يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
خلايا الغدد الصماء البنكرياس، التي تتجمع في الجزر الصغيرة، تنظيم استقرار الجلوكوز في الدم والايض الطاقة. تختلف أنواع الخلايا متميزة في الجزر الصغيرة، بما في ذلك إفراز الأنسولين خلايا بيتا، من أجداد الغدد الصماء شيوعاً أثناء المرحلة الجنينية. توسيع عن طريق انتشار الخلايا غير ناضجة من خلايا الغدد الصماء وتنضج خلال فترة إنمائية طويلة بعد الولادة. ومع ذلك، أن الآليات الكامنة وراء هذه العمليات غير محددة بوضوح. خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي نهجاً واعداً لتوصيف السكان خلية متميزة وتتبع الخلية النسب تمايز المسارات. هنا، يمكننا وصف أسلوب للجيش الملكي النيبالي-تسلسل خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس معزولة في البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة.
المقدمة
البنكرياس جهاز الأيض حيوي في الثدييات. يتكون البنكرياس من المقصورات، وافرازات الغدد الصماء. خلايا الغدد الصماء البنكرياس، بما في ذلك خلايا بيتا المنتجة للأنسولين وإنتاج الجلوكاجون خلايا α، المجموعة معا في جزر لانجرهانز وكورديناتيلي تنظيم التوازن الجلوكوز الجهازية. ويؤدي الخلل في خلايا الغدد الصماء مرض البول السكري، الذي أصبح مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم.
يتم اشتقاق خلايا الغدد الصماء في البنكرياس من Ngn3+ فروعه خلال embryogenesis1. في وقت لاحق، خلال فترة ما حول الولادة، تتكاثر خلايا الغدد الصماء بشكل غير ناضجة الجزر الصغيرة. هذه الخلايا غير ناضجة مواصلة تطوير وتدريجيا تصبح جزيرات الناضجة، ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بكين.
1-البنكرياس العزلة
-
للأجنة E17.5 (17.5 يوما الجنينية):
- ويقدر اليوم الجنينية 0.5 استناداً إلى النقطة الزمنية عندما يظهر المكونات المهبلية.
- التضحية الفئران الحوامل بالإدارة2 CO. رش الفراء البطن مع الكحول 70%.
- جعل شق على شكل V مع مقص من توسيع المنطقة التناسلية للاضلاع. سيتم فتح هذه العملية تماما في تجويف البطن.
- تشريح الرحم خارج تجويف البطن ووضعه في صحن 10 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
- تشريح الأجنة من الرحم مع الملقط رقيقة ذات الرؤوس تحت ستيريوميكروس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تشريح البنكرياس من الفئران الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة (الشكل 2A و 2 باء). يعتمد تأثير الجهاز الهضمي للفئران الأقدم من يوم الولادة 18، على درجة التروية؛ ولذلك، الحقن هو أهم خطوة لعزله جزيرة ليلى (الشكل 2--2E و الجدول 6). تم حقن قدر كولاجيناز قدر الإمكان لملء البنكرياس أثناء هذه الخطوة. ويرد تماما تضخم البنكرياس في 2D الشكل<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وفي هذا البروتوكول، أثبتنا طريقة فعالة وسهلة الاستخدام لدراسة ملامح التعبير خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة والقيام بالتحاليل ترانسكريبتوميك خلية واحدة.
أن الخطوة الأكثر أهمية هو عزل خلايا بيتا واحد في حالة جيدة. البنكرياس تماما perfused الاستجابة على نحو أفضل الهضم اللاحقة. سيؤدي إلى عدم كفاية التروية، الذي يحدث عادة في البنكرياس الظهرية، في جزيرة صغيرة منخفضة عائد. بعد نضح، وقت الهضم و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونحن نشكر المركز الوطني للعلوم البروتين وبكين (جامعة بكين) ومركز بكين تسينغهوا "منصة الحوسبة علوم الحياة". هذا العمل كان تدعمها وزارة العلوم والتكنولوجيا في الصين (2015CB942800) والوطنية العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (31521004 و 31471358 و 31522036)، وتمويل من مركز بكين تسينغهوا لعلوم الحياة إلى جيم-R.X.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| كولاجيناز بي | روش | 11213873001 | |
| تريبسين-EDTA (0.25٪) ، فينول أحمر | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 25200114 | |
| مصل بقري الجنين (FBS) | هيكلون | SH30071.03 | |
| دومون # 4 ملقط | روبوز | RS-4904 | |
| دومون # 5 ملقط | روبوز | RS-5058 | |
| 30 جم BD إبرة 1/2 " الطول | BD | 305106 | |
| مجهر ستيريو | Zeiss | Stemi DV4 | |
| مجهر تيريو فلوري ستيريو | Zeiss | ستيريو Lumar V12 | |
| جهاز طرد | مركزي Eppendorf | 5810R | |
| طرد | Eppendorf | 5424R | |
| أنبوب دائري القاع من البوليسترين مع غطاء مصفاة الخلية | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| حصيرة السيليكون المانعة | للتسرب Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| أنبوب PCR الرقيق | Extragene | P-02X8-CF | |
| فارز الخلايا | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| ماصة شعرية | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| الماء المقطر | جيبكو | 10977 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | T9284 | |
| dNTP مزيج | نيو إنجلاند بيولابس | N0447 | |
| مؤتلف RNase | تاكارا | 2313 | |
| Superscript II النسخ العكسي | Invitrogen | 18064-014 | |
| أول حبلا عازل (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2< / sub> | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| مياه خالية من Nuclease | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP Beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Prep Kit V2 ل Illumina | Vazyme | TD502 | قم بتضمين 5x TTBL و 5x TTE و 5x TS و 5x TAB و TAE |
| TruePrep Index Kit V3 ل Illumina | Vazyme | TD203 | تتضمن 16 N6XX و 24 N8XX |
| عالية الحساسية NGS Fragment Analysis | Kit التقنيات التحليلية المتقدمة | DNF-474 | |
| 1x HBSS بدون Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup> | 138 ملي كلوريد الصوديوم ؛ 5.34 ملي مولار KCl 4.17 ملي مولار NaHCO3; 0.34 مللي مولار Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 | ||
| Isolation | المؤقت 1 & مرات; HBSS يحتوي على 10 ملي هيبيس ، 1 ملي مللي كلوريد < > 2 < / فرعي > ، 5 ملي مولار جلوكوز ، درجة الحموضة 7.4 | ||
| عازلة | 1 مرات. يحتوي HBSS على 15 ملي مولار هيبس ، 5.6 ملي مولار جلوكوز ، 1٪ FBS ، درجة الحموضة 7.4 | ||
| كلوريد الصوديوم | سيجما-ألدريتش | S5886 | |
| KCl | سيجما-ألدريتش | P9541 | |
| NaHCO3< / sub> | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2< / sub>HPO4< / sub> | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2< / sub>PO4< / فرعي > | سيجما ألدريتش | P5655 | |
| د - (+) - الجلوكوز | سيجما - ألدريتش | G5767 | |
| هيبس | سيجما - ألدريتش | H4034 | |
| MgCl < > 2 < / فرعي > | سيجما ألدريتش | M2393 | |
| أوليغو دي تي < سوب>30 < / فرعي > VN التمهيدي | 5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT30< / sub> VN-3'TSO | ||
| 5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG + G-3'ISPCR | |||
| primers | 5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh التمهيدي | 5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh < / em> التمهيدي | 5'- GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 التمهيدي | 5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3' | ||
| Ins2 التمهيدي | 5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3' |
المراجع
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).
- Oliver-Krasinski, J. M., Stoffers, D. A. On the origin of the....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
