Method Article

ميرنا الأنسجة على حدة "التعبير التنميط" في "أقسام القلب الماوس باستخدام" التهجين في الموقع

DOI:

10.3791/57920

⸱

September 15th, 2018

 ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, University College London, 2Yale Cardiovascular Research Group, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine, 3Yale Cardiovascular Research Center, Section of Cardiovascular Medicine, Yale School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصغير-الكشف (ميرناس) تسلسل الحمض النووي الريبي قصيرة وعالية مثلى، بوصفه بوستترانسكريبشونال المنظمين للكشف رسول (مرناس). وتختلف طرق الكشف عن ميرنا الحالية في حساسية وخصوصية. ونحن تصف بروتوكول الذي يجمع بين التهجين في الموقع وإيمونوستينينج للكشف عن جزيئات البروتين وميرنا على أبواب أنسجة القلب الماوس المتزامنة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصغير-الكشف (ميرناس) هي النصوص الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل التي ربط الكشف رسول (مرناس) وتحول دون ترجمتها أو الترويج عن التدهور. وحتى الآن، قد تورط ميرناس في عدد كبير من العمليات البيولوجية والمرض، والتي قد تدل على الحاجة إلى أساليب الكشف عن موثوقية النصوص ميرنا. هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للحمض النووي مؤمناً (حفر) (LNA) المسمى ديجوكسيجينين ميرنا المستندة إلى المسبار الكشف، جنبا إلى جنب مع البروتين إيمونوستاينينج على أبواب القلب الماوس. أولاً، أجرينا في الموقع تهجين أسلوب استخدام التحقيق لتحديد التعبير ميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم وتضخم القلب الفئران. بعد ذلك، أجرينا إيمونوستينينج للقلب بروتين "تروبونين تي" (كتنت)، على نفس المقاطع، شارك تعريب ميرنا-182 مع الخلايا كارديوميوسيتي. باستخدام هذا البروتوكول، كنا قادرين على اكتشاف ميرنا-182 من خلال الفوسفاتيز قلوية على أساس مقايسة اللونية، وكتنت من خلال تلطيخ الفلورسنت. يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن التعبير عن أي ميرنا من الفائدة من خلال تحقيقات LNA المسمى حفر، وتعبير البروتينات ذات الصلة على أبواب أنسجة القلب الماوس.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصغير-الكشف (ميرناس) قصيرة (18 – 25 النيوكليوتيدات)، واحد-الذين تقطعت بهم السبل، وفضله الكشف التي تؤدي وظيفة المنظمين السلبية للتعبير الجيني على المستوى بوستترانسكريبشونال بتثبيط الحمض النووي الريبي الرسول (مرناً) ترجمة و/أو تعزيز تدهور مرناً 1-يتم نسخها ميرناس من إينترونس أو exons من الترميز أو المشقوق فضله، والجينات في النواة من دروشا، للسلائف ميرناس (ما قبل-ميرناس)، وهياكل الجذعية-حلقة قصيرة من النيوكليوتيدات 702. عقب هيولى الصادرات، وكذلك معالجة قبل ميرناس بواسطة ديسير في ميرناس الناضجة التي تمتد 18 – 25 النيوكليوتيدات3،4. وفي وقت لاحق، المجمع إسكات المستحثة....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ماوس القلب عينات الأنسجة لهذه الدراسة تم الحصول عليها وفقا للقوانين ذات الصلة والمبادئ التوجيهية للمؤسسات ووافقت عليها لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية جامعة ييل.

1-حل إعداد

  1. إعداد رناسي ddH الحرة2س، بعلاج ل 5 من ddH2س مع 5 مل من 0.1% ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك) بين عشية وضحاها (O/N)، في درجة حرارة الغرفة (RT). اﻷوتوكﻻف (121 درجة مئوية) لإلغاء تنشيط في ديبك. وأشار إلى استخدام المعالجة ديبك ddH2س للإعداد الحلول النهائية ك.
    تنبيه: ديبك مسرطن معروف، معالجة فقط في غطاء الدخان.
  2. إعداد x 1 فوسفات مخزنة المالحة (PBS) الحل بتذويب 5 أقراص برنامج تلفزيوني في 1 لتر من تعامل ديبك ddH2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميرنا التهجين في الموقع الأمثل على أبواب القلب الماوس باستخدام ميرنا التدافع و U6-سنرنا، كانت بمثابة عناصر سلبية وإيجابية على التوالي. يرد تلطيخ إيجابية باللون الأزرق، بينما تلطيخ سلبي يرد بعدم وضع اللون (الشكل 1A-1B). تم تقييم التعبير كارديوميوسيتي محددة لميرنا-182 في أقسام القلب من التحكم والفئران overexpressing بلجف. وضع الفئران تحمل التحوير بلجف تحت مروج αMHC تضخم القلب، ثانوية بالنسبة للأوعية زيادة، في غضون 6 أسابيع من التحوير ا.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تحقيق ميرنا نسخة الكشف من خلال التقنيات المختلفة التي تختلف في حساسية وخصوصية وكمية الطاقة. هنا، علينا أن نبدي اقتران ميرنا في الموقع التهجين مع إيمونوستاينينج ووصف بروتوكول يسمح لتقييم مستويات التعبير من جزيئات البروتين وميرنا، على نفس المقاطع القلب المتزامنة. نحن أولاً إظهار كيفية إجراء التهجين في الموقع من المسابر ميرنا LNA المسمى حفر على أبواب القلب البارافين المضمنة. المقبل، ونحن تصف كيفية تنفيذ إيمونوستاينينج كتنت في نفس المقاطع. أخيرا، نحن لشرح كيفية دمج الألوان الناتجة والصور الفلورية. وقد .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر أثاناسيوس بابانجيليس، للتعليقات الانتقادية على المخطوطة. FM معتمد بواسطة التكنولوجيا الأحيائية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (BBSRC؛ BB/M009424/1). IP تدعمها "أمريكية قلب جمعية العلماء التنمية المنحة" (17SDG33060002).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ثنائي إيثيل بيروكاربوناتسيجما ألدريتشD5758DEPC
فوسفات محلول ملحيمخزن سيجما ألدريتشP4417PBS
Tween-20التحليل الحيويالأمريكي AB02038الخافض للتوتر السطحي غير الأيوني
HistoclearNational DiagnosticsHS-200
Proteinase K ، مؤتلف ، PCR GradeSigmaAldrich 3115879001ProK
ParaformaldehydeSigma AldrichP6148PFA
كلوريد الصوديومThermoFisherS271كلوريد الصوديوم
الصوديوم سداسي هيدراتThermoFisherM33MgCl2
TrisSigma AldrichT6066
حمض الهيدروكلوريك ، 1 NThermoFisherSA48HCl
محلول حمض الهيدروكلوريك ، 12N ThermoFisherS25358HCl
1-MethylimidazoleSigma Aldrich336092
N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & Prime ؛ -ethylcarbodiimide هيدروكلوريدSigma Aldrich39391EDC
محلول بيروكسيد الهيدروجين H2< / sub>O2< / sub>Sigma Aldrich216763H2< / sub>O2< / sub>
سيترات ثلاثي الصوديوم ثنائي هيدراتسيجما ألدريتشS1804سترات الصوديوم
miRCURY LNA miRNA ISH مجموعة العازلة (FFPE)Qiagen339450التدافع miRNA / U6 snRNA
miRCURY LNA mmu-miR-182 مسبار الكشفQIagenYD006157015'-DIG و 3'-DIG المسمى
ليفاميزول هيدروكلوريدسيجما ألدريتش31742
ألبومين مصل الأبقارسيجما ألدريتشA9647أقراص BSA
NBT / BCIPأقراص سيجما ألدريتش11697471001NBT-BCIP
كلوريد البوتاسيومThermoFisherP217KCl
محلول DAPI (1 مجم / مل)ThermoFisher62248DAPI
غطاء زجاجيThermoFisher12-545Eغطاء زجاجي
بلاستيكيGrace Bio-LabsHS40 22mmX40mmX0.25mmRNA-ase غطاء بلاستيكي
خال مضاد ل Digoxigenin-AP ، شظايا فابSigma Aldrich11093274910DIG الأجسام المضادة
قلم حاجز مسعورمختبرات ناقلاتH-4000قلم عنق الرحم
المضاد للقلب Troponin T الجسم المضادAbcamab92546cTnT
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي المتصاص ، Alexa Fluor 568ThermoFisherA-11011المضاد للأرانب -568 الجسم المضاد
Dako Fluorescence Mounting MediumDAKOS3023تصاعد مصل
الأغنامالمتوسط Sigma AldrichS3772
مصل الماعزSigma AldrichG9023
فورماميد أمريكي منزوع الأيونات AB00600
الحيوي ThermoFisherUVP HB-1000 Hybridizer
كلوريد محلول غطاء فرن تهجين التحليل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  2. Denli, A. M., Tops, B. B., Plasterk, R. H., Ketting, R. F., Hannon, G. J. Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432, 231-235 (2004).
  3. Hu....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationMicroRNA DetectionMouse Heart SectionsProtein ImmunostainingCardiac Troponin TDigoxigenin Labeled ProbeLocked Nucleic AcidAlkaline Phosphatase AssayFluorescent StainingTissue Section Preparation

Related Articles