استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

ملخص

نقدم هنا، على بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الفيروس سريعاً من الدم كله فيروس معطل. الاستخراج تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء. الأسلوب لا تعتمد على مرافق المختبرات، ويمكن استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية).

الملخص

التشخيص السريع للعدوى أمر أساسي لإدارة تفشي واحتواء المخاطر، والعناية بالمرضى. أننا أظهرنا سابقا طريقة للمنظمة السرير السريع لفيروس الإيبولا أثناء أخذ عينات من الدم لإجراء اختبارات الحمض النووي آمنة (غ) عن طريق إضافة المخزن مؤقت تحلل تجارية/ربط مباشرة إلى أنابيب جمع الدم فراغ. باستخدام هذا النهج المنظمة السرير، وقد وضعنا آمنة وسريعة ومبسطة سرير نا استخراج أسلوب للكشف عن الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة اللاحقة. استخراج نا تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء.

بعد أن يتم جمع الدم في المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، المحتويات مختلطة بقلب الأنبوب باليد، وهي المحتضنة الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) هي إضافة إلى الأنبوب، والمحتويات مختلطة بالتقليب أنبوب جمع باليد. ثم يتم جمع مجبس جانب أنبوب جمع الدم باستخدام حامل مغناطيسي أو مغناطيس وشريط المطاطي. مجبس غسلها ثلاث مرات، وبعد إضافة شطف المخزن المؤقت مباشرة في أنبوب جمع، الناس مستعدون للاختبارات نا، مثل قبكر أو حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، دون إزالة مجبس من رد فعل. طريقة استخراج نا لا يعتمد على أي مرافق المختبرات، ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية وأجنحة العزل في المستشفى). عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك محمولة، يمكن الحصول على تشخيص داخل 40 دقيقة لجمع الدم.

المقدمة

في حالات تفشي الفيروس، عند المرضى الذين تقتصر على أجنحة العزل في المستشفى أو عندما يحتاج إلى تشخيص سريع، يتحتم تشخيص جزيئي نقطة من رعاية آمنة وبسيطة ودقيقة لاحتواء المريض الرعاية والمخاطر. تفشي الفيروسية الأخيرة اثنين، لفيروس الإيبولا (أبوف) في غرب أفريقيا (2013) وفيروس زكى في أمريكا الجنوبية (2015)، زاد الاهتمام بتحسين العناية بنقطة الجزيئية الاختبارات التشخيصية، مثل النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح)^1،2 و recombinase بوليميريز التضخيم (الجيش الوطني الرواندي)^3،4. RT-مصباح والجيش الوطني الرواندي هي الاختبارات الجزيئية السريعة والحساسة، والمحددة التي يمكن أن يؤديها على الاستعدادات نموذج مبسط. لهذا الفيروس زكى، الرايت-مصباح قد اقترن بتدفق أفقي مقايسة (الوكيل)، الذي يمكن الكشف عن الفيروس Zika في عينات غير تنقية الدم كله داخل 30 دقيقة¹؛ ومع ذلك، أبوف، التي تصنف على أنها ممرض مجموعة 4 مخاطر وهو معد للغاية، العينات تحتاج إلى معالجة إطار السلامة الأحيائية من المستوى 4 (BSL-4) الشروط وغير نشط قبل إجراء أي إجراءات تشخيصية آمنة.

واستخدمت أساليب المنظمة مبسطة أبوف، مثل إضافة المخازن المؤقتة لتحلل عينة^2،3،،من⁴⁵، أثناء اندلاع؛ ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق التعامل مع ظروف BSL-4 مع معدات المختبرات، مثل خزانات السلامة البيولوجية BSL-3 وأجهزة الطرد المركزي، وكتل تدفئة والماصات، كحد أدنى. هذه المعدات عادة غير موجود في أجنحة العزل أو في مستشفيات ميدانية. للتغلب على هذا التحدي، بذلت محاولات إجراء عمليات التشخيص في حقائب³، وكان العديد من الأجهزة المحمولة والأجهزة المتقدمة [مثلجهاز محمول لاستخراج الحمض النووي (غ)]⁶. ومع ذلك، عينات أبوف الإيجابية لا تزال بحاجة ليكون غير نشط قبل أن يمكن استخدام هذه الأجهزة.

سابقا أبلغنا أسلوب المنظمة فيروس سرير سريع لفيروس اللقاحية، أبوف⁷و فيروس جدري بقر⁸ قبل إضافة المخزن المؤقت تحلل التجارية/ملزمة أنابيب جمع الدم فراغ العادية، مما يسمح للمباشرة نقل الدم من المريض إلى المخزن المؤقت للمنظمة⁷. هذه المنظمة مباشرة وفورية في نظام مغلق ويلغي الحاجة للتعامل مع العينات باستخدام أي احتواء صارمة، مثل شروط BSL-4⁷، ويمكن التعامل مع العينات BSL-2 في الظروف العادية. هذا الأسلوب المنظمة متوافق مع عدة أنظمة استخراج نا، مثل الروبوتات واليد تنقية مجموعات⁷؛ ومع ذلك، هذه الأساليب تتطلب معدات المختبرات، مثل الروبوتات وأجهزة الطرد المركزي، والكهرباء، والتي لا تكون دائماً موجودة في إعدادات الحقل، أو داخل أجنحة العزل في المستشفى.

وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة ومبسطة يدوي نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية اللاحقة. طريقة استخراج نا لا يتطلب أي معدات خلاف حامل مغناطيس/مغناطيسية. لا توجد أجهزة الطرد المركزي، تدفئة كتل، أو الكهرباء اللازمة لاستخراج نا. ومن ثم، هذا الأسلوب لا يعتمد على مرافق المختبرات ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية، في أجنحة العزل في المستشفى، أو مع إعدادات الموارد المنخفضة). طريقة استخراج نا سريعة وبسيطة ويمكن استخدامها مباشرة في أي اختبارات نا المتلقين للمعلومات، مثل قبكر أو RT qPCR مصباح RT-مصباح. عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك متحاور يحركها البطارية محمولة، يمكن الحصول على تشخيص سرير داخل 40 دقيقة لجمع الدم.

البروتوكول

اللجنة المعنية "أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية"، أعطت إقليم العاصمة المستنيرة، وجميع الأساليب الموصوفة هنا قد أعفيت من استعراض منظومة اللجنة الأخلاقية، وفقا للقانون الدانمركي في مشاريع التنمية المقايسة.

1. إعداد أنابيب فراغ جمع الدم للفيروس المنظمة واستخراج نا السريع

تحذير: يحتوي على المخزن المؤقت المستخدم لهذا البروتوكول جوانيدينيوم ثيوسيانات (جتك) وغير الأيونية خافض للتوتر السطحي، ومهيجات. اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة واستخدام غطاء تدفق، وارتداء القفازات عند التعامل مع الأمر. تجنب أي الجلد والاتصال بالعين. إذا كان المخزن المؤقت هو المسكوب، السطحية الملوثة يجب ابدأ أن تطهيرها مباشرة مع الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم (المكونات النشطة في "بليتش") نظراً لأن هذا الخليط يمكن أن يؤدي إلى تشكيل مادة السيانيد السامة. أولاً، يمسح حتى المخزن المؤقت الذي امتد مع الأنسجة ماصة. بعد ذلك، تنظيف السطح مع الإيثانول 70%، ومن ثم بالماء، وأخيراً، استخدام الكلورامين أو هيبوكلوريت الصوديوم.

1. إعداد أنابيب فراغ جمع الدم، حقن 1.6 مل من المخزن المؤقت تحلل تجارية محددة في أنبوب فراغ يدتا 4 مل من ثقب غطاء الأنبوبة باستخدام إبرة 25 × 1 وحقنه 3 مل.
   ملاحظة: لا تقم بإزالة غطاء أنبوب الفراغ. يجب المحافظة على الفراغ.
2. تخزين أنابيب الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
   ملاحظة: الأنابيب مستقرة على الأقل 1 سنة بعد إعدادها.

2-إعداد المخازن المؤقتة لاستخراج نا

1. إعداد المخازن المؤقتة لاستخراج نا، مكان اثنين 1.8 مل ومل 4.5 اثنين واحد 3.6 مل أنابيب في حامل.
2. إضافة، عن طريق بيبيتينج، 960 ميليلتر من الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) إلى الأنبوبة نظيفة 1.8 مل والتسمية مع مجبس. ريسوسبيند تعليق تجاوب تماما قبل بيبيتينج أنه.
   ملاحظة: مجبس تميل إلى جمع بسرعة في الجزء السفلي من الأنبوب.
3. إضافة، عن طريق بيبيتينج، 4 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وأنا إلى أنبوب مل 4.5 نظيفة وتسميته كالبنك الدولي-1.
   تنبيه: يغسل المخزن المؤقت يحتوي كلوريد جوانيدينيوم، ومهيجة. اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة واستخدام غطاء تدفق، وارتداء القفازات عند التعامل مع الأمر. تجنب أي الجلد والاتصال بالعين.
4. إضافة 1.5 مل أغسل المخزن المؤقت الثاني لأنبوب نظيفة 3.6 مل، بيبيتينج، وتسميته كالبنك الدولي-2.
5. إضافة، عن طريق بيبيتينج، 3 مل أغسل المخزن المؤقت الثالث إلى أنبوب مل 4.5 نظيفة وتسميته كالبنك الدولي-3.
6. إضافة، عن طريق بيبيتينج، 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت إلى أنبوب نظيف 1.8 مل وتسميته كاجتماع المجلس التنفيذي.
7. تخزين المخازن المؤقتة الكوتيد في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.
   ملاحظة: الأنابيب مستقرة لمدة شهر واحد على الأقل بعد إعدادها.

3-الدم مجموعة من المرضى الذين يعانون من علامات وأعراض الإصابة بعدوى الفيروس

تنبيه: اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة عند جمع الدم كله من المريض. ارتداء القفازات والنظارات. إذا كان المريض بمعزل عن غيرها، يرجى اتباع إجراءات السلامة البيولوجية المستوى 4.

1. جمع الدم كله عن طريق الحقن الوريدي من المريض واستخدام إبرة فراشة مع أنابيب التمديد العيار الصغير وأنبوب فراغ جمع دم الذي يحتوي على مخزن مؤقت تحلل/ملزمة. بقية ذراع المريض في وضع الهبوط ووضع أنبوب جمع أقل من إبرة الفراشة. أدخل إبرة فراشة في هذا السياق المريض وإرفاق أنبوب جمع الدم إلى تمديد العيار الصغير.
   ملاحظة: هذا سوف يمنع التدفق الخلفي.
2. بعد جمع الدم وخلط محتويات الأنبوبة بالتقليب الأنبوب 5-10 مرات.
   ملاحظة: بسبب الفراغ المتبقي في أنابيب جمع الدم التي تحتوي على 1.6 مل من المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، سيكون حجم العينة التي يتم جمعها تلقائياً 1.6 مل.
3. تطهير الجزء الخارجي الأنبوبة باستخدام الإيثانول 70%.
4. احتضان هذه الأنابيب لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا ويمكن تخزين أنابيب جمع الدم الكامل في-20 درجة مئوية، 5 درجة مئوية، 25 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية على الأقل 1 في الشهر⁷.
5. مواصلة مباشرة إلى أسلوب استخراج نا مبسطة.

4-تبسيط استخراج نا من الدم كله

1. لتنقية نا من تحلل/ربط المخزن المؤقت معطل جمع الدم، مزيج محتويات الأنبوبة بالتقليب الفراغ الأنبوبة باليد x 5-10.
2. إزالة غطاء الأنبوبة بعناية، والاضطلاع بالغطاء.
3. صب قاسمة المعدة من مجبس (1 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
4. ضع غطاء جديد من أنبوب جمع دم غير مستخدمة على الأنبوبة التي تحتوي على العينة.
5. وضع إصبع على الغطاء التأكد من أن يتم إغلاق الأنبوب محكم وخلط محتويات الأنبوبة بالتقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
6. ضع الأنبوبة في حامل المغناطيسية وإبقاء إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
7. الوجه صاحب المغناطيسي مع الأنبوب بضع مرات باليد للتأكد من أن تجمع جميع مجبس إلى جانب الأنبوب مع المغناطيس.
   ملاحظة: يمكن استبدال حامل المغناطيسي مع مغناطيس ممدود وشريط المطاطي.
8. قم بإزالة غطاء الأنبوب وتجاهل محتويات الأنبوبة باستخدام ماصة المتاح أو ببساطة عن طريق صب المحتويات إلى أنبوب جمع 50 مل.
   ملاحظة: تجنب الهباء الجوي من أنبوب جمع 50 مل بإغلاق الأنبوب بغطاء.
9. صب قاسمة استعداد البنك الدولي-1 (4 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
10. ضع الغطاء على الأنبوب ووضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
11. إزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية، والحفاظ على الغطاء وشددت بشكل أمن مع إصبع.
    ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
12. ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
13. كرر الخطوات من 4.6-4.8.
14. صب قاسمة استعداد البنك الدولي-2 (1.5 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
15. ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
    ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
16. وضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
17. ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم لبضع ثوان من جهة.
18. كرر الخطوة 4، 6-4، 8.
19. صب قاسمة استعداد البنك الدولي-3 (3 مل) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
20. ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
    ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
21. وضع إصبع على غطاء لضمان أحكام إغلاق الأنبوب.
22. ريسوسبيند مجبس واسطة التقليب أنابيب جمع الدم باليد 5-10 مرات.
23. كرر الخطوات من 4.6-4.8.
24. صب قاسمة استعدادا لاجتماع المجلس التنفيذي (100 ميليلتر) مباشرة في أنبوب جمع الدم.
25. ضع الغطاء على الأنبوب وإزالة الأنبوب من صاحب المغناطيسية.
    ملاحظة: إذا كان استخدام مغناطيس وشريط المطاطي، ببساطة إزالة الرباط المطاطي والمغناطيس من الأنبوب.
26. ريسوسبيند مجبس في المجلس التنفيذي بالتنصت على أنابيب جمع الدم 5-10 مرات بأصبع.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا، ويمكن تخزين الأنابيب عند-20 درجة مئوية.
27. ونقل أحد الحبرية (5-8 ميليلتر) مجبس ريسوسبينديد إلى المصب نا التضخيم رد فعل مزيج من 1.5 مل ماصة المتاح (التضخيم نا أي المتلقين للمعلومات التشخيصية الاعتداء مثل يمكن استخدام مصباح/RT-مصباح أو فحوصات qPCR/RT-قبكر) باستخدام.
    ملاحظة: سوف تتمسك مجبس الناس، لذا يجب التأكد من استخدام مجبس التضخيم نا المتلقين للمعلومات كرد فعل. مزيج من تعليق تجاوب قبل الاستخدام. بعد خلط، جمع مجبس في الجزء السفلي من الأنبوب.

النتائج

البروتوكول المعروضة هنا هي بسيطة وفعالة ويمكن تطبيقها على نطاق واسع لأي التحليل الجزيئي المراد تنفيذها على عينات الدم كله المعدية غير نشط مع المخزن المؤقت تحلل/ملزمة. ويبين الشكل 1، بما في ذلك إعداد الدم جمع أنابيب فراغ⁷ (الشكل 1A)، جمع الدم⁷ (الشكل 1B)، استخراج NA ( سير العمل للمنظمة الدم واستخراج نا 1 الأرقام - ح 1)، ...

المناقشة

وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة وبسيطة دليل سرير نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية المتلقين للمعلومات. ووضعت طريقة استخراج نا وصف المراد تنفيذها مباشرة على عينات الدم كله في أنابيب جمع الدم الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت (جدول المواد) تحلل/ملزمة⁷. هذا المخزن المؤقت المحدد يحللها أبوف⁷ وهو العنصر الحاسم في الأسلوب. بعد جمع الدم، نوصي بحضانة الأنبوب على الأقل 20 دقيقة⁷ ضمانا ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب Vacutainer K2 EDTA (4 مل)	Becton Dickinson	368861
Plus جمع الدم	Becton Dickinson	362725
23G × 1 إبرة	Becton Dickinson	300800
LUER LOK حقنة (3 مل)	إبرة Becton Dickinson	309658
Butterfly مع أنابيب تمديد صغيرة التجويف	J & oslash ؛ rgen Kruuse A / S	121714
1٪ Virkon	Nomeco A / S	849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis / Binding Buffer - Refill	Roche Diagnostics A / S	03246752001
MagNA Pure LC Total Acid Salt Kit	Roche Diagnostics A / S	3038505001
Nunc & trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (1,8 مل) Thermo	Fisher Scientific	375418
Nunc & trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (3,6 مل) Thermo	Fisher Scientific	379189
Nunc&trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (4,5 مل)	Thermo Fisher	Scientific 379146
DynaMag & trade ؛ -5 مغناطيس	ثيرمو فيشر العلمي	12303D
نقل ماصة (3.5 مل)	Sarstedt	86.1171.010
Thermo Scientific & Trade ؛ سامكو & تجارة; ماصات نقل أطراف دقيقة (1.5 مل) ثيرمو	فيشر ساینتفيك	231
ثيرمو ساینتيف & تجارة. Nunc™ 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقمة من مادة البولي بروبيلين	الحرارية فيشر 339652