نقدم هنا، بروتوكول خطوة بخطوة للتصوير محاور عصبية myelinated في شريحة الدماغ ثابت باستخدام النانو خالية من التسمية التصوير تقنية تستند إلى ريفليكتوميتري الطيفية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مجهر ريفليكتوميتريك الطيفية على محاور عصبية ميليناتيد في الموقع
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين عزل كهربائي التي انورابينج الألياف إكسون في دوامة متعدد الطبقات. مستوحاة من هندسته المعمارية سوبسيلولار نظم عالية، وضعنا مؤخرا طريقة جديدة لتصوير، المسمى ريفليكتوميتري الطيفية (صبري)، الذي يتيح التصوير النانوي خالية من التسمية لم يسبق لها مثيل من محاور عصبية myelinated يعيش في الموقع. والمبدأ الأساسي الحصول على معلومات نانوستروكتورال عن طريق تحليل الطيف الانعكاس لهيكل سوبسيلولار متعدد الطبقات. في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكول مفصلة خطوة بخطوة للقيام تصوير صبري أساسية من أنسجة عصبية باستخدام نظام مجهرية [كنفوكل] تجارية، مزودة بليزر الضوء الأبيض وعامل تصفية الانضباطي. نحن تغطي إجراءات إعداد عينة، اقتناء البيانات الطيفية، ومعالجة للحصول على معلومات نانوستروكتورال الصور.
المقدمة
في الجهاز العصبي الثدييات، يوفر المايلين التوصيل السريع العصب وسلامة محواري قبل انورابينج الألياف إكسون مع مانعات الغشائي متعدد الطبقات. يتكون هيكلها المتعدد الطبقات من النانو رقيقة-أفلام تتألف من أغشية البلازما بالتناوب (~ 5 نانومتر)، سيتوسول (~ 3 نانومتر)، والأماكن خارج الخلية (~ 7 نانومتر)1،2. مجهرية البصرية، بما في ذلك مجهرية فائقة القرار الأخير، ليست مناسبة لمراقبة ديناميات النانو المايلين بسبب القرار غير كاف بسبب الحيود الضوئية3،،من45. على الرغم من أن المجهر الإلكتروني يمكن أن توفر التفاصيل الدقيقة ل nanostructure المايلين، أنها لا تتوافق مع النظم البيولوجية الحية بسبب العينة الغازية عاليا الأعمال التحضيرية المتعلقة بالتثبيت الكيميائي وأولتراسيكتيونينج6،7 . حتى وقت قريب، كان هناك لا تقنية تنطبق على مراقبة ديناميات النانو من محاور عصبية ميليناتيد في الموقع.
سبق ذكر شين et al. أن محاور عصبية myelinated المعرض الانعكاس الخفيفة الملونة8. باعتماد التحليل سبيكتروسكوبيك في الضوء المنعكس، وضعنا طريقة تصوير جديدة للتصوير بالنانو لمحاور عصبية myelinated، المسمى ريفليكتوميتري الطيفية (صبري)9. ويستند صبري تدخل الأغشية الرقيقة التي تحدث في بنية متعددة الطبقات من غمد المايلين (الشكل 1). بالألياف البصرية والمحاكاة على مختلف محاور عصبية، أننا قد كشفت أن الطيف الانعكاس دالة دورية وافينومبير وعن تواتر (
) تناسبا عكسيا مع قطر إكسون (د). هذه العلاقة البسيطة (
) ويقدم سهلة التحديد الكمي لقطر إكسون من البيانات صبري. الاستفادة من هذا، يمكننا كشف إكسون انتشارا انتفاخ تحت إصابات الدماغ الرضية معتدل في تقريرنا السابق.
نظام صبري يرتكز على الفحص المجهري [كنفوكل] ويتكون من مصدر الليزر المتخصصة ومرشحات (الشكل 2). مصدر الإدخال ليزر الضوء الأبيض، توفير النطاق العريض الإخراج الطيفية المرئية إلى مناطق الأشعة تحت الحمراء. لمسح طيفي، مجهزة النظام مع اثنين من الأجهزة البصرية أكوستو: أكوستو البصرية الانضباطي مرشح (أوتف) لإيصال طول موجي محدد من مصدر الإدخال النطاق العريض والخائن شعاع أكوستو البصرية (أوبس) لتوجيه المحدد ينعكس الطول الموجي للجهاز. البرنامج للفحص المجهري [كنفوكل] الفائقة الطيفية (انظر الجدول للمواد) يوفر خيار مسح طيفية لتخصيص للتتابع الحصول على صور الانعكاس في مختلف الأطوال الموجية الإدخال. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتداخل زيغ حاسمة في القياس الطيفي؛ ولذلك، يوصي باستخدام عدسة الهدف أبوتشرومات.
ملاحظة، الليزر الضوء الأبيض تنتج ناتج طيفية متفاوتة والمكونات الضوئية تؤثر أيضا على الشخصية الطيفية. ولذلك، يحتاج الأطياف المكتسبة للمعايرة للتحليل الكمي اللاحقة. مرآة فضة محمية يستخدم عادة كمرجع، التي تنص انعكاس ثابتة تقريبا (> 97 في المائة) على مدى المنطقة المرئية الكاملة. ثم تنقسم أطياف المكتسبة من الأطياف المرجعية من النسخة المتطابقة.
يحدد حجم الخطوة الطيفية لمسح طيفي سرعة اقتناء؛ وبالتالي، ينبغي أن يكون الأمثل. كما إكسون أكبر فترة طيفية أعلى، فهو يتطلب الطيفية العينات الدقيقة. على سبيل المثال، قد إكسون التي يبلغ قطرها 10 ميكرون، واحدة من أكبر محاور الفسيولوجية عصبية، فترة طيفية ~ 8 نانومتر. عن طريق تطبيق معايير العينات نايكست، استخدمنا الفاصل الزمني أخذ العينات الطيفية 4 نانومتر لتغطية جميع محاور عصبية الفسيولوجية في أنسجة عصبية الماوس. هذا النهج يأخذ عادة خلال عدة ثوان لمسح كامل طيفية وهكذا ليست مناسبة للتطبيقات في فيفو ، حيث يتداخل الحركة الفسيولوجية (مثل التنفس وضربات القلب) اقتناء الطيفية مستقرة. ونحن سابقا حل هذه المسألة خلال تحرير مجهر تستقيم مخصصة، مصممة للحصول على الطيف الكامل لكل نقطة باستخدام مطياف صفيف (اكتساب السرعة ≈ 30 مللي كل بكسل).
في هذا التقرير، يصف لنا بروتوكول مفصل على تصوير صبري على شريحة الدماغ ثابتة، التي يمكن أن يؤديها في مجهر الطيفي تجارية (انظر الجدول للمواد). وهكذا، يمكن إكمال البروتوكول من المجربون دون خبرة في الأجهزة البصرية. ونحن أيضا تغطية المشاكل المحتملة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على البيانات وتحليلها صبري.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
بموافقة جميع العمليات الجراحية "العناية بالحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة سونغكيونكوان.
1. إعداد نموذج
ملاحظة: اﻷوتوكﻻف جميع الأدوات الجراحية قبل التعامل مع الحيوانات. القيام بأداء جميع العمليات الجراحية في غرفة مخصصة للعمليات الجراحية. يجب أن تلبس العباءات الجراحية المعقمة وقفازات من جميع الموظفين في غرفة العمليات الجراحية في جميع الأوقات.
-
تثبيت الأنسجة
- إعداد اثنين من الحقن 10 مل كل مليئة بالفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وبارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني.
- تخدير العمر 7-12 أسبوع ماوس (C57BL/6J أو أي خطوط الماوس مع أي من الجنسين) بإدارة خليط من زوليتيل وإكسيلازيني (1:1، 20 مغ/كغ كل) أو نظام بديل مناسب تخدير (مثلاً، مزيج من الكيتامين 80 ملغ/كغ و 10 مغ/كغ xylazine) مع حقن داخل.
- وبمجرد الماوس وصلت طائرة جراحية التخدير (استخدام الأسلوب استجابة قرصه تو)، فضح القلب بقطع الجلد والقفص الصدري مع المقص.
- قص الاذين الأيمن مع مقص صغير نزيف الدم ونتخلل الحل برنامج تلفزيوني ومنهاج عمل بيجين تسلسلياً من خلال البطين الأيسر بإبرة (معدل التروية = 4 مل/دقيقة، الحجم = 10 مل لكل حل).
ملاحظة: يصبح الماوس قاسية إذا تم إكمال هذا الإجراء بنجاح. استخدام مرهم العين أو التعقيم ليس من الضروري كما الإجراء المحطة الطرفية. قد يتم تخطي هذا الإجراء التثبيت. ومع ذلك، يوصي بهذه الخطوة تقليل التشوهات الهيكلية بما في ذلك تلف الأنسجة الميكانيكية وتورم محواري الدماغية. لمزيد من التفاصيل حول تثبيت الأنسجة، الرجوع إلى المقالة بسبر، ج. غ. et al. 10
-
إعداد شريحة الدماغ
- قطع رأس الماوس مع المقص الجراحي عن طريق البطني الصدر والبطن.
- إزالة فروة الرأس والسمحاق استخدام مقصات صغيرة تأهيلاً مناسباً حتى فضح تماما في الجمجمة.
- كسر في عظم جبهي وقطع الجمجمة على طول خياطة السهمي من عظم قذالي استخدام مقص صغير مع الرعاية لا لتلف الدماغ.
- إزالة بلطف الجمجمة والأم الجافية التتابع باستخدام الملقط غرامة.
- استخراج الدماغ باستخدام ملعقة بلاستيكية لينة، مع الحرص على عدم الأضرار الأنسجة.
- شطف ونقع في الدماغ المستخرجة في حل منهاج عمل 4% لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- شريحة الدماغ ثابت إلى 100-150 ميكرومتر أقسام استخدام فيبرتوم.
ملاحظة: لمزيد من التفاصيل حول إعداد الأنسجة، الرجوع إلى المقالة التي سيغيف et al. 11-الإجراءات اللاحقة، الأنسجة ينبغي أن تكون شرائح إلى أقسام أرق من سمك الفاصلة.
-
تركيب شريحة الدماغ
- إعداد الشرائح الزجاجية 1 والنظارات غطاء مربع 2 (22 × 22 × 0.17 ملم) لكل شريحة الأنسجة.
- يقتطع من نظارات تغطي مساحة نصف (قطعتين مستطيلة) باستخدام قاطع زجاج.
- إرفاق اثنين نظارات تغطي النصف استخدام غراء سوبر على شريحة الزجاج.
ملاحظة: يجب أن تكون المسافة بين النظارات النصف الثاني أكبر قليلاً من حجم الشريحة الأنسجة. - حصاد شريحة الدماغ باستخدام فرشاة أو ماصة وإرساء الأنسجة على زجاج الشريحة بين فاصل. الحرص على عدم إضعاف الأنسجة.
- الاستغناء عن 100 ميكروليتر من برنامج تلفزيوني على سطح النسيج.
- مكان الزجاج مربعة أخرى غطاء رأس الأنسجة. تجنب إدراج فقاعات الهواء خلال هذه المرحلة.
- ختم حول تغطية الزجاج تستخدم طلاء الأظافر (أو المواد اللاصقة كبديل مناسب) لمنع التبخر من برنامج تلفزيوني والتلوث بالغبار خلال الدورة اللاحقة التصوير.
ملاحظة: يمكن وقفه المجرب في هذه المرحلة.
2-المعايرة
- التبديل في المجهر على الأقل 1 ساعة قبل التصوير للسماح بتحقيق الاستقرار الحراري الليزر مصدر (انظر الجدول للمواد). ثم، قم بتشغيل برنامج المسح الطيفي (انظر الجدول للمواد) وانقر فوق الزر الحصول على الجزء العلوي من واجهة المستخدم الرسومية (الشكل 3a).
- قم بتشغيل مصراع البرمجيات لليزر الضوء الأبيض (ذ) وأنبوب ضوئي (PMT) (الشكل 3a).
- حدد وضع xyΛ في القائمة المنسدلة في اكتساب وضع، ثم وضع الإدخال الليزر تتغير تلقائياً من المئة المستمر القوة الثابتة. قم بإلغاء تحديد خانة الاختيار تلقائي SPالحركة. وثم تعيين الإطار الطيفي لليزر الإدخال إلى 470 – 670 نانومتر وحجم الخطوة الطيفية إلى 4 نانومتر على Λ-"المسح الضوئي لامدا الإثارة" إعدادات (الشكل 3b).
- تعيين النطاق الطيفي من PMT إلى 450-690 بالنقر المزدوج فوق أو تحريك الشريط التكيف للنطاق الطيفي (الشكل 3 ج).
ملاحظة: ينبغي أن يشمل هذا النطاق الطيفي في عرض النطاق الترددي كامل من مصدر الإدخال. - حدد عدسة هدف غمر مياه، تأهيلاً مناسباً مع فتحه عددية عالية (NA > 0.7) وإعطاء أي قيمة للسلطة PMT والليزر لتنشيط الزر تكوين أوبس و يعيش المسح الضوئي . تبديل مسار بصري عن طريق التحقق من التفكير في تكوين أوبس (3d الشكل).
- جبل مرآة مرجعية (انظر الجدول للمواد) على المسرح المجهر. وينبغي أن تواجه سطح مرآة ضد العدسة الهدف. إذا ليس من السهل وضع المرأة على مرحلة مجهر، السندات مرآة على لوحة مسطحة (مثل الشرائح الزجاجية).
- مراقبة مرحلة مجهر لمحاذاة المستوى البؤري لسطح مرآة.
- ضبط كسب PMT والليزر سلطة النظر في النطاق الديناميكي للجهاز وقم بتغيير وضع الإدخال الليزر من المستمر في المئة إلى القوة الثابتة.
ملاحظة: كما هي الحال، الحصول PMT 500 (V) وتستخدم قوة ليزر نسبي من 0.1% في 570 نانومتر. - تأكيد في وضع ألوان الزائفة للتحقق من أنه لا يوجد أي التشبع في كامل نطاق الطول الموجي. إذا كان من الملاحظ التشبع، أقل قوة الليزر (الشكل 3a).
- تشغيل الحصول على المسح الضوئي لامدا .
- إزالة النسخة المتطابقة من المرحلة وتكرار اقتناء نفس دون عينة من أجل الحصول على مرجع الظلام (أي، إزاحة الظلام).
- حفظ البيانات في تنسيق TIF مولتيستاكيد .
3-الحصول على الصور صبري
- مكان الأنسجة المركبة على المسرح المجهر. لمحاذاة الأنسجة إلى المستوى البؤري للعدسة الهدف تقريبا، استخدم وضع الأسفار واسع المجال عن طريق قطعة عين.
- مع يعيش المسح الضوئي على، التحكم في مرحلة مجهر لمحاذاة المستوى البؤري لمنطقة الفائدة في الأنسجة. لتجنب الضوضاء الخلفية من كشف الغطاء، حدد المنطقة المستهدفة على الأقل 15 ميكرومترات عمق من الواجهة الزجاجية-الأنسجة.
- الحصول على المكدس صورة طيفية للمنطقة المستهدفة باستخدام نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوات 2.1 – 2.10.
- حفظ البيانات للأنسجة وإزاحة الظلام في تنسيق TIF مولتيستاكيد .
ملاحظة: يمكن وقفه المجرب في هذه المرحلة.
4-تجهيز وتحليل الصور
- فتح البيانات الطيفية (مولتيستاكيد TIF) للمرأة إشارة وأنسجة المخ في إيماجيج.
- حدد رويس (المناطق ذات الاهتمام) رصات الصور المفتوحة – المنطقة الوسطى لمرآة المرجع والجزء المتعلق الألياف إكسون لانسجة المخ.
- الحصول على الأطياف الخام رويس المحدد بتشغيل الصورة ← ← مكدسات الشخصية "محور ع الأرض" في القائمة إيماجيج.
- فتح البيانات إزاحة الظلام، واحدة لمرآة الإشارة وغيرها المتخذة لانسجة المخ.
- الحصول على الأطياف لإزاحة الظلام بتشغيل الصورة ← ← مكدسات الشخصية "محور ع الأرض" في القائمة إيماجيج.
- حفظ كافة الأطياف المكتسبة باستخدام خيارات النسخ واللصق .
ملاحظة: لتصوير صبري، ينصح استخدام حقل التصوير المركزية لتقليل الانحرافات البصرية خارج المحور. ألياف إكسون قد تكون غير متجانسة هيكلياً على طول. ومن ثم تحديد العائد على الاستثمار على قطعة صغيرة من محور عصبي، عادة < 5 ميكرومتر، التقليل إلى أدنى حد جزئي-حجم قطعة أثرية المستحسن.
5-الأساس تصحيح وتحليل الإشارات صبري
- طرح الأطياف الإزاحة من الأطياف مرآة المرجعية وأنسجة الدماغ.
- تطبيع كل طيف بقسمة شدة الحد الأقصى من الطيف.
- تقسيم الطيف تطبيع إكسون بالطيف تطبيع مرآة مرجع وطرح الإزاحة DC من الطيف تم تسويتها.
- قياس التردد وافينومبير باحتواء الطيف المكتسبة إلى جيبية منحنى (انظر الجدول للمواد)، ثم قم بتحويل وافينومبير المكتسبة لتواترها بالمعاملة بالمثل مع أخذ.
- تحويل دورية وافينومبير إلى قطر إكسون باستخدام المعادلة في الشكل 4 ج.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وفقا للبروتوكول، وقد أعدت شريحة الدماغ ثابت مع تلطيخ خارجية، استهداف المايلين فلوروفوري (انظر الجدول للمواد). تصوير صبري أجرى على شريحة الدماغ باستخدام مجهر الطيفي تجارية [كنفوكل] بالتزامن مع الأسفار [كنفوكل] التصوير (الشكل 4 أ). لصبري، تم تعيين الكثافة البصرية الإدخال إلى 5 ميكرومتر µW/2 مع وقت يسكن بكسل المايكروثانيه ~ 1. هذه الجرعة الخفيفة على أمر من حجم أقل من الأسفار التقليدية مجهرية [كنفوكل]12. يستغرق ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
صبري هو خال من تسمية تصوير أسلوباً جديداً يستند إلى قياس التداخل الطيفي، الذي يقدم معلومات نانوية في محاور عصبية myelinated لايف للمرة الأولى،. في اقتناء البروتوكول الحالي، القرار المكانية لقطر إكسون وسام 10 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يستخدم سبيري أوامر من حجم أقل جرعة خفيفة مقارنة بغيرها ميكروسكوبيس القرار فائقة؛ ومن ثم، فحر من الضيائية وفوتوبليتشينج. صبري ستوفر سبيلاً جديداً لدراسة ديناميات النانو من محاور عصبية ميليناتيد.
البروتوكول الموضحة هنا يستند المسح الطيفي بوساطة أكوستو والبصريات وكاشف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن تضارب المصالح المالية: J. كوون وتشوي م. مخترعين تكنولوجيا براءات الاختراع في انتظار الموضحة في هذه المقالة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل بمعهد العلوم الأساسية (IBS-R015-D1) ومن "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) تمولها وزارة التعليم (2017R1A6A1A03015642).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قاطع الزجاج | - | يمكن شراؤه من متجر محلي أو متاجر عبر الإنترنت. | |
| طلاء الأظافر | - | يمكن شراؤه من متجر محلي أو متاجر عبر الإنترنت. | |
| هدف Apochromat 40 مرة ؛ NA 1.1 | Leica Microsystems | 15506357 | نوع الغمر في |
| الماء Fluoromyelin Green | Thermo Fisher | F34651 | بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Fluoromyelin Red (F34652). |
| Leica SP8 TCS مجهر | Leica Microsystems | SP8 | راجع "تكوين المجهر" في قسم المقدمة للحصول على التفاصيل. |
| برنامج التصوير | Leica Microsystems | LAS-X-Matlab | |
| MathWorks | - | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | مطلي بالفضة المحمية. |
| محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) | تقنيات الحياة | 14190-136-Paraformaldehyde | |
| Biosolution | BP031a | 4٪ v / v في | |
| PBS غطاء زلة | Thermo Fisher | 3306 | السماكة: # 1 (0.13 إلى 0.17 مم) |
| زجاج منزلق | Muto Pure Chemicals | 5116-20F | السماكة: ~ 1 مم |
| Super Glue | Henkel | Loctite 406 | استخدم معدات توزيع لتجنب ملامسة الجلد أو العين. |
| مضخة الحقنة | Brainetree Scientific | BS-8000 | DUAL-Vibratome |
| Leica Biosystems | |||
| VT1200S-White-light laser | NKT الضوئيات | EXB-6 | EXB-6 تم استبدالها ب EXU-6. |
المراجع
- Fernandez-Moran, H., Finean, J. B. Electron microscope and low-angle x-ray diffraction studies of the nerve myelin sheath. Journal of Cell Biology. 3, (1957).
- Blaurock, A. E. The spaces between membrane bilayers within PNS myelin as characterized by X-ray diffraction. Brain Research. 210, 383-387 (1981).
- Shim, S. -H., et al. Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 13978-13983 (2012).
- Urban, N. T., Willig, K. I., Hell, S. W., Nägerl, U. V. STED nanoscopy of actin dynamics in synapses deep inside living brain slices. Biophysics Journal. 101, 1277-1284 (2011).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nature Methods. 5, 155-157 (2008).
- Peters, A., Sethares, C. Is there remyelination during aging of the primate central nervous system? Journal of Comparative Neurology. 460, 238-254 (2003).
- De Campos Vidal, B., Silveira Mello, M. L., Caseiro-Filho, A. C., Godo, C. Anisotropic properties of the myelin sheath. Acta Histochemica. 66, 32-39 (1980).
- Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy. Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).
- Kwon, J., et al. Label-free nanoscale optical metrology on myelinated axons in vivo. Nature Communication. 8, 1832(2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. JoVE. (65), e3564(2012).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. JoVE. (112), e54024(2016).
- Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy. Scientific Reports. 5, 15348(2015).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14, 593-599 (2017).
- Polishchuk, R. S., et al. Correlative light-electron microscopy reveals the tubular-saccular ultrastructure of carriers operating between Golgi apparatus and plasma membrane. Journal of Cell Biology. 148, 45-58 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
