Method Article

استخراج سريعة وآمنة وبسيطة دليل السرير الحمض النووي للكشف عن الفيروس في عينات الدم كله

DOI:

10.3791/58001

⸱

June 30th, 2018

 ,  , 
1Virus Research & Development Laboratory, Statens Serum Institut, 2Infectious Disease Research Unit, University of Southern Denmark

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، على بروتوكول لاستخراج الحمض النووي الفيروس سريعاً من الدم كله فيروس معطل. الاستخراج تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء. الأسلوب لا تعتمد على مرافق المختبرات، ويمكن استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التشخيص السريع للعدوى أمر أساسي لإدارة تفشي واحتواء المخاطر، والعناية بالمرضى. أننا أظهرنا سابقا طريقة للمنظمة السرير السريع لفيروس الإيبولا أثناء أخذ عينات من الدم لإجراء اختبارات الحمض النووي آمنة (غ) عن طريق إضافة المخزن مؤقت تحلل تجارية/ربط مباشرة إلى أنابيب جمع الدم فراغ. باستخدام هذا النهج المنظمة السرير، وقد وضعنا آمنة وسريعة ومبسطة سرير نا استخراج أسلوب للكشف عن الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة اللاحقة. استخراج نا تتم مباشرة في أنابيب جمع الدم ولا يتطلب أي معدات أو الكهرباء.

بعد أن يتم جمع الدم في المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة، المحتويات مختلطة بقلب الأنبوب باليد، وهي المحتضنة الخليط لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الزجاج المغناطيسي الجسيمات (مجبس) هي إضافة إلى الأنبوب، والمحتويات مختلطة بالتقليب أنبوب جمع باليد. ثم يتم جمع مجبس جانب أنبوب جمع الدم باستخدام حامل مغناطيسي أو مغناطيس وشريط المطاطي. مجبس غسلها ثلاث مرات، وبعد إضافة شطف المخزن المؤقت مباشرة في أنبوب جمع، الناس مستعدون للاختبارات نا، مثل قبكر أو حلقة متحاور التضخيم (المصباح)، دون إزالة مجبس من رد فعل. طريقة استخراج نا لا يعتمد على أي مرافق المختبرات، ويمكن بسهولة استخدامها في أي مكان (مثلاً، في مستشفيات ميدانية وأجنحة العزل في المستشفى). عندما يتم الجمع بين هذا الأسلوب استخراج نا مع مصباح وصك محمولة، يمكن الحصول على تشخيص داخل 40 دقيقة لجمع الدم.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حالات تفشي الفيروس، عند المرضى الذين تقتصر على أجنحة العزل في المستشفى أو عندما يحتاج إلى تشخيص سريع، يتحتم تشخيص جزيئي نقطة من رعاية آمنة وبسيطة ودقيقة لاحتواء المريض الرعاية والمخاطر. تفشي الفيروسية الأخيرة اثنين، لفيروس الإيبولا (أبوف) في غرب أفريقيا (2013) وفيروس زكى في أمريكا الجنوبية (2015)، زاد الاهتمام بتحسين العناية بنقطة الجزيئية الاختبارات التشخيصية، مثل النسخ العكسي بوساطة حلقة متحاور التضخيم (RT-مصباح)1،2 و recombinase بوليميريز التضخيم (الجيش الوطني الرواندي)3،4. RT-مصباح والجيش الوطني الرواندي هي الاختبارات الجزيئية السريعة والحساسة، ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللجنة المعنية "أخلاقيات البحوث الطبية الحيوية"، أعطت إقليم العاصمة المستنيرة، وجميع الأساليب الموصوفة هنا قد أعفيت من استعراض منظومة اللجنة الأخلاقية، وفقا للقانون الدانمركي في مشاريع التنمية المقايسة.

1. إعداد أنابيب فراغ جمع الدم للفيروس المنظمة واستخراج نا السريع

تحذير: يحتوي على المخزن المؤقت المستخدم لهذا البروتوكول جوانيدينيوم ثيوسيانات (جتك) وغير الأيونية خافض للتوتر السطحي، ومهيجات. اتخاذ تدابير السلامة المختبرية المناسبة واستخدام غطاء تدفق، وارتداء القفازات عند التعامل مع الأمر. تجنب أي الجلد والاتصال بالعين. إذا كان المخزن المؤقت هو المسكوب، السطحية الملوثة يجب ابدأ أن تطهيرها مباشرة مع الكلورامين أو هيب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول المعروضة هنا هي بسيطة وفعالة ويمكن تطبيقها على نطاق واسع لأي التحليل الجزيئي المراد تنفيذها على عينات الدم كله المعدية غير نشط مع المخزن المؤقت تحلل/ملزمة. ويبين الشكل 1، بما في ذلك إعداد الدم جمع أنابيب فراغ7 (الشكل 1A)، جمع الدم7 (الشكل 1B)، استخراج NA ( سير العمل للمنظمة الدم واستخراج نا 1 الأرقام - ح 1)، .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وفي هذا التقرير، يصف لنا آمنة وسريعة وبسيطة دليل سرير نا استخراج أسلوب لاكتشاف الفيروس في الدم كله معطل المخزن المؤقت لتحلل/ملزمة الجزيئية المتلقين للمعلومات. ووضعت طريقة استخراج نا وصف المراد تنفيذها مباشرة على عينات الدم كله في أنابيب جمع الدم الفراغ الذي يحتوي على المخزن المؤقت (جدول المواد) تحلل/ملزمة7. هذا المخزن المؤقت المحدد يحللها أبوف7 وهو العنصر الحاسم في الأسلوب. بعد جمع الدم، نوصي بحضانة الأنبوب على الأقل 20 دقيقة7 ضمانا .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر سوزان لوبيز راسموسن وجنسن سولفيج Kolbjørn الخاصة بالمساعدة التقنية ومعالجة العينات السريرية. هذا المشروع هو جزء من مجموعة ابولامودراد، التي تلقت تمويلاً من "مبتكرة الطب المبادرة 2 مشترك التعهد" تحت منحة اتفاق N ° 115843. هذا "التعهد المشترك" يتلقى الدعم من الاتحاد الأوروبي في أفق 2020 البحث وبرنامج الابتكار وافبيا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أنابيب Vacutainer K2 EDTA (4 مل)Becton Dickinson368861
Plus جمع الدمBecton Dickinson362725
23G × 1 إبرةBecton Dickinson300800
LUER LOK حقنة (3 مل)إبرة Becton Dickinson309658
Butterfly مع أنابيب تمديد صغيرة التجويفJ & oslash ؛ rgen Kruuse A / S121714
1٪ VirkonNomeco A / S849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I - Lysis / Binding Buffer - RefillRoche Diagnostics A / S03246752001
MagNA Pure LC Total Acid Salt KitRoche Diagnostics A / S3038505001
Nunc & trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (1,8 مل) ThermoFisher Scientific375418
Nunc & trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (3,6 مل) ThermoFisher Scientific379189
Nunc&trade ؛ البنوك الحيوية وأنابيب التبريد لثقافة الخلايا (4,5 مل)Thermo FisherScientific 379146
DynaMag & trade ؛ -5 مغناطيسثيرمو فيشر العلمي12303D
نقل ماصة (3.5 مل)Sarstedt86.1171.010
Thermo Scientific & Trade ؛ سامكو & تجارة; ماصات نقل أطراف دقيقة (1.5 مل) ثيرموفيشر ساینتفيك231
ثيرمو ساینتيف & تجارة. Nunc™ 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطي المعقمة من مادة البولي بروبيلينالحرارية فيشر 339652
العلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
  2. Benzine, J. W., Brown, K. M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nucleic Acid ExtractionMagnetic Glass ParticlesVirus InactivationPoint of Care DiagnosticsBlood Collection TubesLysis Binding BufferManual Bedside MethodqPCR DetectionLAMP AmplificationWhole Blood Samples

Related Articles