مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد تفضيلات الحرارية يرقات المورفولوجية

ملخص

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتحديد درجة الحرارة البيئية المفضل لليرقات المورفولوجية استخدام تدرج حراري مستمر.

الملخص

العديد من الحيوانات، بما في ذلك ذبابة الفاكهة، melanogaster المورفولوجية، قادرون على تمييز الفروق الدقيقة في درجة الحرارة البيئية، التي تمكنهم من البحث عن المناظر الطبيعية الحراري المفضل. تحديد تفضيلات اليرقات درجات الحرارة أكثر من مجموعة خطية محددة، قمنا بتطوير فحص استخدام تدرج درجات الحرارة. إنشاء تدرج لوني واحد ثنائي الاتجاه، ترتبط اثنين من كتل الألومنيوم لحمامات مياه مستقلة، كل منها ضوابط درجة حرارة كتل الفردية. الكتلتين تعيين الحدود الدنيا والعليا للتدرج. هو إنشاء التدرج درجة الحرارة بوضع صفيحة ألومنيوم [اغروس] المغلفة اثنين من كتل التحكم في المياه حيث أن اللوحة تمتد المسافة بينهما. ينتهي لوحة الألومنيوم التي تم تعيينها على رأس كتل المياه يحدد درجات الحرارة الدنيا والقصوى، ومناطق الفترات الفاصلة بين الكتلتين تشكل درجة الحرارة تدرج خطي. تحليل الانحدار يمكن تطبيقها على اليرقات من مختلف الإعمار، ويمكن استخدامها لتحديد طفرات أن المعرض تعمل، مثل تلك التي مع الطفرات التي تؤثر على الجينات ترميز قنوات الحزب وأوبسينس، ومطلوبة من أجل تمييز درجة الحرارة.

المقدمة

وتستخدم الحيوانات المتنقلة لتحديد بيئة مواتية أكثر الشروط^1،2،3ثيرموتاكسيس. إذا كان المناخ مفرطة الساخنة أو الباردة، أمر حيوي للبقاء هذا السلوك. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الحيوانات حساسية للاختلافات الصغيرة جداً في درجة الحرارة في مجموعة مريحة والبحث عن المناطق المحيطة بها مع درجة حرارة مثالية. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للكائنات بويكيلوثيرميك مثل ذباب الفاكهة، وحجته بدرجة حرارة الجسم مع البيئة. فحوصات لمراقبة اليرقات ثيرموتاكسيس قد ساعدت في تحديد وتوضيح دور كل من أجهزة الاستشعار الجزيئية مثل المورفولوجية مستقبلات عابر المحتملة (الحزب) قنوات^4،،من⁵⁶، رهودوبسينس^7،8وإيونوتروبيك مستقبلات مستقبلات (IRs)⁹، التي تضفي هذه الحيوانات مع الحساسيات درجة الحرارة على نطاقات مختلفة في درجة الحرارة.

اختبار اختيار اتجاهين يوفر نهج واحد لدراسة تفضيلات الحرارية في اليرقات^6،7. المقايسة يستتبع إنشاء منطقتين حرارة متميزة ويسمح للحيوانات لتحديد جانب واحد على الآخر. يمكن أن تكون نتائج اختبارات الاختيار ثنائية قوية، لا سيما إذا كانت الاختلافات في درجة الحرارة بين الخيارين كبيرة. وبالإضافة إلى ذلك، أن كل مقايسة تتضمن جدولة المجموعات اثنين فقط، يمكن التعبير عن البيانات كمؤشر لتفضيل بسيطة. السهولة والبساطة في اختيار اتجاهين فحوصات قابلة أيضا لشاشات الجينية. ومع ذلك، قيداً رئيسيا أن هناك حاجة تحديد درجة الحرارة المفضلة للحيوانات البرية من نوع أو متحولة إلى العديد من التجارب.

مقايسة تدرج يتيح الفرصة لإنشاء درجة الحرارة المفضلة في مقايسة واحدة⁸. وعلاوة على ذلك، خلافا لاختبار الخيار ذات اتجاهين، ويسمح تقييم توزيع مجموعة من الحيوانات، عندما تواجه مع نطاق متواصل من درجات الحرارة. تحليل الانحدار واحد يستخدم طبق بيتري والحيوانات وحيدة ومناسبة تماما لوصف سلوك الحيوانات الفردية¹⁰مفصل. ومع ذلك، منذ جولة أطباق بيتري، أحجام المناطق درجة الحرارة تختلف وهي تدريجيا أقل اعتماداً على المسافة من المركز. ولذلك، هذا الإعداد ليست مثالية لرصد التحديدات درجة الحرارة من سكان حيوانات.

جهاز تدرج حراري مستمر التي مناسبة تماما لتقييم تفضيلات درجة الحرارة لمجموعات من اليرقات توظف ساحة مستطيلة الشكل، ويرد هنا. الجهاز بسيط لبناء وتجميع. وباﻹضافة إلى ذلك، الانحدار الخطي، وهو مرن، كما يمكن استخدامه لتقييم ثيرموتاكسيس على درجة حرارة كبيرة تتراوح بين 10 درجات مئوية إلى 42 درجة مئوية. المقايسة سريعة ومباشرة لأداء وتعطي البيانات استنساخه. بالإضافة إلى الإبلاغ عن درجة الحرارة المفضلة لليرقات، فإنه يكشف عن أفضليات سكان الحيوانات على مجموعة خطية كاملة في تجربة واحدة. ونظرا لهذه المزايا، خيار ممتاز لتحديد الجينات المطلوبة ثيرموتاكسيس.

البروتوكول

1-معدات تصنيع وتجميع أجهزة لفحوصات التدرج

1. اختﻻق لوحات الألومنيوم المقايسة لتحليل الانحدار أحادية الاتجاه.
   1. تقليم وطحن كل لوحة المقايسة الألومنيوم (الشكل 1A) الخروج من قطعة واحدة من الألمنيوم باستخدام منشار باند وحادة مطحنة عمودية مع الأبعاد التالية: حجم الخارجي هو 140 × 100 × 9 مم وهو الحجم الداخلي 130 × 90 × 8 مم (الشكل 1B). انودت داخل كل لوحة المقايسة مع الطلاء الأسود لجعله أسهل لتصور اليرقات ومنع الصدأ.
      ملاحظة: يتم تصنيع لوحات الألومنيوم المقايسة للتدرج أحادية الاتجاه بمتجر لالة. أنوديزيشن يؤديها بائع تجارية.
   2. وضع علامة على دواليب العلوي والسفلي لكل لوحة المقايسة مع ترسيم 13، مفصولة بواسطة 10 ملم باستخدام علامة دائمة. وضع ترسيم أول وآخر 5 مم من الحافة الداخلية من ألواح المقايسة (الشكل 1 أ، ب).
2. لاختلاق لوحة الألومنيوم المقايسة للتدرج ثنائي الاتجاه، قطع صفيحة ألومنيوم مع الأبعاد التالية باستخدام مقص صفائح معدنية: 250 × 220 × 2 مم. انودت لوحات المقايسة مع الطلاء الأسود.
   ملاحظة: يؤديها متجر آلة تصنيع لوحات الألومنيوم المقايسة للتدرجات ثنائي الاتجاه. أنوديزيشن يتم عن طريق بائع تجارية.
3. افتعال كتل الألومنيوم.
   ملاحظة: هناك حاجة إلى مبنيين للتدرج أحادية الاتجاه، وهناك حاجة إلى ثلاث كتل للتدرج ثنائي الاتجاه.
   1. قص كتل الألومنيوم (الشكل 1) الخروج من قطعة واحدة من الألمنيوم باستخدام منشار باند (أبعاد 50 × 255 × 14 مم) (الشكل 1، د).
   2. حفر قناة مائية داخل الكتلة (7 ملم في القطر) باستخدام طاحونة عمودية والاخاديد مؤشر ترابط في نهايات مفتوحة على جانب واحد (الشكل 1). قم بإغلاق الثقوب مخدد مع البراغي وترابط ختم الشريط لتشكيل قناة مياه على شكل U (الشكل 1، د).
      ملاحظة: يؤديها متجر آلة تصنيع الكتل المقايسة الألومنيوم.
   3. إصلاح الرابط في كتلة الألومنيوم (الشكل 1) مع المواضيع المسمار وترابط ختم الشريط في نهاية واحدة. تناسب الطرف الآخر مع عدة انتقادات لاذعة في سيليكون أنابيب (معرف 1/4 "x 3/8" OD x 1/16 "الجدار).
4. الحصول على اثنين حمامات يتناقل المبردة ساخنة.
5. تجميع كتل التحكم في درجة الحرارة لنظام تحليل الانحدار.
   1. للتدرج أحادية الاتجاه، الاتصال كل من الكتلتين الألومنيوم بحمام مائي منفصلة حيث أن درجة الحرارة لكل كتلة يسيطر مياه مستقلة تعميم نظام (الشكل 2A). استخدام أنابيب سيليكون (معرف 1/4 "x 3/8" OD x 1/16 "الجدار) لتوصيل مخرج حوض ماء بالموصل الموجود على الجانب الداخلي من كتلة الألومنيوم (الشكل 2A). أيضا، استخدام أنابيب لتوصيل موصل الجانب الخارجي على كتلة الألومنيوم إلى المدخل لحمام الماء.
   2. للتدرج ثنائي الاتجاه، مكان اثنين من ثلاث كتل تحت اليسار والجانبين الأيمن من اللوحة وتوصيلها إلى حمام الماء نفسه مع الأنبوب (الشكل 2). قم بتوصيل كتلة الألومنيوم الثالثة إلى حوض ماء ومكان أدناه مركز اللوحة (الشكل 2) الثانية.
      ملاحظة: هذا الجهاز والمقايسة ضرورية فقط إذا اليرقات تتكدس في المنطقة عند حافة واحدة أو أخرى من التدرج أحادية الاتجاه. إذا كان الأمر كذلك فمن المهم لتقييم ما إذا كان أو لم يكن هناك تأثير الحافة. لاختبار هذه الإمكانية، إنشاء تدرج ثنائي الاتجاه فيها درجة الحرارة في منطقة الحافة المفضلة من قبل اليرقات باستخدام التدرج أحادية الاتجاه (مثلاً 18 درجة مئوية) هو درجة الحرارة في منتصف لوحة التدرج ثنائي الاتجاه (3E الشكل وو).

2-اليرقات المزامنة

1. تغذية الذباب لاستخدامها لوضع البيض.
   1. مزيج الخميرة الحبيبات والماء المقطر مع مدقة جعل الخميرة لصق. دقة طحن ويقلب حتى اتساق اللصق مماثل لزبدة الفول السوداني. تجنب لصق الجافة مفرطة، قد تقشر عند نقل الذباب على قارورة جديدة، أو الرطب اللصق، التي يمكن أن تعوض الذباب.
   2. استخدام مدقة، إضافة عجينة الخميرة قريبة من الجدران الداخلية للقنينات المورفولوجية القياسية، فقط فوق السطح من المواد الغذائية.
   3. 12-35 عدد الإناث وتصل إلى نصف الذكور العديد من (ولكن لا يزيد عن 10) على لوح₂ أول أكسيد الكربون، وإضافة على الإناث والذكور لكل قنينة المحتوية على لصق الخميرة.
   4. للحفاظ على الطاير الغذاء مع لصق الخميرة الرطبة، بينما تغذية الذباب، بضم هذه القنينات في درج يحمل يصل إلى 100 قارورة مع 20 قارورة مفتوحة تحتوي على الماء فقط المقطر. ضع العلبة في كيس من بلاستيك الشفاف وختم.
   5. احتضان الدرج في حاضنة 25 درجة مئوية أجل ح 48 حيث أن الإناث يحصلون على تغذية كافية، مما يفسح المجال أمامهم تضع أعدادا كبيرة من البيض.
2. إعداد قنينات لوضع البيض.
   1. نقل الذباب يتغذى في قنينات الغذائية الجديدة لجمع البيض بالاستفادة منها أكثر. لا تستخدم CO_2، الذي قد يسبب الذباب لوضع البيض أقل خلال وقت قصير النافذة التالية.
      ملاحظة: يتم استخدام قارورة الغذاء القياسية المورفولوجية دون لصق الخميرة لجمع البيض.
   2. تسمح الذباب لوضع البيض ح 3 عند 25 درجة مئوية حيث أن يتم جمع كل البيض على مدى إطار زمني ضيق نسبيا.
      ملاحظة: هذا سيمكن اليرقات التي سيتم مزامنتها في نفس المرحلة الإنمائية.
   3. ضع قارورة تحتوي على البيض في علبة تحتوي على قنينة المياه وتشديد الحقيبة. احتضان عند 25 درجة مئوية تحت الضوء ح 12:12 ح دورات الظلام.
   4. عمر اليرقات لعدد معين من ساعات بعد وضع البيض (AEL) تبعاً لمرحلة اليرقات المرجوة.
      ملاحظة: الجدول 1 هو تقدير العلاقة بين ساعات AEL ومرحلة اليرقات، التي سوف تختلف باختلاف الأسهم يطير، المواد الغذائية المستخدمة، تربية إلخ العلاقة الدقيقة بين AEL ومرحلة النمو يجب أن يكون درجة الحرارة التحقق من كل محقق باستخدام المعايير المادية، مثل مورفولوجية خطاطيف و spiracles الفم¹¹.

3-تدرج درجة الحرارة الإعداد

1. إعداد التدرج أحادية الاتجاه
   1. لتهيئة بيئة المحيطة رطبة خلال الاختبارات، مكان اثنين من كتل الألومنيوم متصل بحمامات المياه اثنين على مناشف ورقية رطبة، مفصولة بواسطة 10 سم (الشكل 2A).
   2. قم بتشغيل أحواض المياه هما ح ~ 2 قبل الشروع في فحص للسماح بوقت كاف لدرجة حرارة كتل الألومنيوم لحجته.
      ملاحظة: من المستحسن القيام بتجربة وهمية لتحديد درجة حرارة حمام المياه كل ما هو مطلوب لتحقيق التدرج الخطي درجة الحرارة المرجوة. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين أحواض المياه في الجدول 2. ومع ذلك، نلاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب كما يؤثر هو التبريد درجات الحرارة كما أن هناك في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا 1.5 متر.
   3. الموجات الدقيقة 100 مل من 1% [اغروس] في الإعداد عالية الطاقة في 500 مل جولة الزجاجة واسعة الفم وصب 25 مل/الاعتداء لوحة على benchtop مستوى. إعداد لوحات المقايسة اثنين، والتي يمكن وضعها على كتل الألومنيوم في نفس الوقت (الشكل 2A).
   4. بعد وقد توطد [اغروس] (10-20 دقيقة)، فرك بلطف كل سطح [اغروس] مع اسفنجة مطبخ قياسية أو ميلامين الأسفنج جعل [اغروس] سطح خشن قليلاً، حيث أنه عند رش الماء على [اغروس] هلام، سيتم إنشاء غشاء الماء رقيقة ناعمة، وسوف تشكل لا قطرات الماء.
   5. تماما تغرق اللوحات في حاوية مع الماء المقطر حتى المقايسة على استعداد لإجراء لمنع اللوحات من الحصول على السيلاني.
2. إعداد تدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
   1. لتهيئة بيئة المحيطة رطبة خلال الاختبارات، وضع ثلاث كتل الألومنيوم 8 سم عن بعضها البعض (الشكل 2B) على مناشف ورقية رطبة.
   2. قم بتشغيل أحواض المياه هما ح ~ 2 قبل الشروع في فحص للسماح بوقت كاف لدرجة حرارة كتل الألومنيوم لحجته.
      ملاحظة: من المستحسن القيام بتجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام الماء للتدرج ثنائي الاتجاه. يتم سرد بعض أزواج درجة الحرارة النموذجية لتعيين أحواض المياه في الجدول 3. ومع ذلك، نلاحظ أن درجات الحرارة السطحية تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. طول الأنابيب كما يؤثر هو التبريد درجات الحرارة كما أن هناك في الأنابيب. طول الأنابيب في الإعداد لدينا 1.5 متر.
   3. للحيلولة دون تسرب خارج اللوحة [اغروس]، التفاف حواف لوحة الألومنيوم بوسم الشريط لتشكيل جدار 10 ملم-عالية (الشكل 2).
   4. استخدام الإعداد عالية الطاقة، الميكروويف 200 مل من 1% [اغروس] في 500 مل جولة الزجاجة واسعة الفم وصب 120 مل على صفيحة مقايسة.
   5. بعد وقد توطد [اغروس] (~ 30 دقيقة)، فرك بلطف كل سطح [اغروس] مع اسفنجة مطبخ قياسية أو ميلامين الأسفنج جعل السطح [اغروس] قليلاً الخشنة، حيث أنه عند رش الماء على [اغروس] هلام، يتم إنشاء غشاء الماء رقيقة ناعمة ولا شكل قطرات الماء.
   6. تماما تغرق لوحات الفحص في حاوية مع الماء المقطر حتى المقايسة على استعداد لإجراء لمنعها من الجفاف.
3. إنشاء تدرج لوني واحد ثنائي الاتجاه
   1. إعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز تحليل الانحدار (انظر الجدول للمواد).
   2. تشجيع نقل الحرارة فعالة، سد أي ثغرات بين كتل الألومنيوم وألواح المقايسة برش المياه في مجال التفاعل بين الكتل ولوحة.
   3. استخدام قفازات، إزالة لوحات الفحص من وعاء الماء. إذا يغزو بين [اغروس] هلام وصفيحة الماء وتسبب المطبات بشكل على السطح، إزالة الماء مع ميكروبيبيتي P1000.
   4. وضع لوحات الفحص على كتل الألومنيوم حيث أن ترسيم التي 2 سم من الحافة أما بالضبط مطابقة حواف كتل الألومنيوم (الشكل 2 أ، ج).
   5. رش الماء على سطح اللوحة (غشاء رقيق الماء يغطي السطح [اغروس] غير كافية) لمنع [اغروس] هلام من الجفاف. تأكد من أن الغشاء المياه مستمرة وخالية من قطرات الماء حيث يمكن الحصول على المحاصرين اليرقات في قطرات الماء.
   6. يشمل نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى للحد من تبخر المياه وتساعد على استقرار درجة حرارة سطح هلام. انتظر لمدة 5-10 دقيقة للسماح لدرجة الحرارة إلى حجته.
   7. فحص درجة الحرارة السطحية في 12 نقطة على اللوحة (الشكل 2). أخذ قياسات اثنين داخل كل منطقة تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تباين داخل منطقة. تأكد من درجة الحرارة في كل المواقع داخل ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
      ملاحظة: يحدث التغير داخل منطقة عادة بسبب المسافات الدقيقة للمكانين إلى الحافة من كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موضع لوحة على كتل الألومنيوم للتأكد من تطابق ترسيم التي 2 سم من الحافة أما بالضبط على حواف كتل الألومنيوم.
   8. إذا كان التدرج درجة الحرارة المقاسة ينحرف عن التدرج المطلوب، زيادة أو نقصان تصبح درجة حرارة حمام المياه وإعادة فحص درجة الحرارة السطحية بعد درجة حرارة bath(s) المياه stabilize(s).
   9. تغطية نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى حتى البدء الفحص.
4. إعداد ثنائي الاتجاه التدرج (اختياري)
   1. إعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز تحليل الانحدار (انظر الجدول للمواد).
   2. رش المياه على أسطح ثلاث كتل الألومنيوم لتشجيع نقل الحرارة فعالة من كتل الألومنيوم إلى لوحات الفحص بسد أي ثغرات بين السطوح.
   3. إزالة لوحات الفحص بعناية من وعاء الماء ووضع على كتل الألومنيوم. إذا يغزو المياه بين [اغروس] هلام اللوحة، التي قد تسبب المطبات إلى النموذج على السطح، وإزالة الماء مع ميكروبيبيتي P1000.
   4. ضع لوحة الفحص على كتل الألومنيوم حتى تتوافق ميدلينيس المناطق الأولى والأخيرة من أي حافة من حواف كتل الألومنيوم الجانب الثاني (الشكل 2، د) بالضبط.
   5. رش الماء على سطح اللوحة (غشاء رقيق الماء يغطي السطح [اغروس] غير كافية) لمنع [اغروس] هلام من الجفاف. تأكد من أن الغشاء المياه مستمرة وخالية من قطرات الماء، حيث يمكن الحصول على المحاصرين اليرقات في قطرات الماء.
   6. يشمل نظام التدرج مع صندوق من الورق المقوى للحد من تبخر المياه وتساعد على استقرار درجة حرارة سطح هلام. انتظر 5-10 دقيقة للسماح لدرجة الحرارة إلى حجته.
   7. فحص درجة الحرارة السطحية في نقطتين على طول خط الوسط من كل مناطق 10 (الشكل 2D). أخذ قياسات اثنين داخل كل منطقة تحديد ما إذا كان أو لم يكن هناك تباين داخل منطقة. تأكد من درجة الحرارة في كل المواقع داخل ± 0.2 درجة مئوية من درجة الحرارة المطلوبة.
      ملاحظة: يحدث التغير داخل منطقة عادة بسبب المسافات الدقيقة للمكانين إلى الحافة من كتل الألومنيوم ليست متطابقة. ضبط موضع لوحة على كتل الألومنيوم لتأكد من تطابق ميدلينيس المناطق الأولى والأخيرة أقرب كل حافة من حواف كتل الألومنيوم اثنين من الجانب بالضبط.
   8. إذا كان التدرج درجة الحرارة المقاسة ينحرف عن التدرج المطلوب، ضبط تصبح درجة حرارة حمام المياه وإعادة فحص درجة الحرارة السطحية بعد درجة حرارة bath(s) المياه stabilize(s).
   9. تغطية لبنات مع صندوق من الورق المقوى حتى بداية المقايسة.

4-اليرقات جمع والغسيل

1. عزل اليرقات نظيفة (الخيار 1)
   1. إضافة 18% ~ 40 مل من محلول السكروز إلى أنبوب اختبار 50 مل. حلج القطن جميع اليرقات من vial(s) الغذاء مع سكوبولا ونقل إلى 18% من محلول السكروز.
   2. مزيج دقيق لكن برفق باستخدام سكوبولا لفصل اليرقات من بقايا الطعام. انتظر 30-60 ثانية حتى تطفو اليرقات إلى الطبقة العليا من الأنبوب. صب الطبقة العليا التي تحتوي على اليرقات (~ 10 مل) إلى آخر أنبوب 50 مل وملء الأنبوب مع محلول السكروز 18% الطازجة. انتظر 30-60 ثانية حتى تطفو اليرقات إلى الطبقة العليا مرة أخرى.
      ملاحظة: نقل جنبا إلى جنب مع اليرقات جزيئات الغذاء الكبيرة في بعض الأحيان وقد تؤثر على اليرقات ثيرموتاكسيس إذا لم تتم إزالة. إذا تبقى جزيئات الغذاء الكبيرة في الطبقة العليا، كرر الخطوات 4.1.1-4.1.2، أو إزالتها يدوياً باستخدام سكوبولا.
   3. نقل الطبقة العليا من اليرقات (~ 10 مل) إلى اثنين آخرين من أنابيب 50 مل وملء أنابيب اثنين بالماء المقطر لخفض تركيز السكروز، حيث أن اليرقات غرقت بسرعة في الماء. انتظر 30-60 ثانية حتى اليرقات تنزل إلى القاع. نفذ هذا والخطوات التالية، في أسرع وقت ممكن لمنع اليرقات من الغرق.
   4. تجاهل قدر من الماء قدر الإمكان عن إمالة الأنابيب برفق. ضم اليرقات في أنبوب واحد بصب اليرقات مع الماء المتبقي وملء الأنبوب بماء مقطر.
   5. انتظر 30-60 ثانية حتى اليرقات كل بالوعة وإزالة المياه قدر ممكن عن إمالة الأنابيب برفق. كرر هذه الخطوة الغسيل 2-4 مرات تماما إزالة السكروز وجميع المواد الغذائية مرئية.
   6. تجاهل الكثير من الماء قدر الإمكان ونقل اليرقات إلى 35 ملم فارغ طبق بيتري بالصب. رش الأنبوب بالماء واستخدام فرشاة طلاء صغيرة للمساعدة في نقل اليرقات.
   7. إزالة الماء الزائد من طبق بيتري استخدام ميكروبيبيتي P1000. ترك ~0.5 مل من الماء منع جفاف اليرقات.
   8. ضع الغطاء على الطبق للحيلولة دون الإفلات من اليرقات. تشغيل الغطاء رأسا إلى الحد من قدرة يرقات للهروب من خلال الفجوة الصغيرة بين الغطاء وطبق. تسمح اليرقات استرداد ل 10-20 دقيقة.
2. عزل اليرقات نظيفة (الخيار 2)
   ملاحظة: هذا الأسلوب البديل لتنظيف اليرقات يخفف إمكانية خنق اليرقات أثناء إجراء الغسيل. لاستخدام هذا الأسلوب، المضي قدما في الخطوات التالية بعد تنفيذ 4.1.1-4.1.2 الخطوات المذكورة أعلاه.
   1. ضع مصفاة خلية (300 ميكرون، تحتفظ اليرقات 72 ح AEL أو كبار السن) على رأس أنبوب 50 مل.
   2. بعد التأكد من أن ليس هناك هيئات الكبار أو بقايا الطعام التي تطفو على سطح محلول السكروز، صب الطبقة العليا تحتوي على اليرقات من خلال مصفاة إلى اعتراض جميع اليرقات على شاشة شبكة. أغسل اليرقات جيدا بالماء المقطر حتى يتم تعبئة أنبوب 50 مل.
   3. إزالة مصفاة الخلية مع اليرقات والتخلص من المياه المستعملة من الأنبوب. ضع المصفاة المحتوية على اليرقات على رأس الأنبوبة الفارغة وتغسل اليرقات مرة أخرى مع الماء المقطر حتى يتم تعبئة أنبوب 50 مل.
   4. اقلب في المصفاة رأسا فارغة 35 ملم طبق بيتري، ورش المياه من الأعلى من مصفاة الخلية لنقل اليرقات إلى طبق بيتري. نقل اليرقات المتبقية باستخدام فرشاة طلاء صغيرة.
   5. ما زالت خطوة 4.1.7 أعلاه قبل الانتقال إلى الخطوة 5.

5-التحليل والحساب

1. إزالة في صندوق من الورق المقوى وفحص درجة الحرارة السطحية جل مباشرة قبل نقل اليرقات إلى اللوحة. تقليل الوقت الذي مفتوح صندوق من الورق المقوى لمنع الإخلال بالموازنة درجة الحرارة. إذا كان السطح الجاف، رش كمية صغيرة من المياه على السطح.
2. توزيع 150 ± 50 اليرقات قرب مركز كل لوحة (بين مناطق 3 و 4 من أصل 6 مناطق) للتدرج أحادية الاتجاه (الإصدار المنطقة؛ الشكل 2).
   ملاحظة: للتدرج ثنائي الاتجاه، توزيع اليرقات 200-400 على طول المنطقة الوسطى لكل نصف (الشكل 2D).
3. ضع غطاء ميكروسكوبية على كل لوحة الفحص للحيلولة دون الزحف على اليرقات. تغطي الإعداد مع صندوق من الورق المقوى لمنع التعرض للضوء، مما قد يؤثر على اختيار اليرقات على [اغروس] هلام.
   ملاحظة: للتدرج ثنائي الاتجاه، فإنه لا ضرورة لتغطية اللوحة مع غطاء، لأن اللوحة أكبر، ودرجة الحرارة المفضلة لليرقات في المنطقة الوسطى. ونتيجة لذلك، اليرقات قليلة تتراكم في الحواف وتتاح له فرصة للزحف.
4. السماح المقايسة المضي قدما لمدة 10-30 دقيقة للتدرج أحادية الاتجاه، ول 15-35 دقيقة للتدرج ثنائي الاتجاه، تبعاً لعمر اليرقات (الجدول 4).
5. قم بإزالة في صندوق من الورق المقوى وغطاء الميكروسكوبية. تصوير اللوحات من فوق باستخدام كاميرا رقمية. أخذ صورتين فوتوغرافيتين لكل لوحة الفحص حيث أن المحقق يمكن أن تختار واحدة مع التباين والسطوع لتحليل أفضل.
6. إزالة كل من اليرقات من لوحات المقايسة، وفي أي مكان خارج اللوحات بالطموح.
7. تنظيف لوحات المقايسة والأنابيب ومصفاة الخلية جيدا بالماء المقطر. إعادة استخدام لوحات الفحص أعد ذلك اليوم إلا إذا تلف سطح [اغروس].
8. حساب النسبة المئوية لتوزيع اليرقات في كل منطقة.
   1. قم بفتح الصورة الفوتوغرافية نتائج التحليل باستخدام أي برنامج يتيح إضافة علامات للصورة. للإشارة إلى مناطق الفحص، رسم خطوط عمودية كل سم 2 استناداً إلى ترسيم على لوحة المقايسة.
   2. حساب عدد اليرقات في كل منطقة وتسجيل الأرقام. لا تعول اليرقات في مناطق 0.5 سم من أي من الجدران. الهلام سمكا قرب الجدران، ودرجات الحرارة السطحية ليست خطية في هذه المناطق.
   3. للتدرج أحادية الاتجاه، حساب النسبة المئوية للتوزيع في كل منطقة على النحو التالي:
      (عدد اليرقات في منطقة معينة 2-سم)/(إجمالي عدد اليرقات في 6 مناطق) x 100.
   4. للتدرج ثنائي الاتجاه، حساب النسبة المئوية للتوزيع في كل منطقة على النحو التالي:
      (عدد اليرقات في منطقة معينة 2-سم)/(إجمالي عدد اليرقات في 5 مناطق على كل جانب من التدرج) x 100.

النتائج

لإنشاء 18 درجة مئوية--28 درجة مئوية واحدة-الاتجاه التدرج، نحن تعيين درجات الحرارة من اثنين من أحواض المياه إلى 16.8 درجة مئوية و 31 درجة مئوية. ونحن الحصول على درجات الحرارة على 13 نقطة عن طريق قياس درجة الحرارة في 26 موقعا في الجزأين العلوي والسفلي من جميع مناطق 6، خطوط الحدود بين المناطق، وفي أقصى الغايات من السطح [اغروس] هلام (الشكل 2، 2E). وكان توزيع درجة الحرارة على طول التدرج الخطي نحو (Y = 0.9672 * X + 16.19، ص² = 0.9961) (<...

المناقشة

لضمان النجاح لهذا البروتوكول، من المهم اتخاذ خطوات للحصول على العدد الكافي من اليرقات لإجراء التجارب. وتشمل هذه التغذية قبل الذباب في قارورة تحتوي على لصق الخميرة لمد 2-3 لتحسين وضع البيض. قارورة تحتاج إلى وضعها في علبة تحتوي على قارورة الماء ومحاطة بكيس من بلاستيك واضحة، مما يحافظ على الرطوبة من المواد الغذائية ويعزز تغذية فعالة من اليرقات في حين تسمح بالتعرض للضوء الظلام الدورات العادية. ومع ذلك، لا ينبغي لينة حتى أنه أصبح محاصراً الذباب لصق الخميرة. ويعتمد عدد الإناث كل قنينة على النمط الوراثي. في حالة ث^1118<...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
جهاز فحص التدرج <قوي> التدرج < / قوي >
PolyScience 9106 ، حمام دائري مبرد / ساخن سعة 6 لتر	توماس سيانتيفيك	9106	تم إيقاف هذا النموذج. تتضمن طرازات الاستبدال المحدثة: 1186R00 و 1197U04 ل 120 فولت أو 60 هرتز أو 1184L08 و 1197U04 ل 240 فولت ، 50 هرتز.
لوحة فحص الألومنيوم (للتدرج أحادي الاتجاه)			الحجم الخارجي: 14 × 10.1 × 0.9 سم ، الحجم الداخلي: 12.9 × 8.7 × 0.8 سم ، أسود بأكسيد الألومنيوم.
صفيحة ألومنيوم (للتدرج ثنائي الاتجاه)			25 × 22 × 0.2 سم ، أسود مؤكسد.
		الألومنيوم	الحجم الخارجي: 25.5 × 5 × 1.4 سم ، معلمات القنوات الداخلية موضحة في الشكل 1D.
موصل لكتل الألومنيوم والأنابيب	McMaster-Carr	91355K82
Tygon أنابيب سيليكون صحية	Tygon	57296	1/4 "معرف × 3/8" OD × 1/16 "جدار
<قوي>الاسم< / قوي>	<قوي>الشركة	رقم الكتالوج	تعليقات
Items و كواشف للفحص< / قوي>
مدقة	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	17361	مدقة لأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل
ميزان حرارة	فلوك	51II
مزدوجة	حرارية Fluke	K نوع
غطاء دقيق عالمي	Corning	6980A77
35 مم طبق	Corning	9380D40
شريط الملصقات (للتدرج ثنائي الاتجاه)	فيشر ساينتفيك	15-951	شريط الملصقات فيشربراند 2 بوصة × 14 ياردة
Agarose	Invitrogen	16500500	تحضير محلول 1٪
السكروز	Sigma	S0389-5KG	قم بإعداد محلول 18٪ قبل بدء الفحص
مباشرة فرشاة الطلاء	Fisher Scientific	11860
50 مل أنابيب	الطرد المركزيDenville	C1062-P
Scoopula	Fisher Scientific	14-357Q
500 مل زجاجة مستديرة واسعة الفم	Pyrex	1395-500
مصفاة خلية (مسام 300 مم)	PluriSelect	43-50300	عنصر اختياري لغسل اليرقات
صندوق من الورق المقوى (صينية قارورة)	Genesee Scientific	FS32-124
Name< / strong>	company	Catalog Number	Comments
ذبابة الفاكهة food
مقطر			22,400 مل
دقيق الذرة، أصفر (شبكة دقيقة جدا، متدفقة) 20 كجم	LabScientific Inc.	NC0535320	1،609 جرام
خميرة البيرة 100 رطل	MP Biomedicals	ICN90331280	379 جرام
NutriSoy & reg ؛ دقيق الصويا (10 كجم / وحدة)	جينيسي ساينتيفول	62-115	221 جم
<م >ذبابة الفاكهة < م > أجار ، النوع الثاني (5 كجم) جينيسي	ساينتفيك	66-103	190 جم
كارو شراب الذرة الخفيف	كارو		1،700 مل
ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات (معلق في 200 إيثانول برهان)	سيجما ألدريتش	H5501-5 كجم	72 جم / 240 مل
حمض البروبيونيك النقي. سنويا ، >99.5٪ (GC)	سيجما ألدريتش	81910-1 لتر	108 مل
حمض الفوسفوريك   كاشف ACS ، & ge 85 بالوزن ٪ في H2< / sub>O	Sigma Aldrich	438081-500 مل	8.5 مل