هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يتكون اللحاء الجديد الثدييات من أنواع عديدة من الخلايا العصبية ضادات والمثبطة، كل منها مع الخصائص الكهربية والبيوكيميائية، اتصالات متشابك، و في فيفو الوظائف، ولكن الأساسية الوظيفية والتشريحية المنظمة من الهاتف الخلوي إلى نطاق الشبكة هو غير مفهومة. هنا يصف لنا طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي عبر مناطق واسعة من الدماغ لتحقيق المنظمة الخلوية القشرية. أنواع معينة من الخلايا العصبية المسماة بحقن الفلورسنت تتبع الخلايا العصبية إلى الوراء أو تعبير البروتينات الفلورية في الفئران المعدلة وراثيا. عينات كتلة الدماغ، مثلاً، نصف الكرة الغربي، أعد بعد التثبيت، التي تتسم بالشفافية مع أنسجة تطهير الطرق، ويتعرضون إلى إيمونولابيلينج الفلورية لأنواع محددة من الخلايا. يتم تفحص مناطق كبيرة باستخدام مجاهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مجهزة بعمل كبير المسافة الأهداف والمراحل مزودة بمحركات. هذا الأسلوب يمكن حل المنظمة الدوري microcolumn الخاصة بنوع الخلية الوحدات الوظيفية في اللحاء الجديد الماوس. يمكن أن يكون هذا الإجراء مفيداً لدراسة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد في مجالات متنوعة من الدماغ والأنسجة المعقدة الأخرى.
المقدمة
اللحاء الجديد الثدييات يتكون من عدد كبير من أنواع الخلايا، كل مع أنماط التعبير الجيني محددة، الخصائص البيوكيميائية والكهربية، والاتصالات متشابك، و في فيفو وظائف1،2 ،3،،من45،،من67. ما إذا كان يتم تنظيم أنواع هذه الخلية في هياكل المتكررة كانت غير واضحة. أعمدة القشرية، بما في ذلك الأعمدة المرئية التوجه وبرميل somatosensory، كررنا الهياكل، ولكن منظمتهم الخلوية ما زال غير واضح8،9
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وافقت عليها اللجنة التجارب الحيوانية واكو بتبريد والتجربة المؤتلف الوراثية بتبريد سلامة اللجنة جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من مرافق الحيوانات العلوم الدماغ بتبريد المعهد.
1-التحضير للتصوير الدوائر
-
تصوير الدائرة19
- استخدام أوراق المطاط سيليكون، إعداد دائرة بسمك حوالي 5 مم والطابق لوحات من سمك مختلف. كما أن إعداد أطباق بيتري مع أو بدون من أسفل زجاج (الشكل 1A).
-
فاصل شريحة
- إعداد الفواصل لإجراء عينات، واستخدام أوراق المطاط سيليكون بسمك 0.5 ملم (الش....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
نحن المسماة الخلايا العصبية القشرية الإسقاط بالتعبير عن تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران المحورة وراثيا وتصور الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس. تعرضت للأسلوب سيدب نصف الكرة الأيسر من الدماغ وتفحص باستخدام مجهر اثنين-فوتون مزودة الماء غمر تعمل منذ فترة طويلة المسافة الهدف (25 X، 1.1 N.A.، المسافة العمل 2 مم) ومرحلة إليه. كومة من الصور 401 (512 × 512 بكسل؛ وحجم بكسل = 0.99 ميكرومتر) في خطوة z = 2.8 ميكرومتر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد قدمنا إجراءات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد الواسعة النطاق للمنظمة خلية نوع معين من أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5. مقارنة لتلطيخ شريحة التقليدية، يكون الأسلوب أكثر فائدة في تحديد منظمة ثلاثية الأبعاد من اللحاء الجديد. الأسلوب الذي يتيح الحصول على الصور من نطاق أوسع وأعمق مناطق الدماغ مقارنة نموذجية في فيفو 2-فوتون مجهرية أو مجهرية [كنفوكل] التقليدية، وبالتالي، يمكن السماح بالتحليل الشامل للخلوي نيوكورتيكال المنظمة.
خطوة حاسمة للأسلوب هو إيلاج جسم. مجموعة فرعي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
نشكر أتسوشي ميياواكي وحماه هيروشي لمشورتها على تجارب هلأبسكا، تشارلز يوكوياما لتحرير المخطوطة، Eriko Ohshima وكيشينو ميوكي للمساعدة التقنية التي تقدمها. هذا العمل كان تدعمها أموال البحوث من بتبريد T.H. ومعونة "البحث العلمي" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) من اليابان إلى T.H. (المجالات المبتكرة "Mesoscopic نيوروسيركويتري"؛ 22115004) و س. س. (25890023).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الفئران المعدلة وراثيا Crym-egfp | MMRRC | 012003-UCD | |
| Tlx3-cre الفئران المعدلة وراثيا | MMRRC | 36547-UCD | |
| ROSA-CAG-flox-tdفئران الطماطم | مختبر جاكسون | جاكس # 7909 | |
| لوح مطاط السيليكون | AS ONE | 6-611-01 | سمك 0.5 مم |
| لوح مطاط السيليكون | AS ONE | 6-611-02 | سمك 1.0 مم |
| صفائح مطاطية من السيليكون | AS ONE | 6-611-05 | سمك 3.0 مم |
| أطباق بتري | Falcon | 351008 | |
| غطاء | زجاجي ماتسونامي | C022241 | |
| الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 488 مترافق | Invitrogen | C22841 | |
| الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 555 مترافق | Invitrogen | C22843 | |
| الوحدة الفرعية لسم الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 594 المترافق | Invitrogen | C22842 | |
| الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 647 مترافق | Invitrogen | C34778 | |
| 26 G حقنة | هاميلتون مضخة | ||
| حاقن | KD Scientific | KDS 310 | Pons |
| حاقن | KD Scientific | KDS 100 | مناور حقن القولون الفائق |
| Narishige | SM-15 | ||
| الصوديوم بنتوباربيتال | Kyoritsu Seiyaku | Somnopentyl | |
| Isoflurane | Pfizer | ||
| Lidocaine | AstraZeneca | Xylocaine حقن 1٪ مع مثقاب الإبينفرين | |
| Toyo Associates | HP-200 | ||
| Avitene hemerillar microfibrillar | Davol | Inc 1010090 | |
| Alonalfa | Daiichi-Sankyo | Alonalpha A | |
| الحرير الجراحي | Ethicon | K881H | |
| حاضنة | UVP | HB-1000 هجين | |
| ماصة زجاجية | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
| مجتذب القطب الكهربائي | شركة Sutter Instrument | Company P-97 | |
| سائل البارافين ، | ناكالاي الخفيف tesque | 26132-35 | |
| سالين | أوتسوكا | 1326 | |
| بارافورمالدهايد | ناكالاي تيسك | 26126-54 | |
| إبرة التنغستن | Inter Medical | & Phi ؛ 0.1 * L200 مم | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 50 مل أنبوب بلاستيكي | Falcon | 352070 | |
| & alpha ؛ -thioglycerol | Nacalai tesque | 33709-62 | |
| D (-) الفركتوز | Nacalai tesque | 16315-55 | |
| BluTack | Bostik | CKBT-450000 | |
| مجهر ثنائي الفوتون | نيكون | A1RMP | |
| الغمر المائي أهداف مسافة العمل الطويلة | نيكون | CFI Apo LWD 25XW ، NA 1.1 ، WD 2 مم | |
| الغمر في الماء أهداف مسافة العمل الطويلة | نيكون | CFI LWD 16XW ، NA 0.8 ، WD 3 مم | |
| المرحلة الآلية | COMS | PT100C-50XY | |
| مرشح | Semrock | FF01-492 / SP-25 | |
| مرشح | Semrock | FF03-525 / 50-25 | |
| مرشح | سيمروك | FF03-575 / 25-25 | |
| مرشح | سيمروك | FF01-629 / 56 | |
| مرشح | كروما | D605 / 55 م | |
| 5 مل أنبوب بلاستيكي | كواحد | VIO-5B | |
| 2 مل أنبوب بلاستيكي | Eppendorf ؛ | 0030120094 | |
| اليوريا | ناكالاي tesque | 35905-35 | |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Glyserol | Sigma-aldrich | 191612 | |
| D (-) -sorbitol | Wako | 191-14735 | |
| Methyl-&-cyclodextrin | Tokyo chemical industry | M1356 | |
| & gamma;- سيكلودكسترين | واكو | 037-10643 | |
| N-acetyl-L-hydroxyproline | Skin Essential Actives | 33996-33-7 | |
| DMSO | Nacalai tesque | 13445-45 | |
| مصل الأبقار الألبومين | Sigma-aldrich | A7906 | |
| Tween-20 (1.1 جم / مل) | Nacalai tesque | 35624-15 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) عبر الثانوية الممتزة الجسم المضاد ، Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21422 | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A21428 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتص ، Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21235 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11029 | |
| الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | |
| المجهر متحد البؤر | أوليمبوس | FV1000 | |
| الغمر في الماء أهداف مسافة العمل الطويلة | Olympus | XLUMPLFLN 20XW ، NA 1.0 ، WD 2 مم | |
| Anti-NeuN | Millipore | MAB377 | |
| Anti-NeuN | Millipore | ABN78 | |
| Anti-CTIP2 | Abcam | ab18465 | |
| Anti-Statb2 | Abcam | ab51502 | |
| Anti-GAD67 | Millipore | MAB5406 | |
| Anti-GABA | Sigma | A2052 | |
| Anti-Parvalbumin | Swant | 235 | |
| Anti-Parvalbumin | Frontier Institute | PV-Go-Af460 | |
| Anti-Parvalbumin | Sigma | P3088 | |
| Anti-Parvalbumin | Abcam | ab11427 | |
| مختبرات شبه جزيرة | السوماتوستاتين | المضادة T-4103 | |
| Anti-c-Fos | CalbioChem | PC38 |
المراجع
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
