بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية

وقد حددت ميرناس المتداولة كعلامات تبشر بالخير لعدد من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية¹. ميرناس الصغيرة، وغير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) وتشارك في التنظيم بوستترانسكريبشونال عن طريق تحوير الحمض النووي الريبي رسول الترجمة والتأثير على التعبير الجيني²، ويتم إصدارها للتداول في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. التعبير الكمي عن ميرناس معينة يمكن ربطها علم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية و خصوصية المرض¹. في أمراض القلب والأوعية الدموية، أصبحت ميرناس جاذبية المرشحين حسب المؤشرات الحيوية رواية كمياً لأنهم استقرارا ملحوظا في المصل ويمكن بسهولة مع المساعدة من منهجية بكر³. وقد تم تقييم القيمة المحتملة ميرناس كالمؤشرات الحيوية لاحتشاء عضلة القلب في دراسات صغيرة، ولكن التحقق من صحة في أفواج كبيرة تفتقر إلى². على سبيل المثال، يوجد مير-499 أعرب شديدة في عضلة عضلة القلب، وقد ثبت أن تحقيق زيادة كبيرة في أمي^4،،من⁵⁶. علاوة على ذلك، فإنه ينظم برمجة موت الخلايا (المبرمج) والتفريق بين كارديوميوسيتيس وهكذا تشارك في العديد من الآليات التالية عامي⁷. وبصرف النظر عن بعض الدراسات الصغيرة الإبلاغ التفوق والقيمة الإضافية ميرناس لتشخيص أمي، بالتفوق أو المساواة بحساسية عالية تروبونينس القلب لا بعد ثبت في دراسات واسعة النطاق^{2،5 ،،}من⁶⁸. ولذلك، المزيد من الدراسات المستقبلية في أفواج كبيرة ضرورية لتقييم قيمة التشخيص المحتملة ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، أساليب القياس الكمي ميرنا بحاجة إلى أن يكون الأمثل وموحدة باستخدام المقارنة بروتوكولات⁹. الاختبارات الموحدة قد يقلل من نتائج غير متناسقة وقد تساعد ميرناس لتصبح المؤشرات الحيوية المحتملة للتطبيق السريري الروتيني، كما تحتاج المؤشرات الحيوية كمياً بطريقة استنساخه لضمان قابليتها للتطبيق السريري.

وقد أدخلت مؤخرا، دبكر كتحليل نقطة نهاية. الأقسام العينة إلى ردود الفعل الفردية 20,000 حوالي الساعة¹⁰. ثم يستخدم النظام دبكر رياضية Poisson تحليلاً إحصائيا لإشارات الفلورسنت (ردود الفعل الإيجابية والسلبية)، تمكن القياس الكمي مطلق دون منحنى المعياري¹⁰. عند الجمع بين دبكر مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، أصبح ممكناً التقدير الكمي المطلق مباشرة محددة للغاية من ميرناس. أظهرت الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل يحمل الصفات التقنية العليا (بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية ودرجة عالية من الخطي وحساسية عالية) لقياس مستويات ميرنا في تداول مقارنة بالكمية في الوقت الحقيقي بكر^10،11. هذه الصفات التقنية المتفوقة قد يساعد على التخفيف من القيود المفروضة حاليا على استخدام ميرناس المتداولة كالمؤشرات الحيوية، وقد يؤدي إلى إنشاء ميرناس كالمؤشرات الحيوية في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة وأسلوب تشخيص في العامة. في دراسة سابقة، ونحن مؤخرا تطبيق دبكر للتحديد الكمي المطلق لتعميم ميرناس في المرضى الذين يعانون من أمي وكانت قادرة على إثبات إمكانية التشخيص متفوقة مقارنة بالتحديد الكمي ميرناس قبكر¹².

في هذا المنشور، نريد أن ندلل على أن استخدام دبكر طريقة دقيقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة تعميم ميرناس القلب والأوعية الدموية. التحديد الكمي المطلق لمستويات ميرنا في مصل الدم، استخدام PCR الرقمية، يظهر المحتملة للاستخدام كبير مركز متعدد التجارب السريرية القلب والأوعية الدموية. في هذا المنشور، ونحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ فعالية PCR الرقمية وكيفية الكشف عن عدد نسخ ميرنا المطلق في مصل الدم.

1-استخراج ميرنا من المصل/بلازما

ملاحظة: من أجل تحديد ميرناس على نحو ملائم، عزل ميكرورنا الصحيح من المصل/البلازما خطوة حاسمة. شيء رئيسي من أن نأخذ في الاعتبار، لا سيما بسبب وجود بروتوكولات مختلفة, على التمسك بنفس سير العمل أثناء معالجة العينات. في هذا البروتوكول، ويتم استخراج ميرنا من 50 ميليلتر من المصل. لا تستخدم أكثر من 200 ميليلتر كهذا الحد عملية الاستخراج الصحيح.

1. إعداد مصل أو ذوبان الجليد العينات المجمدة.
2. إضافة 250 ميليلتر (5 مجلدات) تحلل التجارية الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل. دعم تحلل فورتيكسينج. ضع الأنبوب مع على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
3. سبايك مع 3.5 ميليلتر من المصطلحات الخاصة بعنصر التحكم (1.6 × 10⁷ نسخة/ميليلتر) ومزجها فورتيكسينج.
4. إضافة 50 ميليلتر من كلوروفورم (أي، مبلغ مماثل فيما يتعلق بعينه المصل انطلاق) لفصل المرحلة. يهز الأنبوب بقوة لمكان س. 15 أنبوب على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
5. لفصل المرحلة، الطرد المركزي الأنبوب في س 12,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: يتم فصل العينات الآن إلى مرحلة مائي العلوي يحتوي على الجيش الملكي النيبالي ومن الطور البيني بيضاء، ومرحلة عضوية أقل الوردي.
6. نقل المرحلة المائية العليا (100 ميليلتر) يحتوي على الجيش الملكي النيبالي في أنبوب جديد. لا يتم تحويل أي مادة بيضاء الطور البيني كهذا تزيف تعداد الجيش الملكي النيبالي الصحيح.
7. إضافة 150 ميليلتر (أي1.5 x حجم العينة المنقولة) من الإيثانول 100%. خلط المواد التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً. عدم الطرد المركزي لهم، وسرعة الانتقال إلى الخطوة التالية.
8. "الماصة؛" 250 ميليلتر من العينة على عمود دوران تجاري في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15-التدفق عبر.
9. إضافة 700 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 1 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
10. إضافة 500 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 2 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > 8، 000 x ز في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
11. "الماصة؛" 500 ميليلتر من الإيثانول 80% على عمود الدوران. إغلاق الغطاء، والطرد المركزي العمود في > 8، تجاهل ز 000 x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 أنبوب جمع مع التدفق عبر.
12. نقل عمود الدوران إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة مع غطاء فتح الجاف للغشاء. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق عبر.
13. نقل عمود الدوران في أنبوب جمع 1.5 مل جديدة. الوت الجيش الملكي النيبالي بتطبيق 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي مباشرة إلى مركز للغشاء. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
14. مخزن الجيش الملكي النيبالي في-70 درجة مئوية.
    ملاحظة: يضمن التخزين لتنقية الحمض النووي الريبي في المياه خالية من رناسي بين-70 درجة مئوية إلى-20 درجة مئوية لا تدهور للجيش الملكي النيبالي لمدة سنة واحدة. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وهو الحد الأدنى لحجم المياه خالية من رناسي تمييع الجيش الملكي النيبالي 10 ميليلتر. استخدام أقل من 10 ميليلتر قد هيدرات الغشاء غير كاف وتقليل إجمالي العائد الجيش الملكي النيبالي.

2-عكس النسخ

ملاحظة: تم تصنيعه الحمض النووي التكميلية (كدنا) استخدام بروتوكول النسخ العكسي (RT) 15 ميليلتر التالية (رد فعل مجموع حجم).

1. ذوبان الجليد الطقم RT على الجليد. تبقى الإنزيمات في الثلاجة أطول وقت ممكن منعهم من اللاإنسانية وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام. ذوبان الجليد الإشعال RT على الجليد وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام.
2. إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 1.
3. الجمع بين 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي و 5 ميليلتر من الحمض النووي الريبي المستخرج كل بئر في صفيحة جيدا 96.
4. الطرد المركزي لوحة جيدا في 2,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
5. استخدام بروتوكول الدورة الحرارية المبينة في الجدول 2 للنسخ العكسي.
   ملاحظة: كما هو موضح أدناه، كدنا يجوز مباشرة معالجتها في جهاز PCR الرقمية (انظر الجدول للمواد)؛ وبدلاً من ذلك، قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية.

3-الحبرية جيل وبكر الرقمية

ملاحظة: الرقمية تم إجراء PCR باستخدام بروتوكول ميليلتر 40 التالية.

1. ذوبان الجليد مزيج دبكر التجارية، وكدنا استعداد والإشعال بكر على الجليد. الطرد المركزي لهم قبل وقت قصير من الاستخدام.
2. إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 3-
3. إضافة من المنتج RT 1.33 ميكروليتر/جيدا والطرد المركزي أنه بإيجاز.
4. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من العينة في كل بئر من كاسيت 8-جيدا (المتوسط الصف).
   ملاحظة: إذا لم يتم ملء كاسيت 8-جيدا تماما، تملأ الآبار المتبقية مع الضوابط غير القالب (NTCs) التي تسقط كدنا (أيالمنتج RT أنتجت مع المياه بدلاً من استخراج الحمض النووي الريبي) أو دبكر التجارية المخزن المؤقت. المجلس الوطني الانتقالي بمثابة عنصر تحكم تلوث. يجب عدم استخدام المياه في الآبار المتبقية، لأن ذلك سيضر بنوعية تشكيل الحبرية.
5. "الماصة؛" ميكروليتر 70 النفط جيل الحبرية للتحقيقات في آبار النفط (الصف السفلي) كاسيت 8-جيدا.
6. وضع طوقا على رأس كاسيت 8-جيدا ثم ضع الكاسيت في مولد الحبرية. قم بإغلاق منشئ الحبرية. الانتظار حتى أضواء مؤشر 3 أخضر خالص.
   ملاحظة: الآن يتم إنشاء قطرات.
7. بعناية وبطء نقل 40 ميكروليتر من عينة شكلت الحبرية (الصف العلوي) في آبار منفصلة من صفيحة 96-جيدا قبل بيبيتينج.
8. بعد الانتهاء من تشكيل الحبرية في العينات، ختم اللوحة بكر مع إحباط دبكر بيرسيابل عند 180 درجة مئوية 4 s.
9. بكر-لوحة مختومة إحباط في cycler ودورة عليه كما هو موضح في الجدول 4، بمعدل 2.5 منحدر ° C/s.

4-الحبرية قراءة وتحليل

1. نقل اللوحة من cycler الحرارية لقاعدة حامل اللوحة. تشديد لوحة بكر بوضع الجزء العلوي من صاحب لوحة على لوح PCR.
2. بدء تشغيل البرنامج دبكر التجارية.
3. أدخل الاسم عينة، واسم التجربة، والهدف في برنامج الإعداد. حدد التحديد الكمي المطلق.
4. بدء الحبرية القراءة بواسطة النقر فوق تشغيل. حدد الاتحاد الماليزي/ست عشري أو الاتحاد الماليزي/مركز فيينا الدولي كالكيمياء الكشف عند العمل مع تحقيقات التحلل المائي.
   ملاحظة: البرنامج دبكر التجاري سوف ثم السيارات-تحليل البيانات.
5. التحقق من الأرقام التجميعية في جدول النتائج لضمان جيل الحبرية صحيح.
6. حدد جميع الآبار مع ميرنا كمياً نفس ثم انقر فوق تحليل. استخدام 2D وصمة عار لعلامة إيجابية قطرات ويدويًا تصحيح البيانات تحليل السيارات (الشكل 1).

5-تصحيح العمليات الحسابية على عينة

1. تطبيع العينة بضرب العينة بعامل تطبيع (NF).
   NF = متوسط [C. ايليجانس مير-39 القياسات]_{جميع عينات}/[C. ايليجانس مير-39]_{نموذج معين}
2. حساب تركيز المصل ميرنا النهائي، ضبط لإضعاف العوامل (مدافع).
   [ميرنا] _{النهائي} = [ميرنا]_{قيمة الخام} س مدافع_RT × مدافع_دبكر × مدافع_{السابقين}
   حيث:
   [ميرنا] _{قيمة الخام} = ميرنا كمياً بالبرمجيات دبكر التجارية؛
   مدافع_RT = عامل تخفيف للقالب في النسخ العكسي؛
   مدافع_دبكر = عامل تخفيف للقالب في دبكر؛
   مدافع_ت = معامل التخفيف في الاستخراج.

6-الاصطناعية اليغنوكليوتيد تمييع سلسلة

1. ذوبان الجليد اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد بالثلج. باختصار الطرد المركزي.
2. تمييع اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد في المياه خالية من نوكلاس لتركيز نهائي 10 pmol/ميليلتر. بإيجاز الطرد المركزي هو.
3. تمييع في المياه خالية من نوكلاس كما هو موضح في الجدول 5. الطرد المركزي التخفيف بإيجاز بين كل خطوة تمييع في 8,000 ز خ ل 10 ق.
4. تواصل مع النسخ العكسي كما هو موضح في الخطوة 2 وتحليل العينات مع بكر الرقمية كما هو موضح في الخطوة 3 والخطوة 4.

بكر الرقمية جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت تمكن الباحثين مباشرة تحديد مقدار المبالغ المطلقة من ميرناس محددة في نسخة/ميليلتر. كما تم تقسيم العينة في دبكر في ردود الفعل تقريبا 20,000 PCR الفردية، دبكر لا تتطلب التقنية يتطابق10. يستخدم النظام دبكر بواسون رياضية تحليل إحصائي لإشارات الفلورسنت (اختلاف بين ردود فعل إيجابية وسلبية) تمكين التحديد الكمي مطلق دون الحاجة إلى معيار منحنى10. كي صحيح حساب التركيزات، هناك حاجة إلى حصيلة مقبولة الحبرية (> 15,000). أية عناصر تحكم قالب ضمان استبعاد التضخيم الكبير غير محدد. تتم معالجة جميع العينات المدرجة في التحليل باستخدام نفس وحدة التخزين، والأسلوب، وبروتوكول PCR لتعزيز صحة النتائج المتحصل عليها. يتم تطبيع التركيزات التي يتم الحصول عليها في دبكر استخدام إجراء تطبيع متوسط عبر جميع العينات التي تم تحليلها مع الاصطناعية ارتفعت في C. ايليجانس مير-3913. تطبيع البيانات لقياس مقدار ارتفعت في C. ايليجانس مير-39 بتصحيح لتباين العينة بعينه في كفاءة استخراج الحمض النووي الريبي ويعمل كعنصر تحكم رد فعل بكر، كذلك إضافة إلى صحة النتائج. لا يوجد أي معيار الذهب الراسخة لتطبيع ميرناس المصل؛ ومع ذلك، عناصر خارجية مثل ارتفعت في C. ايليجانس مير-39 حلاً رائعا لإجراءات التطبيع، كما ميرناس الذاتية غالباً ما تتغير في مختلف الدول المرض9.

تم اقتناء عينات المصل تم تحليلها قبل تدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI)، ح 8 بعد PCI، و 16 ح بعد PCI، من المرضى الذين يعانون من حادة قطعة ST ارتفاع احتشاء عضلة القلب (STEMI). STEMI المرضى يحمل الاسكيمية شديدة وهكذا تتأهل لتقييم المؤشرات الحيوية الاسكيمية الجديدة. تقييم الحركية من إطلاق سراح مير-499 والاستخدام المحتمل مير-499 كالعلامات البيولوجية الاسكيمية في أمراض القلب والأوعية الدموية، وقد تم تحليل مير-499 مع دبكر عبر جميع المرضى ل نقاط زمنية مختلفة الثلاثة14.

يوضح الشكل 1 اختيار إيجابية قطرات إعطاء تركيز ميرنا النهائي حسابها بواسطة البرنامج. جزء صغير إيجابيات في عينة يحدد تركيز نسخة/ميليلتر كما حسبها البرمجيات التجارية دبكر. يمكن أيضا تصور النتائج في 2D مؤامرة والإيجابيات يمكن أن يكون علامة يدوياً مع الدوائر. وتعتبر تركيزات فقط إذا كانوا أعلاه التضخيم غير محدد لتتباين.

ويبين الشكل 2 الخطي والخير لصالح سلسلة تمييع ف له-مير-499-5 اليغنوكليوتيد ميرنا الاصطناعية في التكرارات. وأجرى سلسلة الخطوة 8 إضعاف من نسخ 2,500/ميليلتر لنسخ 0/ميليلتر. المتوقعة المحسوبة نسخة/ميليلتر كما هو موضح في الجدول 5 تفترض RT 100% وكفاءة PCR الرقمية. في هذا الإعداد، يوضح بكر الرقمية بدرجة عالية من الخطي (ص2 = 0.99). الحد الأقصى للكشف (اللد = 0.12) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك = 0.23) وترد أيضا في الشكل 2، تبين أن تعبير ميرنا منخفضة حتى يمكن الكشف عن بنجاح. وهكذا، يمكن استخدام دبكر لقياس مستويات المصل منخفضة حتى تعميم ميرناس. الحد الأقصى للكشف (اللد) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك) تحسب باتباع نهج فروتن et al. 15 وهي تعرف أنها اللد = لوب + 1.645 x σمنخفضتركيزعينة، حيث يتم حساب الحد الأقصى فارغة (LoB) ك LoB =فارغة يعني + 1.645 x σفارغة. لوك ثم يقدر تكرار التشغيل القياسية منحنيات15. لضمان التحديد الكمي استنساخه من ميرناس، تركيزات ميرنا الماثلة أعلاه في اللد وفي لوك فقط تعتبر كقيمة دقيق صالحة.

ويبين الشكل 3 نتائج تمثيلية لمستويات مير-499 من مرضى ارتفاع ST احتشاء عضلة القلب (STEMI)، n = 16 عند كل نقطة في الوقت. أخذت عينات من قبل بتدخل عن طريق الجلد (PCI) (t = 0)، ح 8 بعد PCI (t = 8)، وح 16 بعد PCI (تي = 16)، ومقارنة مستويات مير-499 إلى مستويات مير-499 من المرضى بمرض الشريان التاجي المستقر (CAD، ن = 20). يمكن الاطلاع على خصائص المريض الرئيسية في الجدول 6. بعد الإصدار الأولى من مير-499 في المصل في ح 8 الأولى التالية احتشاء عضلة القلب، انخفاض مستويات مير-499 مرة أخرى بعد 16 ساعة. الفعل يتبين اتجاه في الزيادة من ستيمي بداية (t = 0)، ويمكن زيادة كبيرة في مستويات مير-499 مقارنة للمرضى مع كندي ح 8 ينظر بعد ستيمي (t = 8، ف < 0.01) عند مقارنة مستويات مير-499 مير-499 مستويات مستقرة كاد المرضى. جهاز الاستقبال تعمل المنحنيات (ROC) إظهار فائدة ممكنة من مير-499 كالعلامات البيولوجية رواية التفريق بين المرضى مع كندي والمرضى الذين يعانون ستيمي [المنطقة تحت المنحنى (AUC) = 0.62 للعينات المأخوذة قبل تدخل عن طريق الجلد (PCI)، أوك = 0.75 لعينات أخذت ح 8 بعد PCI، واوك = 0.78 لعينات أخذت ح 16 بعد المشروع مقارنة بمستويات المصل من مير-499 في المرضى مع كندي].

رقم 1: اختيار قطرات الإيجابية في سلسلة تمييع أداؤها في التكرارات. (أ) الحد الأدنى يتم تعيين يدوياً أعلاه قطرات السلبية. (ب) يتم تصور النتائج في حركتك 2D إيجابيات اختارها الدوران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: سلسلة تمييع الاصطناعية مير-499 اليغنوكليوتيد. (أ) تم إجراء القياسات في التكرارات. وترد البيانات سجل تحول كنسخ المطلق لكل ميليلتر. التراجع الخطي والخير لصالح (ص2-القيمة) ترد. يتم عرض البيانات يعني ± sem. (ب) هذا الفريق يبين الحد من الكشف عن (اللد) والحد الأقصى للتقدير الكمي (لوك). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: القياس الكمي لتعميم ف مير-499-5 المصل في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب ارتفاع ST (n = 16) قبل التدخل التاجي عن طريق الجلد (PCI)، ح 8 بعد PCI، وح 16 بعد PCI، مقارنة بمرضى الشريان التاجي المستقر المرض (n = 20)- (أ) تعميم المصل مير-499-5 ف يتم تمثيلها يعني مع الخطأ المعياري للوسط مع المقابلة فالقيمه التي تم حسابها بواسطة ANOVA اتجاه واحد متبوعاً باختبار الوظائف المخصصة بونفيروني (ف < اعتبرت 0.05 يعتد به إحصائيا). (ب) جهاز استقبال يعمل تحليل منحنى المميزة (ROC) تتم على البيانات من لوحة A. ويبين تحليل ROC حساسية وخصوصية العلامات البيولوجية. علاوة على ذلك، يبين أن المنطقة المقابلة تحت المنحنى (AUC) القيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: النسخ العكسي الكواشف المزيج.

الجدول 2: شروط الدراجات الحرارية للنسخ العكسي.

الجدول 3: بكر الرقمية كاشف مزيج.

الجدول 4: الحرارية "الدراجات شروط" PCR الرقمية.

الجدول 5: سلسلة تمييع الاصطناعية مير-499.

الجدول 6: الخصائص الرئيسية المريض.

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.