الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الصغير-الكشف (ميرناس) هي النصوص الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي ربط الكشف رسول (مرناس) وتحول دون ترجمتها أو الترويج عن التدهور. وحتى الآن، قد تورط ميرناس في عدد كبير من العمليات البيولوجية والمرض، والتي قد تدل على الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين ميرنا المستندة إلى المسبار الكشف، جنبا إلى جنب مع البروتين إيمونوستاينينج على أبواب القلب الماوس. أولاً، أجرينا في الموقع تهجين أسلوب استخدام التحقيق لتحديد التعبير ميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم وتضخم القلب الفئران. بعد ذلك، أجرينا إيمونوستينينج للقلب بروتين "تروبونين تي" (كتنت)، على نفس المقاطع، شارك تعريب ميرنا-182 مع الخلايا كارديوميوسيتي. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على اكتشاف ميرنا-182 من خلال الفوسفاتيز قلوية على أساس مقايسة اللونية، وكتنت من خلال تلطيخ الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن التعبير عن أي ميرنا من الفائدة من خلال تحقيقات LNA المسمى حفر، وتعبير البروتينات ذات الصلة على أبواب أنسجة القلب الماوس.
المقدمة
الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ماوس القلب عينات الأنسجة لهذه الدراسة تم الحصول عليها وفقا للقوانين ذات الصلة والمبادئ التوجيهية للمؤسسات ووافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة ييل.
1-حل إعداد
- إعداد رناسي ddH الحرة2س، بعلاج ل 5 من ddH2س مع 5 مل من 0.1% ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك) بين عشية وضحاها (O/N)، في درجة حرارة الغرفة (RT). اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية) لإلغاء تنشيط في ديبك. وأشار إلى استخدام المعالجة ديبك ddH2س للإعداد الحلول النهائية ك.
تنبيه: ديبك مسرطن معروف، معالجة فقط في غطاء الدخان. - إعداد x 1 فوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل بتذويب 5 أقراص برنامج تلفزيوني في 1 لتر من تعامل ديبك ddH2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ميرنا التهجين في الموقع الأمثل على أبواب القلب الماوس باستخدام ميرنا التدافع و U6-سنرنا، كانت بمثابة عناصر سلبية وإيجابية على التوالي. يرد تلطيخ إيجابية باللون الأزرق، بينما تلطيخ سلبي يرد بعدم وضع اللون (الشكل 1A-1B). تم تقييم التعبير كارديوميوسيتي محددة لميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم والفئران overexpressing بلجف. وضع الفئران تحمل التحوير بلجف تحت مروج αMHC تضخم القلب، ثانوية بالنسبة للأوعية زيادة، في غضون 6 أسابيع من التحوير ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يمكن تحقيق ميرنا نسخة الكشف من خلال التقنيات المختلفة التي تختلف في حساسية وخصوصية وكمية الطاقة. هنا، علينا أن نبدي اقتران ميرنا في الموقع التهجين مع إيمونوستاينينج ووصف بروتوكول يسمح لتقييم مستويات التعبير من جزيئات البروتين وميرنا، على نفس المقاطع القلب المتزامنة. نحن أولاً إظهار كيفية إجراء التهجين في الموقع من المسابر ميرنا LNA المسمى حفر على أبواب القلب البارافين المضمنة. المقبل، ونحن تصف كيفية تنفيذ إيمونوستاينينج كتنت في نفس المقاطع. أخيرا، نحن لشرح كيفية دمج الألوان الناتجة والصور الفلورية. وقد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نود أن نشكر أثاناسيوس بابانجيليس، للتعليقات الانتقادية على المخطوطة. FM معتمد بواسطة التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC؛ BB/M009424/1). IP تدعمها "أمريكية قلب جمعية العلماء التنمية المنحة" (17SDG33060002).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ثنائي إيثيل بيروكاربونات | سيجما ألدريتش | D5758 | DEPC |
| فوسفات محلول ملحي | مخزن سيجما ألدريتش | P4417 | PBS |
| Tween-20 | التحليل الحيوي | الأمريكي AB02038 | الخافض للتوتر السطحي غير الأيوني |
| Histoclear | National Diagnostics | HS-200 | |
| Proteinase K ، مؤتلف ، PCR Grade | Sigma | Aldrich 3115879001 | ProK |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | PFA |
| كلوريد الصوديوم | ThermoFisher | S271 | كلوريد الصوديوم |
| الصوديوم سداسي هيدرات | ThermoFisher | M33 | MgCl2 |
| Tris | Sigma Aldrich | T6066 | |
| حمض الهيدروكلوريك ، 1 N | ThermoFisher | SA48 | HCl |
| محلول حمض الهيدروكلوريك ، 12 | N ThermoFisher | S25358 | HCl |
| 1-Methylimidazole | Sigma Aldrich | 336092 | |
| N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & Prime ؛ -ethylcarbodiimide هيدروكلوريد | Sigma Aldrich | 39391 | EDC |
| محلول بيروكسيد الهيدروجين H2< / sub>O2< / sub> | Sigma Aldrich | 216763 | H2< / sub>O2< / sub> |
| سيترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدرات | سيجما ألدريتش | S1804 | سترات الصوديوم |
| miRCURY LNA miRNA ISH مجموعة العازلة (FFPE) | Qiagen | 339450 | التدافع miRNA / U6 snRNA |
| miRCURY LNA mmu-miR-182 مسبار الكشف | QIagen | YD00615701 | 5'-DIG و 3'-DIG المسمى |
| ليفاميزول هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | 31742 | |
| ألبومين مصل الأبقار | سيجما ألدريتش | A9647 | أقراص BSA |
| NBT / BCIP | أقراص سيجما ألدريتش | 11697471001 | NBT-BCIP |
| كلوريد البوتاسيوم | ThermoFisher | P217 | KCl |
| محلول DAPI (1 مجم / مل) | ThermoFisher | 62248 | DAPI |
| غطاء زجاجي | ThermoFisher | 12-545E | غطاء زجاجي |
| بلاستيكي | Grace Bio-Labs | HS40 22mmX40mmX0.25mm | RNA-ase غطاء بلاستيكي |
| خال مضاد ل Digoxigenin-AP ، شظايا فاب | Sigma Aldrich | 11093274910 | DIG الأجسام المضادة |
| قلم حاجز مسعور | مختبرات ناقلات | H-4000 | قلم عنق الرحم |
| المضاد للقلب Troponin T الجسم المضاد | Abcam | ab92546 | cTnT |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Alexa Fluor 568 | ThermoFisher | A-11011 | المضاد للأرانب -568 الجسم المضاد |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | DAKO | S3023 | تصاعد مصل |
| الأغنام | المتوسط Sigma Aldrich | S3772 | |
| مصل الماعز | Sigma Aldrich | G9023 | |
| فورماميد أمريكي منزوع الأيونات | AB00600 | ||
| الحيوي ThermoFisher | UVP HB-1000 Hybridizer |
المراجع
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
- Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
- Hu....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
