مقالة منهجية

بكر الرقمية للتحديد الكمي لتعميم MicroRNAs في احتشاء عضلة القلب الحاد وأمراض القلب والأوعية الدموية

DOI:

10.3791/57950

⸱

يوليو 3, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology I, Heart Center Freiburg University, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Medicine, Monash University, 3Department of Medicine I, Lighthouse Core Facility, Medical Center, University of Freiburg, 4Department of Cardiology, Augustinerinnen Hospital, Academic Teaching Hospital, University of Cologne

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت ميكرورناس تعميم الوعد المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية وقال عضلة القلب الحاد. في هذه الدراسة، يمكننا وصف بروتوكول لاستخراج ميرنا والنسخ العكسي، وبكر الرقمية للتحديد الكمي المطلق ميرناس في مصل المرضى الذين يعانون من أمراض القلب والأوعية الدموية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعميم المصل ميكرورناس (ميرناس) قد أظهرت الوعد كالمؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية واحتشاء عضلة القلب الحاد (عامي)، الإفراج عنهم من خلايا القلب والأوعية الدموية في الدورة الدموية. ميرناس المتداولة هي مستقرة جداً ويمكن قياسها كمياً. ويمكن ربط التعبير الكمي عن ميرناس محددة لعلم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية وخصوصية المرض. إيجاد رواية المؤشرات الحيوية لأمراض القلب والأوعية الدموية من الأهمية للبحوث الطبية. ومؤخرا جداً، تم اختراع الرقمية البلمرة المتسلسل (دبكر). دبكر، جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، تمكن الكمي المطلق مباشرة محددة. دبكر المعارض متفوقة الصفات التقنية، بما في ذلك تقلب منخفضة وعالية الخطي، وحساسية عالية مقارنة بالكمية البلمرة المتسلسل (قبكر). وهكذا، دبكر أسلوب أكثر دقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة ميرناس، خاصة للاستخدام في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة. في هذا المنشور، ونحن تصف كيفية فعالية أداء بكر الرقمية بغية تقييم عدد النسخ المطلق في عينات مصل الدم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد حددت ميرناس المتداولة كعلامات تبشر بالخير لعدد من الأمراض، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية1. ميرناس الصغيرة، وغير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (حوالي 22 النيوكليوتيدات طويلة) وتشارك في التنظيم بوستترانسكريبشونال عن طريق تحوير الحمض النووي الريبي رسول الترجمة والتأثير على التعبير الجيني2، ويتم إصدارها للتداول في الدول الفسيولوجية والمرضية على حد سواء. التعبير الكمي عن ميرناس معينة يمكن ربطها علم الأمراض، وبعض ميرناس وتظهر الأنسجة عالية و خصوصية المرض1. في أمراض القلب والأوعية الدموية، أصبحت ميرناس جاذبية المرشحين حسب المؤشرات الحيوية رواية كمياً لأنهم استقرارا ملحوظا في المصل ويمكن بسهولة مع المساعدة من منهجية بكر3. وقد تم تقييم القيمة المحتملة ميرناس كالمؤشرات الحيوية لاحتشاء عضلة القلب في دراسات صغيرة، ولكن التحقق من صحة في أفواج كبيرة تفتقر إلى2. على سبيل المثال، يوجد مير-499 أعرب شديدة في عضلة عضلة القلب، وقد ثبت أن تحقيق زيادة كبيرة في أمي4،،من56. علاوة على ذلك، فإنه ينظم برمجة موت الخلايا (المبرمج) والتفريق بين كارديوميوسيتيس وهكذا تشارك في العديد من الآليات التالية عامي7. وبصرف النظر عن بعض الدراسات الصغيرة الإبلاغ التفوق والقيمة الإضافية ميرناس لتشخيص أمي، بالتفوق أو المساواة بحساسية عالية تروبونينس القلب لا بعد ثبت في دراسات واسعة النطاق2،5 ،،من68. ولذلك، المزيد من الدراسات المستقبلية في أفواج كبيرة ضرورية لتقييم قيمة التشخيص المحتملة ميرناس. بالإضافة إلى ذلك، أساليب القياس الكمي ميرنا بحاجة إلى أن يكون الأمثل وموحدة باستخدام المقارنة بروتوكولات9. الاختبارات الموحدة قد يقلل من نتائج غير متناسقة وقد تساعد ميرناس لتصبح المؤشرات الحيوية المحتملة للتطبيق السريري الروتيني، كما تحتاج المؤشرات الحيوية كمياً بطريقة استنساخه لضمان قابليتها للتطبيق السريري.

وقد أدخلت مؤخرا، دبكر كتحليل نقطة نهاية. الأقسام العينة إلى ردود الفعل الفردية 20,000 حوالي الساعة10. ثم يستخدم النظام دبكر رياضية Poisson تحليلاً إحصائيا لإشارات الفلورسنت (ردود الفعل الإيجابية والسلبية)، تمكن القياس الكمي مطلق دون منحنى المعياري10. عند الجمع بين دبكر مع تحقيقات التحلل الفلورسنت، أصبح ممكناً التقدير الكمي المطلق مباشرة محددة للغاية من ميرناس. أظهرت الرقمية تفاعل البوليميراز المتسلسل يحمل الصفات التقنية العليا (بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية ودرجة عالية من الخطي وحساسية عالية) لقياس مستويات ميرنا في تداول مقارنة بالكمية في الوقت الحقيقي بكر10،11. هذه الصفات التقنية المتفوقة قد يساعد على التخفيف من القيود المفروضة حاليا على استخدام ميرناس المتداولة كالمؤشرات الحيوية، وقد يؤدي إلى إنشاء ميرناس كالمؤشرات الحيوية في التجارب السريرية القلبية الوعائية مركز متعدد كبيرة وأسلوب تشخيص في العامة. في دراسة سابقة، ونحن مؤخرا تطبيق دبكر للتحديد الكمي المطلق لتعميم ميرناس في المرضى الذين يعانون من أمي وكانت قادرة على إثبات إمكانية التشخيص متفوقة مقارنة بالتحديد الكمي ميرناس قبكر12.

في هذا المنشور، نريد أن ندلل على أن استخدام دبكر طريقة دقيقة واستنساخه للتحديد الكمي لمباشرة تعميم ميرناس القلب والأوعية الدموية. التحديد الكمي المطلق لمستويات ميرنا في مصل الدم، استخدام PCR الرقمية، يظهر المحتملة للاستخدام كبير مركز متعدد التجارب السريرية القلب والأوعية الدموية. في هذا المنشور، ونحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ فعالية PCR الرقمية وكيفية الكشف عن عدد نسخ ميرنا المطلق في مصل الدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-استخراج ميرنا من المصل/بلازما

ملاحظة: من أجل تحديد ميرناس على نحو ملائم، عزل ميكرورنا الصحيح من المصل/البلازما خطوة حاسمة. شيء رئيسي من أن نأخذ في الاعتبار، لا سيما بسبب وجود بروتوكولات مختلفة, على التمسك بنفس سير العمل أثناء معالجة العينات. في هذا البروتوكول، ويتم استخراج ميرنا من 50 ميليلتر من المصل. لا تستخدم أكثر من 200 ميليلتر كهذا الحد عملية الاستخراج الصحيح.

  1. إعداد مصل أو ذوبان الجليد العينات المجمدة.
  2. إضافة 250 ميليلتر (5 مجلدات) تحلل التجارية الكاشف إلى 50 ميليلتر من المصل. دعم تحلل فورتيكسينج. ضع الأنبوب مع على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. سبايك مع 3.5 ميليلتر من المصطلحات الخاصة بعنصر التحكم (1.6 × 107 نسخة/ميليلتر) ومزجها فورتيكسينج.
  4. إضافة 50 ميليلتر من كلوروفورم (أي، مبلغ مماثل فيما يتعلق بعينه المصل انطلاق) لفصل المرحلة. يهز الأنبوب بقوة لمكان س. 15 أنبوب على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق.
  5. لفصل المرحلة، الطرد المركزي الأنبوب في س 12,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يتم فصل العينات الآن إلى مرحلة مائي العلوي يحتوي على الجيش الملكي النيبالي ومن الطور البيني بيضاء، ومرحلة عضوية أقل الوردي.
  6. نقل المرحلة المائية العليا (100 ميليلتر) يحتوي على الجيش الملكي النيبالي في أنبوب جديد. لا يتم تحويل أي مادة بيضاء الطور البيني كهذا تزيف تعداد الجيش الملكي النيبالي الصحيح.
  7. إضافة 150 ميليلتر (أي1.5 x حجم العينة المنقولة) من الإيثانول 100%. خلط المواد التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً. عدم الطرد المركزي لهم، وسرعة الانتقال إلى الخطوة التالية.
  8. "الماصة؛" 250 ميليلتر من العينة على عمود دوران تجاري في أنبوب جمع 2 مل. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15-التدفق عبر.
  9. إضافة 700 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 1 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > ز س 8,000 في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
  10. إضافة 500 ميليلتر للغسيل التجاري المخزن المؤقت رقم 2 على عمود الدوران. إغلاق الغطاء والطرد المركزي العمود في > 8، 000 x ز في درجة حرارة الغرفة لتجاهل س. 15 المخزن المؤقت الغسيل رونثرو.
  11. "الماصة؛" 500 ميليلتر من الإيثانول 80% على عمود الدوران. إغلاق الغطاء، والطرد المركزي العمود في > 8، تجاهل ز 000 x في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 2 أنبوب جمع مع التدفق عبر.
  12. نقل عمود الدوران إلى أنبوب جمع 2 مل جديدة. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة مع غطاء فتح الجاف للغشاء. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق عبر.
  13. نقل عمود الدوران في أنبوب جمع 1.5 مل جديدة. الوت الجيش الملكي النيبالي بتطبيق 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي مباشرة إلى مركز للغشاء. أغلق الغطاء. الطرد المركزي العمود بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
  14. مخزن الجيش الملكي النيبالي في-70 درجة مئوية.
    ملاحظة: يضمن التخزين لتنقية الحمض النووي الريبي في المياه خالية من رناسي بين-70 درجة مئوية إلى-20 درجة مئوية لا تدهور للجيش الملكي النيبالي لمدة سنة واحدة. بعد البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة، وهو الحد الأدنى لحجم المياه خالية من رناسي تمييع الجيش الملكي النيبالي 10 ميليلتر. استخدام أقل من 10 ميليلتر قد هيدرات الغشاء غير كاف وتقليل إجمالي العائد الجيش الملكي النيبالي.

2-عكس النسخ

ملاحظة: تم تصنيعه الحمض النووي التكميلية (كدنا) استخدام بروتوكول النسخ العكسي (RT) 15 ميليلتر التالية (رد فعل مجموع حجم).

  1. ذوبان الجليد الطقم RT على الجليد. تبقى الإنزيمات في الثلاجة أطول وقت ممكن منعهم من اللاإنسانية وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام. ذوبان الجليد الإشعال RT على الجليد وتدور لهم أسفل قبل الاستخدام.
  2. إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 1.
  3. الجمع بين 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي و 5 ميليلتر من الحمض النووي الريبي المستخرج كل بئر في صفيحة جيدا 96.
  4. الطرد المركزي لوحة جيدا في 2,000 ز x عند 4 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
  5. استخدام بروتوكول الدورة الحرارية المبينة في الجدول 2 للنسخ العكسي.
    ملاحظة: كما هو موضح أدناه، كدنا يجوز مباشرة معالجتها في جهاز PCR الرقمية (انظر الجدول للمواد)؛ وبدلاً من ذلك، قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية.

3-الحبرية جيل وبكر الرقمية

ملاحظة: الرقمية تم إجراء PCR باستخدام بروتوكول ميليلتر 40 التالية.

  1. ذوبان الجليد مزيج دبكر التجارية، وكدنا استعداد والإشعال بكر على الجليد. الطرد المركزي لهم قبل وقت قصير من الاستخدام.
  2. إعداد مزيج الرئيسي كما هو موضح في الجدول 3-
  3. إضافة من المنتج RT 1.33 ميكروليتر/جيدا والطرد المركزي أنه بإيجاز.
  4. "الماصة؛" 20 ميكروليتر من العينة في كل بئر من كاسيت 8-جيدا (المتوسط الصف).
    ملاحظة: إذا لم يتم ملء كاسيت 8-جيدا تماما، تملأ الآبار المتبقية مع الضوابط غير القالب (NTCs) التي تسقط كدنا (أيالمنتج RT أنتجت مع المياه بدلاً من استخراج الحمض النووي الريبي) أو دبكر التجارية المخزن المؤقت. المجلس الوطني الانتقالي بمثابة عنصر تحكم تلوث. يجب عدم استخدام المياه في الآبار المتبقية، لأن ذلك سيضر بنوعية تشكيل الحبرية.
  5. "الماصة؛" ميكروليتر 70 النفط جيل الحبرية للتحقيقات في آبار النفط (الصف السفلي) كاسيت 8-جيدا.
  6. وضع طوقا على رأس كاسيت 8-جيدا ثم ضع الكاسيت في مولد الحبرية. قم بإغلاق منشئ الحبرية. الانتظار حتى أضواء مؤشر 3 أخضر خالص.
    ملاحظة: الآن يتم إنشاء قطرات.
  7. بعناية وبطء نقل 40 ميكروليتر من عينة شكلت الحبرية (الصف العلوي) في آبار منفصلة من صفيحة 96-جيدا قبل بيبيتينج.
  8. بعد الانتهاء من تشكيل الحبرية في العينات، ختم اللوحة بكر مع إحباط دبكر بيرسيابل عند 180 درجة مئوية 4 s.
  9. بكر-لوحة مختومة إحباط في cycler ودورة عليه كما هو موضح في الجدول 4، بمعدل 2.5 منحدر ° C/s.

4-الحبرية قراءة وتحليل

  1. نقل اللوحة من cycler الحرارية لقاعدة حامل اللوحة. تشديد لوحة بكر بوضع الجزء العلوي من صاحب لوحة على لوح PCR.
  2. بدء تشغيل البرنامج دبكر التجارية.
  3. أدخل الاسم عينة، واسم التجربة، والهدف في برنامج الإعداد. حدد التحديد الكمي المطلق.
  4. بدء الحبرية القراءة بواسطة النقر فوق تشغيل. حدد الاتحاد الماليزي/ست عشري أو الاتحاد الماليزي/مركز فيينا الدولي كالكيمياء الكشف عند العمل مع تحقيقات التحلل المائي.
    ملاحظة: البرنامج دبكر التجاري سوف ثم السيارات-تحليل البيانات.
  5. التحقق من الأرقام التجميعية في جدول النتائج لضمان جيل الحبرية صحيح.
  6. حدد جميع الآبار مع ميرنا كمياً نفس ثم انقر فوق تحليل. استخدام 2D وصمة عار لعلامة إيجابية قطرات ويدويًا تصحيح البيانات تحليل السيارات (الشكل 1).

5-تصحيح العمليات الحسابية على عينة

  1. تطبيع العينة بضرب العينة بعامل تطبيع (NF).
    NF = متوسط [C. ايليجانس مير-39 القياسات]جميع عينات/[C. ايليجانس مير-39]نموذج معين
  2. حساب تركيز المصل ميرنا النهائي، ضبط لإضعاف العوامل (مدافع).
    [ميرنا] النهائي = [ميرنا]قيمة الخام س مدافعRT × مدافعدبكر × مدافعالسابقين
    حيث:
    [ميرنا] قيمة الخام = ميرنا كمياً بالبرمجيات دبكر التجارية؛
    مدافعRT = عامل تخفيف للقالب في النسخ العكسي؛
    مدافعدبكر = عامل تخفيف للقالب في دبكر؛
    مدافعت = معامل التخفيف في الاستخراج.

6-الاصطناعية اليغنوكليوتيد تمييع سلسلة

  1. ذوبان الجليد اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد بالثلج. باختصار الطرد المركزي.
  2. تمييع اليغنوكليوتيد الاصطناعية المجففة بالتبريد في المياه خالية من نوكلاس لتركيز نهائي 10 pmol/ميليلتر. بإيجاز الطرد المركزي هو.
  3. تمييع في المياه خالية من نوكلاس كما هو موضح في الجدول 5. الطرد المركزي التخفيف بإيجاز بين كل خطوة تمييع في 8,000 ز خ ل 10 ق.
  4. تواصل مع النسخ العكسي كما هو موضح في الخطوة 2 وتحليل العينات مع بكر الرقمية كما هو موضح في الخطوة 3 والخطوة 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بكر الرقمية جنبا إلى جنب مع تحقيقات التحلل الفلورسنت تمكن الباحثين مباشرة تحديد مقدار المبالغ المطلقة من ميرناس محددة في نسخة/ميليلتر. كما تم تقسيم العينة في دبكر في ردود الفعل تقريبا 20,000 PCR الفردية، دبكر لا تتطلب التقنية يتطابق10. يستخدم النظام دبكر بواسون رياضية تحليل إحصائي لإشارات الفلورسنت (اختلاف بين ردود فعل إيجابية وسلبية) تمكين التحديد الكمي مطلق دون الحاجة إلى معيار منحنى10. كي صحيح حساب التركيزات، هناك حاجة إلى حصيلة مقبولة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بكر الرقمية هو أسلوب نقطة نهاية جديدة نسبيا من PCR الذي يسمح التحديد الكمي المطلق مباشرة من الأحماض النووية داخل عينة. الأسلوب الذي يملك مزايا خاصة، بما في ذلك تقلب انخفاض، زيادة في إمكانية تكرار نتائج اليومية، و حساسية فائقة11،12. علاوة على ذلك، بسبب تقسيم العينة إلى ردود فعل واحد تقريبا من 20,000 وتحليلات نقطة النهاية، دبكر أكثر متانة لمواد تدخل في PCR مقارنة بالكمية RT-PCR16. تجعل من هذه الصفات في دبكر بديلاً جذاباً للكمية RT-PCR كأداة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفين قد لا إعلامات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > استخراج الحمض النووي الريبي < / قوي >
MIRNeasy مصل / مجموعة بلازما (50)Qiagen-عينة & مجموعة 217184 الفحص من تقنيات الفحص ، هيلدن ، دويتشلاندلاستخراج الحمض النووي الريبي الصغير. تحتوي المجموعة على مخزن مؤقت تجاري RWT (يسمى رقم واحد في المخطوطة)   و RPE (يسمى رقم اثنين في المخطوطة).
مصل miRNeasy / سبايك في التحكم في البلازما ؛ Syn-cel-miR-39 miRNA; 10pmolQiagen-عينة & Assay Technologies ، Hilden ، Deutschland219610Spike-in للتطبيع ، التسلسل: 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3 '
Reverse Transcription< / strong>
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (1000 تفاعل)Applied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4366597مجموعة للنسخ العكسي microRNA
TaqMan MicroRNA Assays MApplied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4440887 المقايسات المستخدمة في النسخ العكسي < / em>
has-miR-499 (750 RT / 750 PCR rxns)Applied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4440887رقم الفحص 001352
cel-miR-39 (750 RT / 750 PCR rxns)Applied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةرقم الفحص 4440887000200
لوحة PCR ، 96 بئر ، مجزأة ، شبه التنورةالحرارية فيشر العلمية ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكيةAB090096 لوحة بئر للنسخ العكسي
Microseal ' B’ أختام الأختامBio-Rad Laboratories، Inc. ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكيةMSB1001احباط لضمان التخزين المناسب
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1851196Cycler المستخدمة في النسخ العكسي
< قوي > قطرة رقمي PCR < / قوي > 100
nmole RNA oligo has-miR-499-5pتقنيات الحمض النووي المتكاملةمخصصةالتسلسل: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGAUGUUU-3'ddPCR
Supermix للمجسات (بدون dUTP)Bio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1863024Supermix المستخدمة في توليد القطرات
TaqMan MicroRNA AssaysApplied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4440887 المقايسات المستخدمة في PCR الرقمي (مسبار التحلل المائي الفلوري) < / em>
has-miR-499 (750 RT / 750 PCR rxns)شركة Applied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4440887رقم الفحص 001352 ، الاشعال التجارية
cel-miR-39 (750 RT / 750 PCR rxns)Applied Biosystems، Inc. ، فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية4440887رقم الفحص 000200 ، الاشعال التجارية
DG8 خراطيش وحشيات Bio-RadLaboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1864007تأخذ خرطوشة ما يصل إلى 8 عينات لتوليد
قطرات خرطوشة DG8 حاملBio-Rad Laboratories، Inc. ، هرقل ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدةالأمريكية 1863051يحمل خراطيش في توليد قطرات
زيت توليد قطرات لمجساتBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1863005النفط المستخدم في توليد القطرات
ddPCR 96-Well PlatesBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1200192596 لوحة بئر لختم حرارة لوحة ddPCR
PCR ، رقائق معدنية ، ثقبBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1814040رقائق Pierceable ، متوافقة مع قارئ القطرات
ddPCR Droplet Reader OilBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1863004الزيت المستخدم في قراءة القطرات
QX100 أو QX200 DropletGenerator Bio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1863002Droplet Generator ، يولد القطرات من مستحلب العينة / الزيت
PX1 PCR Plate SealerBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1814000تغلق اللوحة قبل PCR
C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، USA1851196Cycler المستخدمة في ddPCR
QX100 أو QX200 Droplet ReaderBio-Rad Laboratories، Inc. ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية1863003يقرأ قطرات إيجابية PCR وسالبة PCR باستخدام كاشف
بصريddPCR Buffer Control for ProbesBio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA1863052Blank control  ولملء الآبار المتبقية من 8 آبار كاسيت
Software
QuantaSof SoftwareBio-Rad Laboratories، Inc.، Hercules، CA، USAبرنامج 1864011لقراءة القطرات
Prism Windows 5GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA، برنامج الولايات المتحدة الأمريكيةللتحليل الإحصائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schulte, C., Zeller, T. microRNA-based diagnostics and therapy in cardiovascular disease - summing up the facts. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 5, 17-36 (2015).
  2. Sun, T., et al. The role of microRNAs in myocardial infarction: from molecular mechanism to clinical application. International Journal of Molecular Sciences. 18, (2017).
  3. Dimmeler, S., Zeiher, A. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers for cardiovascular diseases. European Heart Journal. 31, 2705-2707 (2010).
  4. Creemers, E. E., Tijsen, A. J., Pinto, Y. M. Circulating microRNAs: novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease. Circulation Research. 110, 483-495 (2012).
  5. Oerlemans, M. I., et al. Early assessment of acute coronary syndromes in the emergency department: the potential diagnostic value of circulating microRNAs. EMBO Molecular Medicine. 4, 1176-1185 (2012).
  6. Olivieri, F., et al. Diagnostic potential of circulating miR-499-5p in elderly patients with acute non ST-elevation myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 167, 531-536 (2013).
  7. Navickas, R., et al. Identifying circulating microRNAs as biomarkers of cardiovascular disease: a systematic review. Cardiovascular Research. 111, 322-337 (2016).
  8. Devaux, Y., et al. Diagnostic and prognostic value of circulating microRNAs in patients with acute chest pain. Journal of Internal Medicine. 277, 260-271 (2015).
  9. Schwarzenbach, H., da Silva, A. M., Calin, G., Pantel, K. Data normalization strategies for microRNA quantification. Clinical Chemistry. 61, 1333-1342 (2015).
  10. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83, 8604-8610 (2011).
  11. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10, 1003-1005 (2013).
  12. Robinson, S., et al. Droplet digital PCR as a novel detection method for quantifying microRNAs in acute myocardial infarction. Internation Journal of Cardiology. 257, 247-254 (2018).
  13. Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10513-10518 (2008).
  14. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 31, 2765-2773 (2010).
  15. Forootan, A., et al. Methods to determine limit of detection and limit of quantification in quantitative real-time PCR (qPCR). Biomolecular Detection and Quantification. 12, 1-6 (2017).
  16. Dingle, T. C., Sedlak, R. H., Cook, L., Jerome, K. R. Tolerance of droplet-digital PCR vs real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical Chemistry. 59, 1670-1672 (2013).
  17. Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7, 2409(2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

microRNA

مقالات ذات صلة