galko, M. J., et al. Cellular and Genetic Analysis of Wound Healing in Drosophila Larvae. PLoS Biology. 2 (8), e239(2004).
  43. Brock, A. R., et al. Transcriptional regulation of Profilin during wound closure in Drosophila larvae. Journal of Cell Science. 125 (23), (2013).
  44. Wu, Y., Brock, A. R., Wang, Y., Fujitani, K., Ueda, R., Galko, M. J. A blood-borne PDGF/VEGF-like ligand initiates wound-induced epidermal cell migration in Drosophila larvae. Current Biology. 19 (17), 1473-1477 (2009).
  45. Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila Larvae to Study Epidermal Wound Closure and Inflammation. Methods in Molecular Biology. 1037, 449-461 (2013).
  46. Kakanj, P., et al. Insulin and TOR signal in parallel through FOXO and S6K to promote epithelial wound healing. Nature Communications. 7, 12972(2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNAi

مقالات ذات صلة