Method Article

تصور التفاعل بين المسمى قدوت البروتين والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي تم التعديل على مستوى جزيء واحد

DOI:

10.3791/57967

⸱

July 17th, 2018

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لدراسة التفاعلات الحمض النووي-البروتين بالتأمل الداخلي الإجمالي fluorescence مجهرية (تيرفم) استخدام ركيزة λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي وكم-نقطة المسمى البروتين.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مجهرية fluorescence إسهامات عظيمة في تشريح آليات معقدة من العمليات البيولوجية على مستوى جزيء واحد. في فحوصات جزيء واحد لدراسة التفاعلات بين الحمض النووي من البروتين، وهناك اثنين من العوامل الهامة للنظر فيها: الركيزة الحمض النووي بما يكفي لطول السهل والمراقبة ووضع العلامات بروتين مع تحقيق فلورسنت مناسب. 48.5 kb λ الحمض النووي مرشح جيد للركيزة الحمض النووي. نقاط الكم (قدوتس)، كفئة من المسابر الفلورسنت، السماح للمراقبة منذ فترة طويلة (دقائق إلى ساعات)، والحصول على صورة عالية الجودة. في هذه الورقة، نقدم بروتوكولا لدراسة تفاعلات البروتين الحمض النووي على مستوى جزيء واحد، الذي يشمل إعداد λ سيتيسبيسيفيكالي تعديل الحمض النووي ووصفها بروتين المستهدف مع المغلفة ستريبتافيدين قدوتس. لدليل على المفهوم، نختار شركة مصفاة نفط عمان (التعرف على منشأ المعقدة) في مهدها الخميرة وتين فائدة وتصور تفاعله مع أرس (تسلسل تكرار صورة مستقلة) باستخدام تيرفم. مقارنة مع أخرى تحقيقات الفلورسنت، قدوتس بمزايا واضحة في دراسات جزيء واحد نظراً لاستقرارها عالية ضد فوتوبليتشينج، ولكن تجدر الإشارة إلى أن هذه الخاصية تحد من تطبيقها في الاختبارات الكمية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي تعتبر أساسية للعديد من العمليات البيولوجية المعقدة، مثل تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي، والنسخ. على الرغم من أن النهج التقليدية قد يلقي الضوء على خصائص هذه العمليات، العديد من الآليات الرئيسية لا تزال غير واضحة. ، مع تقنيات جزيء واحد سريع النمو، بعض الآليات في الآونة الأخيرة تناول1،،من23.

تطبيق الفحص المجهري fluorescence جزيء واحد على تصور تفاعلات البروتين-الحمض النووي في الوقت الحقيقي أساسا يعتمد على وضع الكشف عن الأسفار والمسابير الفلورسنت. لدراسة جزيء واحد، من المهم أن تسمية بروتين الاهتمام مع تحقي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد الركازة الحمض النووي λ-ARS317

  1. بناء الركيزة الحمض النووي والتعبئة والتغليف
    1. هضم الحمض النووي λ الأصلية باستخدام زهوأنا الإنزيم؛ تضخيم الحمض النووي bp 543 تأثير جزء ARS317 من الحمض النووي الجينومي للناشئين الخميرة التي تحتوي على 20 كبسولة تفجير باستخدام bp مثلى تسلسل من المنبع والمصب من زهوأنا الموقع الإنزيم على الحمض النووي لامدا. إضافة 100 نانوغرام من زهوأنا هضم الحمض النووي λ و 10 نانوغرام من الحمض النووي تجزئتها إلى 10 ميليلتر نظام رد فعل جزئ مثلى، واحتضان رد فعل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. لحزم λ جزئ الحمض النووي، إضافة 25 ميليلتر من مقتطفات التغليف لامدا في المنتج جزئ، واحتضان رد فعل عند 30 درجة مئ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصور التفاعل بين شركة مصفاة نفط عمان المسمى قدوت وجمعية الإغاثة اﻷرمنية، نحن أولاً بناء الركيزة الحمض النووي λ-ARS317. تم إدماج جزء من الحمض النووي الذي يحتوي على ARS317 في زهوأنا الموقع (33.5 كيلو بايت) من الحمض النووي λ الأصلي طريق جزئ المتجانسة (الشكل 1A). المنتج جزئ تمت تعبئتها باستخدام مقتطفات وتم استزراع بالعاثية حزم الجسيمات في لوحات رطل (الشكل 1B). تم فرزهم ببكر البلاك بالعاثية إيجابية وأكدت التسلسل (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، وضع بروتوكول لمراقبة التفاعل بين البروتين المسمى قدوت والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي المعدلة باستخدام تيرفم في خلية تدفق. وتشمل الخطوات اللازمة الخاصة بالموقع تعديل الركازة الحمض النووي والحمض النووي بيوتينيليشن، وتنظيف ساترة والروغان، خلية تدفق إعداد، وتصوير جزيء واحد. وهناك نقطتان رئيسيتان ينبغي ملاحظة. أولاً، جميع الخطوات التي تنطوي عليها مع الحمض النووي λ ينبغي معالجته برفق لتقليل أي ضرر ممكن، مثلاً، تجنب الاختلاط بيبيتينج صعودا وهبوطاً مرارا وتكرارا. وثانيا، المهم جداً للتأكد من أن ساترة نظيف بما.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور حسن يارديمسى ويارديمسي Dr.Sevim معهد فرانسيس كريك لنوع المساعدة في التجارب جزيء واحد، الدكتور دانيال دوزديفيتش من مختبر الدكتور إريك جيم غرين من جامعة كولومبيا، الدكتور يوجي الشمس من جامعة بكين والدكتور كونلي تشن من جامعة تسينغهوا لإجراء مناقشة مفيدة. وأيد هذه الدراسة "الوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين" 31371264، 31401059، فريق الابتكار متعدد التخصصات الأكاديمية ونيوتن المتقدم الزمالة (NA140085) من "الجمعية الملكية".

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
متجر Lambda DNANew England BiolabsN301125 & mu ؛ L aliquots عند -20 & ordm;C.
XhoI< / em> إنزيمThermo Fisher ScientificFD0694
مجموعة استنساخ سريعة الانصهارBiotoolB22611
MaxPlax Lambda
مستخلصات التعبئة والتغليف		EpicenterMP5110سلالة بكتيرية LE392MP
مدرجة في هذه العبوة.
MgSO4< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd10013092أي علامة تجارية مقبولة.
تريسأمريسكو0497-5KG
NaClBeijing ChemicalN / Aأي علامة تجارية مقبولة.
MgCl2< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd10012818
ChloroformBeijing Chemical WorksN / Aأي علامة تجارية مقبولة.
NZ-amineAmrescoJ853-250G
أحماض الكازامينوSigma-Aldrich22090-500G
PEG8000BeyotimeST483
جهاز التحريك المغناطيسيIKAKMO2 الأساسي
15 مل أنبوب Eppendorf3012215115 مل ، معقم ، سائب ، 500 قطعة
RnaseSIGMAR4875-100MG
DnaseSIGMAD5319-500UG
Proteinase KAmresco0706-100MG
بادئات بيوتينيلThermo Fisher ScientificN / A
T4 DNA ligase ، T4 DNA Ligase ، عازلة التفاعل (10x)New England BiolabsM0202
CoverslipThermo Fisher Scientific22266882
الإيثانولSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة10009259
هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH)سيجما ألدريتش306568-100G
الأسيتونالحرارية فيشر العلميةA949-4
H2< / sub>SO4< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co. ، Ltd80120891حامض الكبريتيك
H2< / sub>O2< / sub>Sinopharm Chemical Reagent Co. ، Ltd1001121830٪ بيروكسيد الهيدروجين
الميثانولسيجما ألدريتش322415-2L
حمض الخليكسيجما ألدريتشV900798
APTESسيجما ألدريتشA3648
mPEG
(ميثوكسي بولي إيثيلين جلايكول)		LysanmPEG-SVA-5000
البيوتين-PEG
(البيوتين - البولي إيثيلين جلايكول)		LysanBiotin-PEG-SVA-5000
NaHCO3< / sub>Sigma-Aldrich31437-500G
فراغ المجففتيانجين مليار الرئة المعدات التجريبية المحدودةIPC250-1
فراغ السدادةMAGIC SEALWP300
كاتب زجاجي ذو رأس الماسELECTRON MICROSCOPY SCIENCES70036
شريحةزجاجية شراع العلامة التجارية7101
أنابيب مدخلSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE / 2القطر الداخلي 0.38 مم ؛ القطر الخارجي 1.09 مم.
مخرج الأنابيبSCI (Scientific Commodties INC.)BB31695-PE / 4القطر الداخلي 0.76 مم ؛ القطر الخارجي 1.22 مم.
شريط على الوجهينSigma-AldrichGBL620001-1EA
EpoxyLEAFTOP9005خمس دقائق إيبوكسي
StreptavidinSigma-AldrichS4762
مجهر مضانأوليمبوسIX71
ضخ / سحب
مضخة قابلة للبرمجة		جهاز هارفارد70-4504
532 نانومتر ليزرمتماسكالياقوت - 532-50
640 نانومتر ليزرمتماسكOBIS-640-100
EMCCD كاميراAndorDU-897E-CS0-BV
W-View Gemini Imaging
تقسيم البصريات		Hamamatsu الضوئيات KKA12801-01
نظام إضاءة TIRFأوليمبوسIX2-RFAEVA2
60 مرة ؛ هدف TIRFأوليمبوسAPON60XOTIRF
ليزر رباعي الحواف ثنائي اللون
شعاع مقسم		سيمروكDi01-R405 / 488 /
532 / 635-25x36
مرشح ممر النطاق التردديرباعي النطاق SemrockFF01-446 / 510 /
581 / 703-25
ثنائي اللون شعاع مقسمSemrockFF649-Di01-25x36
مرشح انبعاثتقنية كروما CorpET585 / 65m
مرشح الانبعاثChroma Technology CorpET665lp
FocalCheck مضان ، شريحة اختبار المجهر # 1Thermo Fisher ScientificF36909
SYTOX OrangeThermo Fisher ScientificS11368
Qdot705 < / sub>Streptavidin ConjugateThermo Fisher ScientificQ10163MPStore في 4 & ordm; ج ، لا تجمد.
ATPAmresco0220-25Gقم بإعداد محلول ATP 200 ملي مولار ، باستخدام ddH2< / sub>O ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.0 ، وقم بتخزين 10 & mu ؛ L aliquots عند -20 & ordm;C.
DTTAmrescoM109-5Gقم بإعداد حل 1 متر باستخدام ddH2< / sub>O ، وتخزين 10 & mu ؛ ل aliquots عند -20 & ordm;C.
يعمل فرع

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, Y. V., et al. Selective Bypass of a Lagging Strand Roadblock by the Eukaryotic Replicative DNA Helicase. Cell. 146 (6), 930-940 (2011).
  2. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule ImagingDNA Protein InteractionQuantum Dot LabelingLambda DNA SubstrateSite Specific ModificationTIRF MicroscopyFlow Cell AssemblyStreptavidin Coated QdotsORC Qdot705 LabelingSYTOX Orange Staining

Related Articles