يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز

8.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/57982

⸱

أكتوبر 22, 2018

 , 
1Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Illkirch, France, 2Centre National de la Recherche Scientifique, Illkirch, France, 3Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Illkirch, France, 4Université de Strasbourg

في هذه المقالة

ملخص

البروتوكول هو موضح هنا يستند إلى التحديد الكمي للمركب حديثا مرناً تنقيته من خلايا الخميرة المسمى مع 4-ثيوراسيل على نطاق الجينوم. هذا الأسلوب يسمح بقياس توليف مرناً فصل من تسوس مرناً، ويوفر بالتالي، قياس دقيق للحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ.

الملخص

قد التغاضي عن العيوب العالمي في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ بالدراسات ترانسكريبتوميك تحليل الحمض النووي الريبي في حالة مستقرة. في الواقع، قد تبين الانخفاض العالمي في توليف مرناً تعويض انخفاض متزامنة في تدهور مرناً لاستعادة مستويات مستقرة العادي. ومن ثم فهو التحديد الكمي على نطاق الجينوم لتوليف مرناً، بمعزل عن اضمحلال مرناً، انعكاس مباشر أفضل من الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخي نشاط. وهنا نناقش أسلوب استخدام غير مقاومة وسم الأيضية للكشف الوليدة في Saccharomyces cerevisiae (س. سيريفيسيا). على وجه التحديد، تستزرع الخلايا لمدة 6 دقائق مع اليوراسيل تناظرية، 4 ثيوراسيل، وتنقية الكشف حديثا يدون المسمى وكمياً لتحديد معدلات توليف جميع مرناً الفردية. وعلاوة على ذلك، باستخدام المسمى بومبي شيزوساكتشاروميسيس الخلايا كما قياسي الداخلية تسمح بمقارنة توليف مرناً في مختلف S. cerevisiae سلالات. باستخدام هذا البروتوكول وتركيب البيانات مع نموذج دينامي حركية، يمكن تحديد معدلات تسوس مرناً المناظرة.

المقدمة

الخلايا تستجيب لمنبهات داخلية وخارجية، من خلال تغيير دينامية لبرنامجهم التعبير الجيني. في السنوات الأخيرة، تطورا هائلا للمنهجيات على نطاق الجينوم يسمح الوصف الدقيق والشامل للتغييرات الترنسكربيتوم في ظروف مختلفة. في معظم الدراسات ترانسكريبتوميك، تستخدم تسلسل ميكرواري التهجين أو الفائق لقياس مستويات الحمض النووي الريبي من كسر الجيش الملكي النيبالي مجموع حالة مستقرة. يمكن عرض التغييرات النسخي تحت اضطراب محددة طائفة واسعة من النتائج المحتملة، مع تغييرات التعبير جين معين أو طائفة كبيرة من الجينات حتى-أو دوونريجولاتيد. التعبير الجيني هو نتيجة لتوازن صقل — أو الحالة المستقرة – بين العمليات الأخرى التي تؤثر على مستويات الحمض النووي الريبي وتوليف الحمض النووي الريبي بالحمض النووي الريبي [بولمرس]. رنا بوليميراز الثاني النسخ، بما في ذلك على ثلاث مراحل متميزة (استهلال واستطالة والإنهاء)، يرتبط ومعقد للغاية مع تجهيز مرناً وتصدير هيولى، والترجمة، وتدهور.

عدة دراسات أجريت مؤخرا أظهرت أن توليف مرناس والانحلال إلى جانب الآليات وأظهرت أنه يمكن إغفال النسخي آثار الطفرة أو تحت المحفزات عند التحديد الكمي لمجموع الحالة المستقرة الجيش الملكي النيبالي. أولاً، الكشف عن التغيرات النسخي من خلال تحليل مستويات مستقرة مرناً دائماً يعتمد على عمر مرناس. متى يتم عرض اضطراب، مستويات مستقرة مرناس مع نصف حياة طويلة سوف تتأثر أقل بكثير من تلك التي مرناس مع نصف حياة قصيرة. ولذلك، إمكانية الكشف عن التغييرات في توليف الحمض النووي الريبي هو بقوة منحازة لصالح النصوص لم تدم طويلاً، في حين قد يفشل تحليل أطول عمرا من الأنواع مرناً للكشف عن التغيرات الدينامية في معدل النسخ. ثانيا، أظهرت عدة تقارير، كل من الخميرة والثدييات، قد تجاهل التغيرات العالمية في النسخ عند تحليل مستويات الحالة المستقرة مرناً. ومن المرجح بسبب الآليات التي تربط بين التوليف مرناً وتدهور الناتج في التخزين المؤقت مرناً. وهذا دفع تطوير بروتوكولات جديدة التحديد الكمي لتوليف مرناً فصل من تدهور، ومن خلال تحليل مرناً يدون حديثا. في السنوات الأخيرة، تم تقديم العديد من البدائل، بما في ذلك تسلسل التحضير العالمية (غرو-seq)1، ونسخة أصلية استطالة التسلسل (صافي-seq)2،3. نحن هنا، تقديم بروتوكول وضعت في البداية في خلايا الثدييات4،،من56 وتكييفها مع الخميرة7،،من89،10، ثم 11، الذي يرتكز على الحمض النووي الريبي وسم مع نوكليوزيد ثيولاتيد أو قاعدة تمثيلية، 4-ثيوريديني (4sU) أو 4-ثيوراسيل (4tU)، على التوالي.

هذا الأسلوب على وجه التحديد ينقي رنا يدون حديثا من الخلايا في الحمض النووي الريبي التي هي نبض المسمى مع 4sU مع تقريبا أي تدخل في التوازن الخلية. ومن ثم، عندما تتعرض الخلايا ل 4sU، الجزيء سرعة أوبتاكين، فوسفوريلاتيد إلى 4sU-ثلاثي الفوسفات، وأدرج في الكشف يتم نسخها. بمجرد تعديل نبض المسمى، فمن الممكن لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي الخلوية (المقابلة لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي)، وفيما بعد، كسر الجيش الملكي النيبالي المسمى 4sU ثيول-على وجه التحديد، مما يؤدي إلى تشكيل رابطة ثنائي كبريتيد بين البيوتين الجيش الملكي النيبالي يدون حديثا4،5. ومع ذلك، لا يمكن 4sU أوبتاكين خلايا معربا عن نوكليوزيد الناقل، مثل الناقل نوكليوزيد اكويليبراتيفي البشرية (hENT1)، منع استخدامها الفوري في مهدها أو انشطار الخميرة. بينما واحدة يمكن التعبير عن hENT1 في بومبي س. أو . س. سيريفيسيا، نهج أسهل يمكن تحقيقه باستخدام 4tU القاعدة المعدلة، حيث يمكن أن يستغرق خلايا الخميرة 4tU، دون الحاجة إلى التعبير عن الناقل نوكليوزيد10، 11 , 12 , 13-وفي الواقع، يتطلب أيض 4tU نشاط فوسفوريبوسيلترانسفيريز اليوراسيل إنزيم (أوبرت). في الكائنات الحية عدة، بما في ذلك الخميرة ولكن ليس من الثدييات، أوبرت أمر ضروري لمسار إنقاذ بيريميدين، إعادة تدوير اليوراسيل لاردين الأدينوزين.

ويمكن إدخال انحياز هاما في الدراسات ترانسكريبتوميك بالتطبيع بين العينات المختلفة التي تم تحليلها بالتوازي. وفي الواقع، يمكن أن تؤثر على العديد من العوامل ينحرف التحليل المقارن الترنسكربيتوم المسخ والسلالات البرية من نوع: كفاءة تحلل الخلية، الاختلافات في الاستخراج، والانتعاش من الجيش الملكي النيبالي، والفروق في معايرة الماسح الضوئي لتحليلات ميكرواري ، بين أمور أخرى. كما نوقش أعلاه، يمكن أن مثل هذه الاختلافات مضللة لا سيما عندما يتوقع الآثار العالمية على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. تم تصميم وسيلة أنيقة لدقة مقارنة معدلات التوليف مرناً بين العينات المختلفة باستخدام الخميرة الأنشطار بعيد يتصل بومبي شيزوساكتشاروميسيس كمعيار داخلية. لذلك، يسمى عدد ثابت من بومبي س. يتم إضافة خلايا إلى أن العينات S. cerevisiae والخلايا البرية من نوع أو متحولة، قبل تحلل الخلية والحمض النووي الريبي استخراج10. وفي وقت لاحق، كمياً الكشف حالة ثابتة والمركبة حديثا من بومبي س. و . س. سيريفيسيا أما بواسطة RT-قبكر أو عن طريق استخدام رقائق ميكرواري أو التسلسل الفائق10. الجمع بين هذه البيانات مع النمذجة الحركية، ويمكن قياس المعدلات المطلقة لتوليف مرناً والاضمحلال في مهدها الخميرة.

في إطار هذه المخطوطة، سنوضح كيفية السماح تحليل للحمض النووي الريبي يدون حديثا للكشف عن دور عالمي لمجمعات كواكتيفاتور الملحمة وتفييد في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في مهدها الخميرة1514،، 16. الأهم من ذلك، تحدد مستويات مرناً مستقرة في S. cerevisiae الدراسات السابقة واقترح أن الملحمة يلعب دالة الغالبة على مجموعة محدودة من جينات الخميرة التي تتأثر بشدة بالطفرات في الملحمة ولكن مقاومة نسبيا تفييد الطفرات17،،من1819. من المستغرب، عرضت الأنشطة الانزيمية الملحمة العمل بشأن الجينوم كله يدون، مما يشير إلى دور أوسع لهذا المنشط المشارك في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ. وقد لوحظ تناقص الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني التعيين في الجينات أعرب معظم لدى المنظمة من الملحمة أو تفييد، مما يوحي بأن هذه كواكتيفاتورس العمل معا في معظم الجينات. ومن ثم، التحديد الكمي مرناً يدون حديثا كشفت أن الملحمة وتفيد المطلوبة للنسخ لما يقرب من جميع الجينات بالحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني14،،من1516. تنفيذ آليات تعويضية لتبرز بوصفها وسيلة للخلايا للتعامل مع انخفاض عالمي في توليف مرناً التي يتم تخزينها مؤقتاً نقصان عالمية متزامنة في تدهور مرناً. الملحمة ويضيف إلى قائمة العوامل وجود تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ، مثل الحمض النووي الريبي بول الثاني مفارز10، مجمع كواكتيفاتور20الوسيط، العام النسخ عامل تفييه21،22 ، والعناصر غير مباشر، مرناً تدهور الآلية9،10،23. مثل هذه الأحداث التعويضية لوحظت عالمياً في ساغا المسوخ، والمحاسبة للتغييرات المتواضعة والمحدودة في مستويات مرناً مستقرة رغم انخفاض عالمي وشديدة في توليف مرناً14. كما أجريت التحاليل مماثلة في سلالة حذف BRE1 ، أدى إلى خسارة كاملة من هستون H2B أوبيكويتينيشن. من المثير للاهتمام، يمكن الكشف عن كثير أكثر اعتدالا ولكن يتفق تأثير عالمي على الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النسخ في غياب Bre1، مشيراً إلى أن وسم الأيضية للجيش الملكي النيبالي يدون حديثا في الخميرة يمكن الكشف والتحديد الكمي لمجموعة واسعة من التغييرات في مرناً معدلات التوليف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-خلية استزراع ونضوب ربمسن وحدة فرعية للملحمة

  1. لكل سلالة S. cerevisiae وتكرار، بما في ذلك نوع البرية أو سلالات التحكم، تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة جديدة إلى 5 مل من YPD المتوسطة (2% ببتون واستخراج الخميرة 1% والجلوكوز 2%).
  2. تنمو خلايا S. cerevisiae بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  3. قياس الكثافة البصرية 600 نانومتر (OD600) وتمييع ثقافة التطوير التنظيمي600 حوالي 0.1 في 100 مل من متوسطة YPD والسماح لها بالنمو حتى OD600 حوالي 0.8.
  4. في موازاة ذلك، تطعيم مستعمرة واحدة من الخلايا بومبي س من لوحة جديدة إلى 50 مل متوسطة نعم (استخراج الخميرة 0.5%؛ 250 مغ/لتر الأدنين، الحامض الأميني، اليوراسيل، leucine، ويسين؛ الجلوكوز 3%) وتنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  5. قياس OD600 الثقافة بين عشية وضحاها بومبي س. وتمييع ثقافة التطوير التنظيمي600 حوالي 0.1 في 500 مل من المتوسطة نعم وتركها تنمو حتى OD600 حوالي 0.8.
  6. لكل سلالة المرساة بعيداً S. cerevisiae وتكرار، بما في ذلك نوع البرية أو سلالات التحكم، تطعيم مستعمرة واحدة من لوحة جديدة إلى 5 مل من YPD المتوسطة (2% ببتون واستخراج الخميرة 1% والجلوكوز 2%).
  7. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر (150 لفة في الدقيقة).
  8. في صباح اليوم التالي، قياس OD600وتمييع الثقافة إلى OD600 حوالي 0.1 في 100 مل من YPD المتوسطة والسماح لها بالنمو حتى OD600≈ 0.8.
  9. إضافة 100 ميليلتر من ربمسن إلى الثقافة من حل أسهم 1 ملغ/مل (تركيز ربمسن النهائي 1 ميكروغرام/مل) وترك الخلايا احتضان عند 30 درجة مئوية مع التحريض المستمر للوقت اللازم للبروتين من المصلحة أن تستنفد شرطيا من (نواة 30 دقيقة عادة كافية). لعنصر التحكم، استخدم ثقافة خميرة مشابهة، ولكن بدلاً من إضافة ربمسن، إضافة ما يعادل حجم ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).

2-4tU وسم مع بومبي س. كسبايك (العد)

  1. إعداد حل م 2 4-ثيوراسيل طازجة. وبمجرد إعداد، يبقيه في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء.
    1. دقة تزن 64.1 ملغ 4-ثيوراسيل لكل ثقافة S. cerevisiae وحله في 250 ميليلتر من dimethylformamide (DMF) أو في 250 ميليلتر من [دمس].
    2. لثقافة بومبي س. لاستخدامها كارتفاع في وزن 320.5 ملغ 4-ثيوراسيل وحله في 1,250 ميليلتر من [دمس].
  2. إضافة الحل 4-ثيوراسيل للثقافات S. cerevisiae و بومبي س. لتركيز نهائي من 5 مم واحتضانها لهم لمدة 6 دقائق مع التحريض المستمر على 30 درجة مئوية و 32 درجة مئوية، على التوالي.
  3. بعد 6 دقائق، إزالة قاسمة صغيرة كل ثقافة لخلية العد. عد الخلايا باستخدام عداد تلقائي خلية أو دائرة نويباور.
  4. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي (س 2,500 ز) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل المادة طافية، وتغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني x 1 المثلج، ومرة أخرى للطرد المركزي (س 2,500 ز، 4 درجة مئوية، مدة 5 دقائق).
  6. حساب إجمالي عدد الخلايا في كل من العينات S. cerevisiae و بومبي س .
  7. ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني x 1 المثلج وتخلط S. cerevisiae مع خلايا بومبي س. بنسبة 3:1.
  8. الطرد المركزي الخلايا (2,500 س ز، 4 درجة مئوية، 5 دقيقة) وإزالة برنامج تلفزيوني وفلاش-تجميد الخلايا في السائل ن2وتخزين العينة في-80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.

3. رنا الاستخراج والمعالجة الدناز

  1. ذوبان الجليد الخلايا على الجليد لما يقرب من 20-30 دقيقة.
  2. المضي قدما في استخراج الحمض النووي الريبي استخدام مجموعة أدوات استخراج خميرة-الحمض النووي الريبي (جدول المواد) مع بعض التعديلات.
  3. كل كل عينة، صب ميليلتر 750 من المثلج الزركونيا الخرز في أنبوب 1.5 مل ملولبة المتوفرة مع هذه المجموعة. ضع في اعتبارك أن كل كل أنبوب، والجيش الملكي النيبالي من 10 إلى9 خلايا يمكن كفاءة استخراج. ومن ثم، إعداد عدد الأنابيب اللازمة لكل عينة. على سبيل المثال، يمكن أن تجعل ثقافة S. cerevisiae 100 مل (OD600≈ 0.8) حوالي 2 × 109 إلى 3 × 109 خلايا، المؤدية إلى ما مجموعة 2.7 × 109 4 × 109 خلايا في المجموع (بعد تصاعد في ثلث بومبي س. الخلايا). وفي هذه الحالة، سيلزم ما يصل إلى 3-4 رد فعل أنابيب لكل عينة/شرط/المسخ/تكرار.
  4. الواحدة كل الخلايا 1 × 109 ، إضافة ميليلتر 480 تحلل المخزن المؤقت المقدمة مع عدة وميليلتر 48 من الحزب الديمقراطي الصربي 10% ميليلتر 480 من الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1، v/v/v).
  5. مزيج الخلايا باستخدام خلاط دوامة ونقلها بالأنابيب التي تحتوي على حبات الزركونيا المثلج.
  6. استيعاب هذه الأنابيب على محول خلاط دوامة وإيقاف دوامة بأقصى سرعة ممكنة، وفاز لدقيقة 10 خلايا الخميرة (في غرفة في 4 درجات مئوية). بدلاً من ذلك، إجراء تحلل الخلايا في الخافق أحد حبة تلقائي.
  7. الطرد المركزي أنابيب في 16,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وجمع بعناية في المرحلة العليا (المرحلة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) إلى أنبوب صقر طازجة 15 مل. عادة ما يكون حجم استرداد كل كل أنبوبة حول 500-600 ميليلتر.
  8. للأنابيب 15 مل يحتوي على الجيش الملكي النيبالي المنقي جزئيا، إضافة ربط المخزن المؤقت المقدمة مع كيت ومزيج دقيق. لكل 100 ميليلتر من حل الجيش الملكي النيبالي، إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم (أيعندما يكون حجم الحل مائي المرحلة 600 ميليلتر، مل 2.1 من المخزن المؤقت ملزم ينبغي إضافة).
  9. إلى الخليط السابق، إضافة الإيثانول 100% ومزيج دقيق. لكل 100 ميليلتر من حل الجيش الملكي النيبالي، إضافة 235 ميليلتر من الإيثانول 100 ٪ (أيعندما يكون حجم الحل مائي المرحلة 600 ميليلتر، أضف 1.41 مل إيثانول).
  10. تطبيق ميليلتر يصل إلى 700 من الخليط من الخطوة 3، 9 إلى خرطوشة تصفية تجميعها في أنبوب جمع، سواء قدمت مع عدة.
  11. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 16,000 ز. إذا كانت مدة الطرد المركزي لم يكن كافياً للحجم الإجمالي لتمريرها من خلال المرشح، كرر الطرد المركزي لمدة 30 ثانية.
  12. تجاهل-التدفق عبر وإعادة استخدام أنبوب جمع نفسه. إضافة آخر ميليلتر 700 الحل الإيثانول المخزن المؤقت ملزم الحمض النووي الريبي للتصفية والطرد المركزي مرة أخرى في 16,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
  13. تجاهل في التدفق من خلال وكرر الخطوتين 3.11 و 3.12 حتى يتم الانتهاء من حل الجيش الملكي النيبالي.
  14. يجب غسل الفلتر 2 x مع 700 ميليلتر للغسيل الحل 1. جمع الحل الغسيل عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة وتبقى دائماً على أنبوب جمع.
  15. يجب غسل الفلتر 2 x مع 500 ميليلتر للغسيل الحل 2. جمع الحل الغسيل عن طريق استخدام الطرد المركزي في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة وتبقى دائماً على أنبوب جمع.
  16. الطرد المركزي هذه الأنابيب مرة أخرى في س 16,000 ز لمدة 1 دقيقة ليجف تماما عامل التصفية.
  17. نقل الخرطوشة تصفية إلى أنبوب جمع النهائي (أنبوب المناسبة للحمض النووي الريبي) والوت الجيش الملكي النيبالي مع 50 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2س (يسخن إلى 100 درجة مئوية).
  18. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في س 16,000 ز.
  19. الوت رنا مرة أخرى (للأنبوب نفسه) مع 50 ميليلتر مسخن تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2o. تأكد من أن كل وحدة التخزين قد مرت من خلال عامل التصفية؛ خلاف ذلك، أجهزة الطرد المركزي لفترات أطول.
  20. إذا كان يتم استخدام أنابيب متعددة لنموذج واحد واحد، تجمع لهم جميعا في أنبوب واحد.
  21. قياس وفحص نقاء العينة باستخدام المعدات المناسبة.
    ملاحظة: في حين أدرج 4tU فقط داخل المركبة حديثا الجيش الملكي النيبالي، هناك فرصة التلوث طفيفة مع الحمض النووي. ولهذا السبب، فمن المستحسن لعلاج العينات مع الدناز دائماً أنا. لذلك، استخدام الكواشف قدمت مع مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي (جدول المواد) عقب توصيات الشركة المصنعة.

4-بيوتينيليشن ثيول محددة من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا

  1. ضبط تركيز الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها بالمادة 3 من البروتوكول إلى 2 ملغ/مل. الكوة ميكروغرام 200 من مجموع الجيش الملكي النيبالي، الحرارة عليه لمدة 10 دقائق عند 60 درجة مئوية، والبرد فورا على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إلى قاسمة الجيش الملكي النيبالي، إضافة الكواشف المذكورة أدناه بالترتيب التالي: 600 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح2س، 100 ميليلتر من المخزن المؤقت بيوتينيليشن (100 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5] ومم يدتا، في معاملة ديبك 10، خالية من رناسي ح2س)، و 200 ميليلتر من البيوتين-هبدب من مخزون من 1 ملغ/مل البيوتين-هبدب في [دمس] أو DMF.
    1. وفي بعض الحالات، يميل الحل البيوتين-هبدب يعجل، يرجح أن سبب في انخفاض معدلي الذوبان في الماء. في هذه الحالة، زيادة الحجم [دمس]/DMF تصل إلى 40% حجم رد فعل (لعينات الحمض النووي الريبي، إضافة 400 ميليلتر من تعامل ديبك ح2س، 100 ميليلتر من المخزن المؤقت بيوتينيليشن، و 400 ميليلتر من البيوتين-هبدب من مخزون 0.5 ملغ/مل).
  3. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة ومحمية من الضوء ح 3، مع التحريض لطيف.
  4. بعد التفريخ، إضافة وحدة تخزين متساوية تقريبا من كلوروفورم للأنابيب والمزيج بقوة.
  5. تدور العينة في س 13,000 ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية. تسمح هذه الخطوة إزالة البيوتين الزائدة التي لم لا بيوتينيلاتي الجيش الملكي النيبالي. وبدلاً من ذلك، القيام بهذه الخطوة باستخدام أنابيب قفل المرحلة (الثقيلة). لذلك، تدور إلى أسفل الأنابيب قفل المرحلة لمدة 1 دقيقة في س 13,000 ز، إضافة خليط الحمض النووي الريبي ومبلغ مساو من كلوروفورم، مزجها بشدة، والطرد المركزي لهم في س 13,000 ز لمدة 5 دقائق، عند 4 درجة مئوية.
  6. نقل بعناية في المرحلة العليا في أنابيب 2 مل جديدة.
  7. إضافة عشر حجم 5 م كلوريد الصوديوم وتخلط العينة.
  8. إضافة وحدة تخزين متساوية من الايزوبروبانول وخلط العينة جيدا، وأنها تدور في س 13,000 ز مدة 30 دقيقة على الأقل، في 4 درجات مئوية.
  9. حذر إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من المثلج 75% إيثانول.
  10. تدور في 13,000 س ز لمدة 10 دقيقة، في 4 درجات مئوية.
  11. بعناية قم بإزالة المادة طافية، سريعة-تدور الأنبوب، والحل الإيثانول المتبقية. تأكد من أن بيليه الحمض النووي الريبي لا جاف.
  12. تعليق الجيش الملكي النيبالي في 100 ميليلتر ح يعامل ديبك، خالية من رناسي2o.

5-تنقية الكسر المركب حديثا من الجيش الملكي النيبالي إجمالي وغير مسمى استخدام الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين

  1. الحرارة بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية والبرد ثم العينات على الجليد لمدة 5 دقائق.
  2. إضافة 100 ميليلتر من حبات مغناطيسية المغلفة ستريبتافيدين إلى بيوتينيلاتيد الحمض النووي الريبي (في وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر). على وجه التحديد، من المستحسن استخدام الخرز المشار إليها في الجدول للمواد، منذ ذلك الحين، بعد محادثات مع غيرها من المختبرات، هذه يبدو أن تكون متسقة وموثوق بها.
  3. احتضان العينة مع اهتزاز طفيف لمدة 90 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
  4. ضع الأعمدة المقدمة مع kit (جدول المواد) في موقف المغناطيسية.
  5. إضافة 900 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة العازلة الغسيل (100 ملم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، يدتا ملم 10, 1 "م كلوريد الصوديوم"، و 0.1% 20 توين، في معاملة ديبك، خالية من رناسي ح2س) إلى الأعمدة (قبل تشغيل وحجته).
  6. تطبيق مزيج الخرز/الحمض النووي الريبي (200 ميليلتر) إلى الأعمدة.
  7. جمع خلال التدفق في أنابيب 1.5 مل وتطبيقه مرة أخرى إلى نفس العمود المغناطيسية. إذا لزم الأمر، يبقى هذا التدفق من خلال كما أنه يمثل الكسر الحمض النووي الريبي غير مسمى.
  8. غسل الأعمدة 5 x مع زيادة حجم الغسيل المخزن المؤقت (600، 700، 800، 900، و 1,000 ميليلتر).
  9. الوت الجيش الملكي النيبالي المركبة حديثا مع 200 ميليلتر من 0.1 م DTT.
  10. أداء ثاني شطف، 3 دقيقة في وقت لاحق، مع زيادة في حجم تساوي 0.1 م DTT.
  11. بعد التينج الجيش الملكي النيبالي، إضافة مجلدات 0.1 من 3 م نواك (pH 5.2)، 3 مجلدات من المثلج 100 ٪ الإيثانول، و 2 ميليلتر من 20 ملغ/مل الجليكوجين (الجيش الملكي النيبالي-الصف) والسماح الحمض النووي الريبي متعجل بين عشية وضحاها، في-20 درجة مئوية.
  12. استرداد الجيش الملكي النيبالي بالطرد المركزي (13,000 س ز لمدة 10 دقيقة، عند 4 درجة مئوية) وريسوسبيند أنه في 15 ميليلتر من تعامل ديبك، خالية من رناسي ح20. نسبة الحمض النووي الريبي المسمى بالمجموع المتوقع أن حوالي 2%-4% (عادة ما تكون أكثر نحو النهاية السفلي)، تقديم حوالي 2.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي المركبة حديثا. هذه الكمية ما يكفي للقيام بتجارب qPCR عديدة، فضلا عن تحليلات ميكرواري/التسلسل.

6--الرايت قبكر التحقق كسور مختلفة

  1. توليف كدنا من 2 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الريبي أو 10 ميليلتر من الحمض النووي الريبي المسمى باستخدام هيكساميرس عشوائي والمنتسخه العكسية للاختيار، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (جدول المواد).
  2. تضخيم كدنا في طريق قبكر في الوقت الحقيقي باستخدام بروتوكول قياسي (جدول المواد).
    ملاحظة: يجب تشغيل جميع العينات في ثلاث نسخ من الحد أدنى من اثنان replicates البيولوجية. تصحيح جميع القيم الخام للتعبير عن بومبي س. توبولين.

7-ميكرواري التهجين

  1. هجن عينات الحمض النووي الريبي على رقائق ميكرواري المفضل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة (لهذا البروتوكول محددة، راجع الجدول للمواد). بإيجاز، إعداد بيوتينيلاتيد أهداف كرنا من 150 نانوغرام من الجيش الملكي النيبالي باستخدام "مجموعة تضخيم الحمض النووي الريبي رئيس الوزراء" (جدول المواد)، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. هجن 4 ملغ كرناس مجزأة ح 16 عند 45 درجة مئوية وفي الدقيقة 60 على رقائق ميكرواري.
  2. أغسل ووصمة عار، وتفحص الرقائق باستخدام محطة المشار إليها والماسح الضوئي (جدول المواد). استخراج البيانات الخام (CEL كثافة الملفات) من الصور الممسوحة ضوئياً باستخدام وحدة التحكم بالأوامر (دول التعاون الخليجي العربي، الإصدار 4.1.2).
  3. كذلك معالجة الملفات CEL مع "وحدة التعبير" البرمجيات الإصدار 1.4.1 لحساب التحقيق تعيين كثافة إشارة، استخدام خوارزميات تستند إلى إحصاءات ماس 5.0 مع الإعدادات الافتراضية والتوسع العالمي كأسلوب التطبيع.
    ملاحظة: تم تعيين كثافة المشذبة الهدف يعني كل شريحة تعسفاً إلى 100. القيام بجميع تجارب استخدام replicates البيولوجي المستقلة اثنين على الأقل. تطبيع البيانات الخام إلى إشارة بومبي س. وحساب إضعاف التغييرات في مستويات الحمض النووي الريبي الكلي والمركب حديثا.

8-بيانات التحليل باستخدام خط أنابيب R الموجودة

  1. حساب التوليف وتسوس معدلات استخدام خط الأنابيب وحزمة R/بيوكوندوكتور متاحة للجمهور، كما هو موضح سابقا8،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عند تنفيذ العلامات الاستقلابية من الحمض النووي الريبي يدون حديثا، جوانب عديدة تحتاج إلى مراقبة: الوقت والكفاءة للعلامات، وارتفاع في النسبة، بروتوكول الاستخراج، وفعالية بيوتينيليشن (بما في ذلك الإشارات إلى الضجيج نسبة)، من بين أمور أخرى. هذه الشروط على نطاق واسع ومنهجي أظهرت آخرون7،،من1011. ونحن هنا تركز أساسا على تفسير والتحليلات الفورية التي يمكن أن يؤديها مرة واحدة تم تجهيز العينات، أما بواسطة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في حين لا تزال هي تحسين الأدوات على نطاق الجينوم لتحليل التغيرات في النسخ، التحليل الوحيد من الترنسكربيتوم عن طريق التحديد الكمي لمستويات مستقرة من الحمض النووي الريبي قد لا تعكس التغييرات في الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني النشاط. وفي الواقع، ينظم مستويات مرناً ليس فقط بتوليف الحمض النووي الريبي ولكن أيضا بنضج وتدهور. لقياس توليف مرناً فصل من تدهور مرناً، وضعت بروتوكولات متميزة في السنوات الأخيرة لتحليل النسخ الوليدة في الخميرة والثدييات.

أحد البروتوكولات الأكثر استعمالا للتحديد الكمي لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر لازلو طرة على دعمه وخامساً فيشر وشوماخر ك. ف. ش سافين لمناقشاتهم. وأيده يد زمالة ماري كوري-أي تي (بيتن-GA-2013-606806، NR-نت) و "مؤسسة قوس". وأيد هذا العمل الأموال من الوكالة الوطنية للبحث (ANR-15-CE11-0022 SAGA2). وأيد هذه الدراسة أيضا ANR-10-لابكس-0030-إينرت، صندوق الدولة الفرنسية تديره الوكالة الوطنية للبحث تحت دعفينير يشرف البرنامج الإطار ANR-10-معرض أيدكس-0002-02.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
4-ThiouracilSigma-AldrichCat # 440736
RapamycinEuromedexCat # SYN-1185
Countess II FL عداد الخلايا الآليThermoFisherN / A
RiboPure طقم تنقية الحمض النووي الريبي ، الخميرةThermoFisherCat # AM1926
NanoDrop 2000 مقياس الطيفThermoFisherND-2000
طقم TURBO الخالي من الحمض النوويThermoFisherAM1907
EZ-Link HPDP BiotinThermoFisherCat # 21341
ThiolutinAbcamab143556
µ ؛ طقم MACS StreptavidinMiltenyi BiotecCat # 130-074-101
Transcriptor Reverse TranscriptaseRoche03 531 295 001
SYBR Green I MasterRoche4707516001
GeneChip Geast Genome 2.0ThermoFisher900555
GeneChip Fluidics Station 450ThermoFisher00-0079
GeneChip ماسح ضوئي 3000 7GThermoFisher00-0210
الضوئي

المراجع

  1. Gardini, A. Global Run-On Sequencing (GRO-Seq). Methods in Molecular Biology. 1468, 111-120 (2017).
  2. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Nascent transcript sequencing visualizes transcription at nucleotide resolution. Nature. 469 (7330), 368-373 (2011).
  3. Churchman, L. S., Weissman, J. S. Native elongating transcript sequencing (NET-seq). Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 4 Unit 4 11-17 (2012).
  4. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23 (2), 232-237 (2005).
  5. Dolken, L., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14 (9), 1959-1972 (2008).
  6. Kenzelmann, M., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (15), 6164-6169 (2007).
  7. Radle, B., et al. Metabolic labeling of newly transcribed RNA for high resolution gene expression profiling of RNA synthesis, processing and decay in cell culture. Journal of Visualized Experiments. (78), e50195(2013).
  8. Schwalb, B., et al. Measurement of genome-wide RNA synthesis and decay rates with Dynamic Transcriptome Analysis (DTA). Bioinformatics. 28 (6), 884-885 (2012).
  9. Sun, M., et al. Global analysis of eukaryotic mRNA degradation reveals Xrn1-dependent buffering of transcript levels. Molecular Cell. 52 (1), 52-62 (2013).
  10. Sun, M., et al. Comparative dynamic transcriptome analysis (cDTA) reveals mutual feedback between mRNA synthesis and degradation. Genome Research. 22 (7), 1350-1359 (2012).
  11. Miller, C., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Molecular Systems Biology. 7, 458(2011).
  12. Munchel, S. E., Shultzaberger, R. K., Takizawa, N., Weis, K. Dynamic profiling of mRNA turnover reveals gene-specific and system-wide regulation of mRNA decay. Molecular Biology of the Cell. 22 (15), 2787-2795 (2011).
  13. Eser, P., et al. Determinants of RNA metabolism in the Schizosaccharomyces pombe genome. Molecular Systems Biology. 12 (2), 857(2016).
  14. Baptista, T., et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription. Molecular Cell. 68 (1), 130-143 (2017).
  15. Bonnet, J., et al. The SAGA coactivator complex acts on the whole transcribed genome and is required for RNA polymerase II transcription. Genes & Development. 28 (18), 1999-2012 (2014).
  16. Warfield, L., et al. Transcription of Nearly All Yeast RNA Polymerase II-Transcribed Genes Is Dependent on Transcription Factor TFIID. Molecular Cell. 68 (1), 118-129 (2017).
  17. Huisinga, K. L., Pugh, B. F. A genome-wide housekeeping role for TFIID and a highly regulated stress-related role for SAGA in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 13 (4), 573-585 (2004).
  18. Lee, T. I., et al. Redundant roles for the TFIID and SAGA complexes in global transcription. Nature. 405 (6787), 701-704 (2000).
  19. Lenstra, T. L., et al. The specificity and topology of chromatin interaction pathways in yeast. Molecular Cell. 42 (4), 536-549 (2011).
  20. Plaschka, C., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Mediator core initiation complex. Nature. 518 (7539), 376-380 (2015).
  21. Helenius, K., et al. Requirement of TFIIH kinase subunit Mat1 for RNA Pol II C-terminal domain Ser5 phosphorylation, transcription and mRNA turnover. Nucleic Acids Research. 39 (12), 5025-5035 (2011).
  22. Rodriguez-Molina, J. B., Tseng, S. C., Simonett, S. P., Taunton, J., Ansari, A. Z. Engineered Covalent Inactivation of TFIIH-Kinase Reveals an Elongation Checkpoint and Results in Widespread mRNA Stabilization. Molecular Cell. 63 (3), 433-444 (2016).
  23. Haimovich, G., et al. Gene expression is circular: factors for mRNA degradation also foster mRNA synthesis. Cell. 153 (5), 1000-1011 (2013).
  24. Haruki, H., Nishikawa, J., Laemmli, U. K. The anchor-away technique: rapid, conditional establishment of yeast mutant phenotypes. Molecular Cell. 31 (6), 925-932 (2008).
  25. Neymotin, B., Athanasiadou, R., Gresham, D. Determination of in vivo RNA kinetics using RATE-seq. RNA. 20 (10), 1645-1652 (2014).
  26. Shetty, A., et al. Spt5 Plays Vital Roles in the Control of Sense and Antisense Transcription Elongation. Molecular Cell. 66 (1), 77-88 (2017).
  27. Xu, Y., et al. Architecture of the RNA polymerase II-Paf1C-TFIIS transcription elongation complex. Nature Communications. 8, 15741(2017).
  28. Adelman, K., Lis, J. T. Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans. Nature Reviews. Genetics. 13 (10), 720-731 (2012).
  29. Nojima, T., Gomes, T., Carmo-Fonseca, M., Proudfoot, N. J. Mammalian NET-seq analysis defines nascent RNA profiles and associated RNA processing genome-wide. Nature Protocols. 11 (3), 413-428 (2016).
  30. Storvall, H., Ramskold, D., Sandberg, R. Efficient and comprehensive representation of uniqueness for next-generation sequencing by minimum unique length analyses. PloS One. 8 (1), 53822(2013).
  31. Tani, H., et al. Identification of hundreds of novel UPF1 target transcripts by direct determination of whole transcriptome stability. RNA Biology. 9 (11), 1370-1379 (2012).
  32. Tani, H., et al. Genome-wide determination of RNA stability reveals hundreds of short-lived noncoding transcripts in mammals. Genome Research. 22 (5), 947-956 (2012).
  33. Jao, C. Y., Salic, A. Exploring RNA transcription and turnover in vivo. by using click chemistry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15779-15784 (2008).
  34. Palozola, K. C., et al. Mitotic transcription and waves of gene reactivation during mitotic exit. Science. 358 (6359), 119-122 (2017).
  35. Ardehali, M. B., et al. Polycomb Repressive Complex 2 Methylates Elongin A to Regulate Transcription. Molecular Cell. 68 (5), 872-884 (2017).
  36. Schulz, D., et al. Transcriptome surveillance by selective termination of noncoding RNA synthesis. Cell. 155 (5), 1075-1087 (2013).
  37. Barrass, J. D., et al. Transcriptome-wide RNA processing kinetics revealed using extremely short 4tU labeling. Genome Biology. 16, 282(2015).
  38. Duffy, E. E., et al. Tracking Distinct RNA Populations Using Efficient and Reversible Covalent Chemistry. Molecular Cell. 59 (5), 858-866 (2015).
  39. Rutkowski, A. J., Dolken, L. High-Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing, and Decay by Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA Using 4-Thiouridine. Methods in Molecular Biology. 1507, 129-140 (2017).
  40. Darzacq, X., et al. In vivo dynamics of RNA polymerase II transcription. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (9), 796-806 (2007).
  41. Fuchs, G., et al. Simultaneous measurement of genome-wide transcription elongation speeds and rates of RNA polymerase II transition into active elongation with 4sUDRB-seq. Nature Protocols. 10 (4), 605-618 (2015).
  42. Singh, J., Padgett, R. A. Rates of in situ transcription and splicing in large human genes. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (11), 1128-1133 (2009).
  43. Schwalb, B., et al. TT-seq maps the human transient transcriptome. Science. 352 (6290), 1225-1228 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

mRNA Schizosaccharomyces pombe RNA RT qPCR
Saccharomyces cerevisiae الأيضية وسم مع 4-ثيوراسيل والتحديد الكمي حديثا توليفها مرناً كوكيل للنشاط الثاني رنا بوليميراز
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.