Method Article

تصوير ثلاثي الأبعاد على نطاق واسع من المنظمة الخلوية في اللحاء الجديد الماوس

DOI:

10.3791/58027

⸱

September 5th, 2018

 ,  ,  , 
1RIKEN Brain Science Institute, 2Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا إجراء لإزالة الأنسجة ووسم الفلورسنت والتصوير على نطاق واسع لانسجة المخ الماوس الذي، وبالتالي يمكن تصور منظمة ثلاثية الأبعاد لأنواع الخلايا في اللحاء الجديد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون اللحاء الجديد الثدييات من أنواع عديدة من الخلايا العصبية ضادات والمثبطة، كل منها مع الخصائص الكهربية والبيوكيميائية، اتصالات متشابك، و في فيفو الوظائف، ولكن الأساسية الوظيفية والتشريحية المنظمة من الهاتف الخلوي إلى نطاق الشبكة هو غير مفهومة. هنا يصف لنا طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد من الخلايا العصبية المسماة فلوريسسينتلي عبر مناطق واسعة من الدماغ لتحقيق المنظمة الخلوية القشرية. أنواع معينة من الخلايا العصبية المسماة بحقن الفلورسنت تتبع الخلايا العصبية إلى الوراء أو تعبير البروتينات الفلورية في الفئران المعدلة وراثيا. عينات كتلة الدماغ، مثلاً، نصف الكرة الغربي، أعد بعد التثبيت، التي تتسم بالشفافية مع أنسجة تطهير الطرق، ويتعرضون إلى إيمونولابيلينج الفلورية لأنواع محددة من الخلايا. يتم تفحص مناطق كبيرة باستخدام مجاهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مجهزة بعمل كبير المسافة الأهداف والمراحل مزودة بمحركات. هذا الأسلوب يمكن حل المنظمة الدوري microcolumn الخاصة بنوع الخلية الوحدات الوظيفية في اللحاء الجديد الماوس. يمكن أن يكون هذا الإجراء مفيداً لدراسة البنية الخلوية ثلاثية الأبعاد في مجالات متنوعة من الدماغ والأنسجة المعقدة الأخرى.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللحاء الجديد الثدييات يتكون من عدد كبير من أنواع الخلايا، كل مع أنماط التعبير الجيني محددة، الخصائص البيوكيميائية والكهربية، والاتصالات متشابك، و في فيفو وظائف1،2 ،3،،من45،،من67. ما إذا كان يتم تنظيم أنواع هذه الخلية في هياكل المتكررة كانت غير واضحة. أعمدة القشرية، بما في ذلك الأعمدة المرئية التوجه وبرميل somatosensory، كررنا الهياكل، ولكن منظمتهم الخلوية ما زال غير واضح8،9. هذه موجودة في المناطق القشرية محددة ولا نظام على مستوى الدماغ.

وتصنف في طبقة نيوكورتيكال 5، الغالبية العظمى من الخلايا العصبية إلى أربعة أنواع رئيسية. نوع رئيسي من ضادات الخلايا العصبية، الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط، مشاريع محاور عصبية لأهداف subcortical منها بونس والحبل الشوكي، ووالاكيميه متفوقة، وعليه، يمثل مسار الإخراج القشرية الرئيسية10. الإسقاط القشرية الخلايا العصبية، نوع رئيسي آخر من ضادات الخلايا العصبية، يعصب قشرة10. الخلايا العصبية المثبطة تحتوي أيضا على الفئات الرئيسية هما: الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين11.

وتشير التحليلات الأخيرة إلى أن يتم تنظيم أنواع الخلايا الأربع في هياكل المتكررة12،،من1314. تنظيم الإسقاط الدماغي دون الخلايا العصبية12،،من1314 والإسقاط القشرية الخلايا العصبية14 في ميكروكولومنس نوع من الخلايا المحددة التي يبلغ قطرها 1-2 الخلايا. محاذاة الخلايا الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين على وجه التحديد مع ميكروكولومنس من الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط ولكن ليس مع ميكروكولومنس من الإسقاط القشرية الخلايا العصبية14. ميكروكولومنس أنفسهم محاذاة دورياً للنموذج سداسية شعرية الصفيف14 وهي موجودة في المناطق القشرية متعددة بما في ذلك المناطق المرئية وسوماتوسينسوري والحركية في الدماغ الماوس12،14 وفي اللغة مناطق الدماغ البشري13. الخلايا العصبية في microcolumn الفردية، معرض الأنشطة المتزامنة واستجابات حسية مشابهة14. هذه الملاحظات تشير إلى أن تنظيم الطبقة 5 أنواع الخلايا في بنية شعرية microcolumn الذي يمثل أول منظمة على مستوى الدماغ المعروفة من تكرار وحدات وظيفية.

ميكروكولومنس دائرة نصف قطرها حوالي 10 ميكرون ويكون تواتر مكانية لحوالي 40 ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، اتجاه ميكروكولومنس موازية dendrites قمي والتغييرات تبعاً لموقفها في قشرة14. ولذلك، من الصعب النظام microcolumn لتحليل استخدام شرائح القشرية التقليدية مع سمك نموذجي من بضع عشرات من ميكرومتر. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب تحليل تواتر البيانات ثلاثية الأبعاد من مجموعة واسعة من مناطق الدماغ، وبالتالي، منطقة التصوير نموذجية للفحص المجهري [كنفوكل] أو في فيفو التصوير 2-فوتون ضيقة للغاية.

في الآونة الأخيرة، تم وضع تقنيات لمسح أنسجة سميكة15،16. هنا يصف لنا تطبيق هذه الأساليب للحصول على صور ثلاثية الأبعاد على نطاق واسع، ومن أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5 التي تشمل نظام microcolumn. الإسقاط سوبسيريبرال الخلايا العصبية المسماة بالتالي إلى الوراء أو بالتعبير عن البروتين الفلورية الخضراء المعززة في الفئران المعدلة وراثيا اجفب كريم 12، والإسقاط القشرية المسماة الخلايا العصبية التي أما رجعية وضع العلامات أو بتعبير تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران17. الإعراب عن بارفالبومين والإعراب عن سوماتوستاتين الخلايا المسماة إيمونوهيستوتشيميستري. يستخدم الأسلوب (جسم مقياس S) أبسكاله18 لجسم تلطيخ التجارب، في حين يتم استخدام أسلوب سيدب (انظر الدماغ العميق)19 لتجارب أخرى. التغلب على الصعوبات المشار إليها أعلاه من أساليب التصوير التقليدية هذه الأساليب وتكشف عن تنظيم طبقة 514دقيقة الخلوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافقت عليها اللجنة التجارب الحيوانية واكو بتبريد والتجربة المؤتلف الوراثية بتبريد سلامة اللجنة جميع الإجراءات التجريبية وتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية من مرافق الحيوانات العلوم الدماغ بتبريد المعهد.

1-التحضير للتصوير الدوائر

  1. تصوير الدائرة19
    1. استخدام أوراق المطاط سيليكون، إعداد دائرة بسمك حوالي 5 مم والطابق لوحات من سمك مختلف. كما أن إعداد أطباق بيتري مع أو بدون من أسفل زجاج (الشكل 1A).
  2. فاصل شريحة
    1. إعداد الفواصل لإجراء عينات، واستخدام أوراق المطاط سيليكون بسمك 0.5 ملم (الشكل 1).

2-الراسم حقن

ملاحظة: إجراء الحقن في بونس (2.1) أو متفوقة والاكيميه (2.2). حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط التسمية بونس في منطقة واسعة من الدماغ بما في ذلك في المناطق البصرية والحركية، في حين حقن في الخلايا العصبية الدماغية دون إسقاط تسميات والاكيميه متفوقة في المجال المرئي. لمراقبة التجارب، حقن المحلول الملحي بدلاً من الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب للحفاظ على حالة معقمة استخدام معدات معقمة وقفازات بلاستيك تنظيفها مع الإيثانول.

  1. جعل الحقن إلى بونس من الفئران الكبار.
    1. رسم 1 ميليلتر الكوليرا المسمى فلوريسسينتلي السمية فرعية ب (25 ميكروغرام/ميليلتر في برنامج تلفزيوني) في محقن هاملتون ز 26.
    2. مكان مضخة حاقن في المحاقن.
    3. وضع المحقن ومضخة على حامل أداة مناور وضعها في أداة ستيريوتاكسيك. إمالة مناور 12 درجة جيدة من المحور العمودي.
    4. تخدير ماوس البالغين الذكور أو الإناث (C57BL/6J أو Tlx3-cre/Ai9) عن طريق حقن بينتوباربيتال الصوديوم إينترابيريتونيلي (60 مغ/كغ من وزن الجسم) أو عن طريق إدارة إيسوفلوراني (2-3%). انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.
    5. ضع الماوس على الأداة ستيريوتاكسيك.
    6. بعناية إزالة الشعر باستخدام شفرة حلاقة لمنع العدوى وقطع 10 ملم من فروة الرأس حيث أن بريجما وامدا مرئية. إدارة 0.1 مل يدوكائين 1% استخدام ماصة. تعيين زاوية الرأس بضبط الموضع العمودي للناطقة باسم الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون بريجما وامدا نفس المستوى z.
    7. ضبط موضع المناور بتحريكه على الصك ستيريوتاكسيك حيث يكون غيض المحاقن قريبة بريجما وتسجيل موقف المناول. سحب المحاقن بتحريك حامل أداة على المناور.
    8. الانتقال المناور 5.4 مم الخلف و 0.4 ملم أفقياً. تقدم المحاقن حيث أن التلميح يقع بالقرب من نقطة دخول في الجمجمة. سحب المحاقن، وعلامة نقطة الإدخال.
    9. في موقف واضح، حفر حفرة قطرها حوالي 1 مم.
    10. إدراج تلميح حقنه من خلال الثقب حيث يكون عمق نصيحة 6.9 ملم أكثر من أن تقاس في بريجما.
    11. حقن 1 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.
    12. إزالة المحاقن من الدماغ.
    13. إذا لزم الأمر، تغطي الدماغ المكشوفة بشظايا صغيرة من هيموستات ميكروفيبريلار ولاصق الفورية.
    14. شطف في الدماغ يتعرض استخدام المحلول الملحي تسليمها مع ماصة لمنع العدوى وخياطة فروة الرأس.
    15. إزالة الماوس من الصك ستيريوتاكسيك. تسمح الماوس للتعافي من التخدير في حاضنة في ˚C 30، عادة ح 1. لا تترك الماوس غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. العودة الماوس لشركة الحيوانات الأخرى بعد قد تعافي تماما.
    16. الحفاظ على الماوس لمدة 3 – 7 أيام.
  2. إجراء الحقن في والاكيميه متفوقة من الفئران الكبار.
    1. إعداد ماصة زجاج نصيحة قطرها 30-50 ميكرون.
    2. قم بتوصيل ماصة زجاجية حقنه هاميلتون عن طريق أنبوب بلاستيكي (الشكل 2A).
    3. تعبئة ماصة زجاجية وأنبوب من البلاستيك، والمحاقن هاملتون بالسائل البارافين.
    4. مكان مضخة حاقن في المحاقن.
    5. ضع ماصة زجاجية على المناور وآماله مناور 60 درجة جيدة من المحور الرأسي (الشكل 2).
    6. أداء 2.1.4–2.1.9. وموقف المناور 1.4 مم الخلفي، الجانبي 0.5 مم إلى لامدا.
    7. ضع فيلم بارافين بلاستيكية صغيرة في الجمجمة، ثم وضع حوالي 1 ميليلتر من الحل الراسم على ذلك. بسرعة تقدم ماصة زجاجية وملء مع مالا يقل عن 0.5 ميليلتر من الحل الراسم.
    8. إدراج الماصة الزجاجية حيث يكون عمق نصيحة 3.0 مم من سطح الدماغ.
    9. حقن 0.5 ميليلتر لتتبع استخدام المضخة في 0.2 ميليلتر/دقيقة.
    10. إزالة ماصة زجاجية من الدماغ.
    11. أداء 2.1.13–2.1.16.

3-التثبيت والتشذيب

  1. حقن الصوديوم بينتوباربيتال (60 مغ/كغ من وزن الجسم) إينترابيريتونيلي ماوس (C57BL/6J أو Tlx3-/Ai9لجنة المساواة العرقية، مع أو بدون حقن التتبع كما هو موضح في الخطوة 2. انتظر حتى الماوس يجعل أي استجابة عندما يتم مقروص ذيله مع الملقط، مما يشير إلى أن يتم تخديره الماوس تماما.
  2. Euthanize الماوس إنسانية قبل بيرفوسينج ترانسكارديالي الماوس20 مع المالحة 0.9 في المائة.
  3. إصلاح الماوس20 من بيرفوسينج بارافورمالدهيد 4% (PFA) في المخزن المؤقت للفوسفات 0.1 M (درجة الحموضة 7.5).
  4. قص فروة الرأس باستخدام مقص لفضح الجمجمة ك وصف20.
    1. قطع خط الوسط الجمجمة المكشوفة باستخدام زوج من مقص. إزالة الجمجمة باستخدام الملقط.
    2. إذا كان من الضروري تمييز موقف بريجما وامدا، قم أولاً بإزالة واحدة نصف الكرة الأرضية للجمجمة. إدراج الإبر التنغستن رقيقة في الدماغ في مواقف بريجما وامدا في الجمجمة المتبقية على الدماغ، ثم إزالة الجمجمة المتبقية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ في برنامج تلفزيوني في 4 ˚C.
  5. القيام بتلوين الأجسام المضادة للخلايا العصبية المثبطة، قطع عينات المخ إلى شرائح.
    1. وضع العينة الدماغ على فيبرتوم.
    2. قطع شرائح يصل إلى 500 ميكرومتر سميكة في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة، والانتقال إلى الخطوة 5 (أبسكاله أسلوب).
  6. إذا كان جسم تلطيخ لا لزوم لها، عينة الدماغ لكتل تريم (تصل إلى 3 مم) باستخدام شفرة حلاقة (الشكل 3)، والانتقال إلى الخطوة 4 (أسلوب سيدب).
    ملاحظة: المخ يمكن تخزين في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية بعد القص أو التشذيب. الأسلوب سيدب الأفضل عندما تلطيخ جسم ليس ضروريا لأنه يتطلب وقتاً أقل من أسلوب هلأبسكا.

4-تطهير دون جسم تلطيخ (أسلوب سيدب)

  1. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 20% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  2. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل α-ثيوجليسيرول 0.5% وسكر الفواكه 40% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  3. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 60% (w/v) واحتضان من أجل ح 4 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  4. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  5. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 100% (w/v) واحتضان من أجل ح 12 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل العينة باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيكي 50 مل يحتوي على 20 مل من 0.5% α-ثيوجليسيرول وسكر 80.2% (w/w) واحتضان من أجل 24 ساعة مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: التعامل مع العينة بعناية للحفاظ على تشوهات صغيرة بقدر الإمكان. عدم احتضان عينات أطول مما ورد، كعينات يمكن أن تصبح بسرعة غير شفاف.
  7. تضمين العينة في دائرة تصوير لشغلها مع الحل سكر 80.2 في المائة (الشكل 1B). إذا لزم الأمر، إصلاح العينة بوضع القطع الصغيرة من المطاط لاصق حولها. إذا كانت الدائرة عميق جداً، وضعت صفيحة الكلمة في الدائرة قبل وضع العينات.
  8. ضع طبق بيتري مع غطاء زجاج في قاعة التصوير ووضع الماء في طبق، والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. ويرد في الجدول 1موجات الإثارة وعوامل الانبعاثات. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه.

5-تطهير مع جسم تلطيخ (أبسكاله أسلوب)

  1. إعداد الكواشف كما هو موضح في الجدول 2.
  2. نقل الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من محلول Sca/eS0 واحتضانها لهم ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية (الشكل 4 باء).
  3. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 36 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
  4. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eB4، واحتضان الشرائح من 24 ساعة مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
  5. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل من محلول Sca/eA2، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
  6. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  7. بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.
  8. احتضان مع الأجسام الأولية (الجدول 3) في 1 مل من أبسكاله حل ح 48-72 في 37 درجة مئوية (الشكل 4) مع الهز لطيف.
  9. بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيك 5 مل باستخدام ملعقة.
  10. تبني في 4 مل من أبسكاله حل ح 2 2 مرات في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  11. بعناية إزالة الشرائح إلى أنبوب بلاستيكي 2 مل باستخدام ملعقة.
  12. احتضان مع المسمى فلوريسسينتلي الثانوي الأجسام المضادة (الجدول للمواد، 1: 100) في 1 مل من أبسكاله حل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية مع الهز لطيف.
  13. بعناية إزالة الشرائح باستخدام ملعقة لأنبوب بلاستيك 5 مل تحتوي على 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 6 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  14. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من أبسكاله الحل واحتضان الشرائح من ح 2 2 مرات مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  15. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل 4% منهاج عمل بيجين، واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  16. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح من ح 1 مع الهز لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  17. إزالة الحل من الأنبوب باستخدام ماصة وإضافة 4 مل الحل Sca/eS4، واحتضان الشرائح من ح 12 مع الهز لطيف في 37 درجة مئوية.
  18. مكان فاصل على شريحة زجاجية ووضع الشرائح في المباعدة وتزج الشرائح مع الحل Sca/eS4. ختم فاصل مع زجاج الغطاء (الشكل 1).
  19. وضع المياه في تغطية الزجاج والصورة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مع غمر مياه تعمل منذ فترة طويلة المسافة والهدف. إذا لزم الأمر، استخدم مرحلة إليه.
    ملاحظة: التحقق من ما إذا كانت الأجزاء العميقة من العينة المسماة المثل إلى أجزاء سطحية للتأكد من عدم وجود تحيز كبير وضع العلامات.
    ملاحظة: يتم وصف الاختراق من الأجسام المضادة التي تم اختبارها في الجدول 3.

6-خلية تحديد الموقع

  1. لكل موقف في الصور الممسوحة ضوئياً، حساب قيم الارتباط باستخدام تصفية صورة ثلاثية الأبعاد14 (الشكل 5A-5D).
  2. تحديد مواقف قمم قيمة الارتباط (الشكل 5).
  3. التحقيق الصور حول قمم لتحديد موقع الخلايا (الشكل 5E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن المسماة الخلايا العصبية القشرية الإسقاط بالتعبير عن تدتوماتو في Tlx3-لجنة المساواة العرقية/Ai9 الفئران المحورة وراثيا وتصور الخلايا العصبية الدماغية دون الإسقاط عن طريق حقن الراسم إلى الوراء CTB488 في بونس. تعرضت للأسلوب سيدب نصف الكرة الأيسر من الدماغ وتفحص باستخدام مجهر اثنين-فوتون مزودة الماء غمر تعمل منذ فترة طويلة المسافة الهدف (25 X، 1.1 N.A.، المسافة العمل 2 مم) ومرحلة إليه. كومة من الصور 401 (512 × 512 بكسل؛ وحجم بكسل = 0.99 ميكرومتر) في خطوة z = 2.8 ميكرومتر...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد قدمنا إجراءات للحصول على صور ثلاثية الأبعاد الواسعة النطاق للمنظمة خلية نوع معين من أنواع الخلايا الرئيسية في طبقة نيوكورتيكال الماوس 5. مقارنة لتلطيخ شريحة التقليدية، يكون الأسلوب أكثر فائدة في تحديد منظمة ثلاثية الأبعاد من اللحاء الجديد. الأسلوب الذي يتيح الحصول على الصور من نطاق أوسع وأعمق مناطق الدماغ مقارنة نموذجية في فيفو 2-فوتون مجهرية أو مجهرية [كنفوكل] التقليدية، وبالتالي، يمكن السماح بالتحليل الشامل للخلوي نيوكورتيكال المنظمة.

خطوة حاسمة للأسلوب هو إيلاج جسم. مجموعة فرعي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر أتسوشي ميياواكي وحماه هيروشي لمشورتها على تجارب هلأبسكا، تشارلز يوكوياما لتحرير المخطوطة، Eriko Ohshima وكيشينو ميوكي للمساعدة التقنية التي تقدمها. هذا العمل كان تدعمها أموال البحوث من بتبريد T.H. ومعونة "البحث العلمي" من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون) من اليابان إلى T.H. (المجالات المبتكرة "Mesoscopic نيوروسيركويتري"؛ 22115004) و س. س. (25890023).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الفئران المعدلة وراثيا Crym-egfpMMRRC012003-UCD
Tlx3-cre الفئران المعدلة وراثياMMRRC36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdفئران الطماطممختبر جاكسونجاكس # 7909
لوح مطاط السيليكونAS ONE6-611-01سمك 0.5 مم
لوح مطاط السيليكونAS ONE6-611-02سمك 1.0 مم
صفائح مطاطية من السيليكونAS ONE6-611-05سمك 3.0 مم
أطباق بتريFalcon351008
غطاءزجاجي ماتسوناميC022241
الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 488 مترافقInvitrogenC22841
الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 555 مترافقInvitrogenC22843
الوحدة الفرعية لسم الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 594 المترافقInvitrogenC22842
الوحدة الفرعية لتوكسين الكوليرا B (مؤتلف) ، Alexa Fluor 647 مترافقInvitrogenC34778
26 G حقنةهاميلتون مضخة
حاقنKD ScientificKDS 310Pons
حاقنKD ScientificKDS 100مناور حقن القولون الفائق
NarishigeSM-15
الصوديوم بنتوباربيتالKyoritsu SeiyakuSomnopentyl
IsofluranePfizer
LidocaineAstraZenecaXylocaine حقن 1٪ مع مثقاب الإبينفرين
Toyo AssociatesHP-200
Avitene hemerillar microfibrillarDavolInc 1010090
AlonalfaDaiichi-SankyoAlonalpha A
الحرير الجراحيEthiconK881H
حاضنةUVPHB-1000 هجين
ماصة زجاجيةDrummond Scientific Company2-000-075
مجتذب القطب الكهربائيشركة Sutter InstrumentCompany P-97
سائل البارافين ،ناكالاي الخفيف tesque26132-35
سالينأوتسوكا1326
بارافورمالدهايدناكالاي تيسك26126-54
إبرة التنغستنInter Medical& Phi ؛ 0.1 * L200 مم
VibratomeLeicaVT1000S
50 مل أنبوب بلاستيكيFalcon352070
& alpha ؛ -thioglycerolNacalai tesque33709-62
D (-) الفركتوزNacalai tesque16315-55
BluTackBostikCKBT-450000
مجهر ثنائي الفوتوننيكونA1RMP
الغمر المائي أهداف مسافة العمل الطويلةنيكونCFI Apo LWD 25XW ، NA 1.1 ، WD 2 مم
الغمر في الماء أهداف مسافة العمل الطويلةنيكونCFI LWD 16XW ، NA 0.8 ، WD 3 مم
المرحلة الآليةCOMSPT100C-50XY
مرشحSemrockFF01-492 / SP-25
مرشحSemrockFF03-525 / 50-25
مرشحسيمروكFF03-575 / 25-25
مرشحسيمروكFF01-629 / 56
مرشحكروماD605 / 55 م
5 مل أنبوب بلاستيكيكواحدVIO-5B
2 مل أنبوب بلاستيكيEppendorf   ؛0030120094
اليورياناكالاي tesque35905-35
Triton X-100Nacalai tesque35501-15
GlyserolSigma-aldrich191612
D (-) -sorbitolWako191-14735
Methyl-&-cyclodextrinTokyo chemical industryM1356
& gamma;- سيكلودكسترينواكو037-10643
N-acetyl-L-hydroxyprolineSkin Essential Actives33996-33-7
DMSONacalai tesque13445-45
مصل الأبقار الألبومينSigma-aldrichA7906
Tween-20 (1.1 جم / مل)Nacalai tesque35624-15
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) عبر الثانوية الممتزة الجسم المضاد ، Alexa Fluor 555InvitrogenA21422
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتز ، Alexa Fluor 555InvitrogenA21428
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي الممتص ، Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488InvitrogenA11029
الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي عالي الامتصاص ، Alexa Fluor 488InvitrogenA21206
المجهر متحد البؤرأوليمبوسFV1000
الغمر في الماء أهداف مسافة العمل الطويلةOlympusXLUMPLFLN 20XW ، NA 1.0 ، WD 2 مم
Anti-NeuNMilliporeMAB377
Anti-NeuNMilliporeABN78
Anti-CTIP2Abcamab18465
Anti-Statb2Abcamab51502
Anti-GAD67MilliporeMAB5406
Anti-GABASigmaA2052
Anti-ParvalbuminSwant235
Anti-ParvalbuminFrontier InstitutePV-Go-Af460
Anti-ParvalbuminSigmaP3088
Anti-ParvalbuminAbcamab11427
مختبرات شبه جزيرةالسوماتوستاتينالمضادة T-4103
Anti-c-FosCalbioChemPC38
مضخة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), aac9462(2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).
  5. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
  6. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
  7. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).
  8. Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).
  9. Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
  10. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).
  11. Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).
  12. Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).
  13. Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149 (4), 899-911 (2012).
  14. Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  15. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
  16. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).
  17. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).
  18. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).
  19. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  21. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).
  22. Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  23. Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631(2016).
  25. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  26. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).
  27. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Three dimensional ImagingMouse NeocortexFluorescent LabelingTissue ClearingConfocal MicroscopyTwo photon MicroscopyRetrograde TracersTransgenic MiceImmunolabelingMicrocolumn Organization

Related Articles