مقالة منهجية

الحفاظ على الثقافات البيولوجية وقياس التعبير الجيني في نيري عافص: نظام عدم-نموذج للتفاعلات بين النبات-الحشرات

6.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58044

⸱

أغسطس 31, 2018

 ,  , 
1Biological Sciences Department, Vanderbilt University

في هذه المقالة

ملخص

المن نيري عافص كولونيزيس على النباتات التي دافعت عن درجة عالية في الأسرة دوجباني (أبوسياناسي)، ويوفر العديد من الفرص لدراسة التفاعلات بين النبات-الحشرات. هنا، نحن نقدم سلسلة من البروتوكولات للحفاظ على النباتات والمن الثقافات، وتوليد وتحليل الجزيئي، والبيانات--أوميك نيري (أ).

الملخص

المن نماذج تجريبية ممتازة لمجموعة متنوعة من المسائل البيولوجية بدءاً من تطور متنافسة وتطوير بوليفينيسمس للمسائل المحيطة بالتفاعلات الحشرة بمصانعها المضيف. تتوفر الموارد الجينية للعديد من أنواع المن، وهي، مع التقدم في تسلسل الجيل القادم، يجري توسيع نطاق الدراسات ترانسكريبتوميك للكائنات الحية غير النموذجية التي تفتقر للجينوم. وعلاوة على ذلك، يمكن جمعها من الميدان وتربيتها في المختبر لاستخدامها في تجارب العضوي والجزيئية لسد الفجوة بين الدراسات الإيكولوجية والجينية الثقافات أولاً بأول. وأخيراً، يمكن الحفاظ على العديد من المن في المختبر في مصانعها المضيف المفضل في دورات الحياة الأبدية، بارثينوجينيك تسمح بإجراء مقارنات بلا تزاوج استنساخ الأنماط الجينية. نيري عافص، المن الدفلى حشيشة اللبن، يوفر هذا نموذج واحد لدراسة التفاعلات الحشرات مع النباتات السامة باستخدام تجارب العضوي والجزيئية على حد سواء. طرق لتوليد والحفاظ على ثقافات النبات والمن في الدفيئة ومختبر الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الاستخراج وتحليل ساتل و حيثياته الترنسكربيتوم الجمعية والتعليق التوضيحي، الترنسكربيتوم التعبير التفاضلية التحليل والتحقق qPCR الأثران عن الجينات المبينة ومناقشتها هنا.

المقدمة

المن من الحشرات الصغيرة، هيميميتابولوس أن استعمار على العائلات النباتية المختلفة في جميع أنحاء العالم. فمميزة للعديد من الميزات، الأكثر لا سيما دورات حياتها المعقدة التي تنطوي على التوالد العذري الدورية وبوليفينيسمس منفصلة، وما تلزم متنافسة التغذوية مع اندوسيمبيونتس البكتريا أو الخميرة التي توفر المواد المغذية المفقودة من نظامهم الغذائي للنبات sap1. بينما المن معظم الاختصاصيين النبات المضيف، بعض الأنواع اختصاصي آفات المحاصيل الهامة، إلحاق أضرار اقتصادية كبيرة في المحاصيل أما مباشرة أو عن طريق الجراثيم والفيروسات أنهم ناقلات2. نشر الجينوم المن الأولى في عام 2010، المن البازلاء أسيرثوسيفون بيسوم3، معلما هاما في دراسة البيولوجيا أولاً بأول لأنه يوفر الموارد الجينية للتصدي للمسائل حول الحشرة تعديلات على أساليب حياة العاشبة، بما في ذلك تلك التي قد تؤدي إلى تحسين استراتيجيات تحكم4. ومنذ ذلك الوقت، تراكمت الموارد المجينية إضافية مع المنشور جينوم مشروح لفول الصويا المن glycines عافص5، والموارد المتاحة للعموم كامل الجينوم للأنواع الثلاثة-المن آخر (ميزوس سيرسي (الكرز الأسود أولاً بأول)، بيرسيك ميزوس (الخوخ-البطاطس أولاً بأول)، بادي رهوبالوسيفوم (المن الكرز الطيور-الشوفان)6. قيمة نوفو دي ترانسكريبتوميك الموارد متاحة كذلك لعدد من الأنواع الأخرى من المن (جوسيبي e.g.,Aphis (المن القطن)7، أفني سيتوبيون (الحبوب أولاً بأول)8، سينارا بينيتابولايفورميس (الصنوبر المن)9، نيري عافص (حشيشة اللبن-الدفلى المن)10).

كما جعلت المن مساهمات دائمة لفهمنا التفاعلات النبات-الحشرات وإيكولوجيا الحياة على النباتات11. منطقة واحدة حيث المن قد قدمت مساهمات مهمة خاصة في فهمنا للإيكولوجيا الكيميائية للتفاعلات النبات المضيف. آكلات الحشرات المتنوعة صريح التكييف للتغلب على دفاعات النبات، وبعضها حتى استمالة الدفاعات النباتية الخاصة يستفيد12،،من1314. على سبيل المثال، هو المن الدفلى حشيشة اللبن، نيري عافص، مشرق الأصفر، الغازية المن وجدت في المناطق المعتدلة والمدارية في جميع أنحاء العالم أن كولونيزيس على النباتات في الأسرة حشيشة اللبن (Apocynaceae). وقد تطورت النباتات في الأسرة دفليه الدفاعات الكيميائية المتنوعة، بما في ذلك مطاط حليبي وجليكوسيدات القلب المعروفة باسم كاردينوليديس، التي تربط الناقل الموجبة Na, K-ATPase وهي الردع الفعال لاختصاصي آكلات العشب15، 16-أخصائيين حشيشة اللبن التعبير عن مختلف وسائل المقاومة إلى كاردينوليديس، وبعض بشكل انتقائي أو سلبية تتراكم أو تعديل كاردينوليديس في أنسجتها كوسيلة لردع اﻻفتراس أو ل فوائد أخرى17. ويعتقد نيري (أ) لعزل كاردينوليديس بهذه الطريقة، على الرغم من أن آليات والمزايا الوظيفية تظل غير واضحة10،18.

ونظرا للموارد الجينية في متناول اليد، يوفر نيري (أ) نموذج تجريبية ممتازة لدراسة الآليات الجزيئية والوراثية التي تشارك في التفاعلات الإيكولوجية الكيماوي بين النباتات السامة المضيفة وعلى أخصائي آكلات العشب. تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن بعض الدراسات أقرب نيري (أ) ركزت على تنحية كاردينوليديس19، منذ ذلك الوقت، قدمت دراسات نيري (أ) رؤى في مجموعة واسعة من المسائل الإيكولوجية والتطورية، بما في ذلك الهيكل الوراثي للحشرات الغازية20 والتفاعل بين التنظيم التصاعدي والتنازلي في كثافة عاشب21. نيري (أ) ومن ثم مرشح جيد كنموذج تجريبي لمجموعة واسعة لا سيما من دراسات التفاعلات الحشرات والنباتات. الحاسمة لنجاح أي دراسة مع نيري (أ) هي عناية ثقافة المن السكان، التي تشمل ثقافة النباتات التي تعتمد عليها المن، فضلا عن جيل بكفاءة عالية الجودة-أوميك البيانات. أن هدفنا توجيه القارئ من خلال على حد سواء. المذكورة أدناه طرق لتوليد والحفاظ على ثقافات النبات والمن في الدفيئة والمختبر والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي الاستخراج، تحليل ساتل، نوفو دي الترنسكربيتوم الجمعية والتعليق التوضيحي، الترنسكربيتوم خلطات أعرب تحليل التعبير التفاضلية، والتحقق qPCR للجينات. وفي حين كتبت هذه الأساليب نيري (أ)، واستزراع عامة، والاستخراج، وأساليب التحليل يمكن أن تمتد إلى مجموعة متنوعة من أنواع المن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-مصنع الثقافات

  1. شراء البذور من أي مورد تجاري أو جمع من النباتات الناضجة في الميدان.
    ملاحظة: هذا البروتوكول مناسبة لمعظم الأنواع المتاحة تجارياً حشيشة اللبن (مثلاً، الصقلاب incarnata، سوري أ، كوراسافيكا أ، فيسوكاربوس جومفوكاربوس). قد تحتاج بعض البذور لتكون طبقات الباردة، ويجب التحقق من التعليمات من المورد البذور.
  2. بذور النباتات في تربة جيرميناتينج غرامة (60-70% غرامة الخث موس، البيرليت، الفيرميكوليت، والحجر الجيري).
    1. ملء علبة شتلات قياسية مع إنبات مزيج التربة؛ ضمان وصول التربة إلى الجزء العلوي من الآبار. في كل بئر، جعل المسافة بادئة لخلق ثقب في التربة عن عميق 3 سم.
    2. ضع بذرة واحدة في كل حفرة والمياه جيد جداً مع يمكن سقي التربة وتغطي البذور ومشبعة.
    3. زراعة البذور في دفيئة (انظر الشروط أدناه، 1.5). المياه بانتظام، يوميا إلى غيره-اليومية؛ ما يكفي للحفاظ على رطوبة التربة إلى مستوى معتدل.
  3. عندما الشتلات نمت على أول مجموعة من الأوراق الكاملة، إعادة وعاء شتلة في بوتينغ عامة مزيج (50 – 60% الخث موس، واللحاء، والحجر الجيري) (الشكل 1أ).
    1. استخدام الأواني جولة 4 بوصة التي تتناسب مع ختم ضيق مع أقفاص كأس. ملء مع التربة بوتينغ عامة تصل إلى حوالي 5 سم تحت الحافة.
    2. إنشاء حفرة في التربة العميقة بما يكفي للوصول إلى الجزء السفلي من الوعاء.
    3. باليد، بلطف حلج القطن الشتلات الناضجة من لها جيدا ووضعه داخل الثقب في وعاء 4 بوصة. تغطية الشتلات بالتربة. المياه جيد جداً.
    4. زراعة النباتات في الدفيئة والمياه بصورة منتظمة، يوميا إلى كل يوم؛ ما يكفي للحفاظ على رطوبة التربة معتدلة.
  4. ظروف الاحتباس الحراري.
    1. تعيين الحرارة الاحتباس الحراري للحفاظ على درجات الحرارة أثناء النهار بين 18 – 28 درجة مئوية، ودرجات الحرارة ليلا بين 16 – 22 درجة مئوية باستخدام إرشادات الشركة المصنعة.
    2. وخلال أشهر الشتاء عندما تكون الأيام أقصر، الملحق الصيفي مع لمبات الصوديوم ذات الضغط العالي ث 600 (12 ح، 08:00 ص-08:00 م).
  5. مراقبة الآفات غير المرغوب فيها (مثل حشرة، المن) بمحلول صابون عضوية ورقي، ومع ذلك، يجب استخدام هذه المنتجات بحذر.
    1. جعل الحل الصابون وفقا لتوصية الشركة المصنعة وتطبيق باستخدام زجاجة رذاذ.
    2. اترك الصابون على النباتات شطف حاء – 4 – 24 بلطف النباتات بالماء لإزالة التطبيق بعد انتهاء ح 4 – 24 الصابون وشطف لهم مع المياه قبل وقت ثانية لاستخدامها مع مختبر الثقافات أولاً بأول.
  6. ثقافة السكان متوسط أولاً بأول على النباتات التي نمت على الأقل 3 – 4 مجموعات من أوراق كاملة، وهي على الأقل 10 سم (الشكل 1ب).

2-المن الثقافات

  1. بدء تشغيل السكان أولاً بأول مختبر من سكان إيسوكلونال موجودة بمعمل أو البدء من المن جمعها من الميدان اتباع الإرشادات الموجودة أدناه.
    1. عند بدء تشغيل مختبر سكان من سكان إيسوكلونال موجودة بمعمل، نقل المن كما هو موضح في 2.3.1–2.3.3.
  2. عندما بدءاً إيسوكلونال الجديدة، السكان جمع الحقل أولاً بأول ووضع مفردة، واستنساخ، والكبار أولاً بأول على مصنع لاستضافة مناسبة كما هو مذكور في "الخطوة 1، 6".
    ملاحظة: قد بدأ السكان من مجنح (آلات) أو أونوينجيد (أبتيروس) بالغين.
    1. يدوياً فحص النباتات من الاحتباس الحراري للآفات غير المرغوب فيها قبل الاستخدام مع المن المختبر. تجميد أي النباتات مع المن غير المرغوب فيها. إذا رغبت في ذلك، استخدام قارورة فراغ إيثانول إزالة حشرة أو غيرها من الآفات.
      ملاحظة: يجب التأكد من شطف النباتات التي عولجت بالصابون قبل الاستخدام كما هو موضح في الخطوة 1.5.2.
    2. أمان تحويل المن الكبار واحد استخدام الرسام أو ماصة فم تم إنشاؤها بواسطة معرف 3/16 "× 1/4" OD الأنابيب البلاستيكية وتلميح ماصة ميليلتر 1,000 تلميح ماصة 2,00 ميليلتر (الشكل 2أ).
    3. أمن تغطية النباتات مع المن مع قفص كأس تم إنشاؤها بواسطة كوب بلاستيك مع أعلى قطع، مغطاة بشبكة الجميلة والمضمون مع الشريط (الشكل 2ب).
    4. ضع النباتات التي تنتشر فيها أولاً بأول في علبة وتبقى في دائرة البيئة الخاضعة للرقابة (ل 16:8، 22 درجة مئوية والرطوبة 70%).
  3. للحفاظ على السكان في الأسهم، نقل المن طازجة وجديدة النباتات أسبوعيا (2.2.1–2.2.3).
    1. أمان تحويل 1 – 3 2nd أو 3rd instar الحوريات والمن الكبار في سن 1 استخدام ماصة فم (الأرقام 2 أ، 3).
      ملاحظة: يتم الاحتفاظ الأرصدة أفضل بنقل الأفراد أونوينجيد.
    2. أمن تغطية النباتات التي تنتشر فيها أولاً بأول مع قفص كأس تم إنشاؤها بواسطة كوب بلاستيك مع أعلى قطع، مغطاة بشبكة الجميلة والمضمون مع الشريط.
    3. وضع النباتات في علبة واحتفظ المن في دائرة للبيئة (ل 16:8، 22 درجة مئوية والرطوبة 70%).
    4. بدلاً من ذلك، إذا كان المطلوب وإذا كان المصنع المضيف نوعية لائقة، استخدام قارورة فراغ إيثانول الحد من السكان ترك استنساخ واحدة فقط الكبار واثنين أو ثلاثة 2nd أو 3rd instar الحوريات.
  4. لإنشاء نفس سن السكان للاستخدام في التجارب، وضع ما يصل إلى 5 أشخاص بالغين (يفضل أونوينجيد) من السكان الأسهم على مصنع جديد لمضيف.
    1. إزالة من البالغين 24 ساعة في وقت لاحق.
    2. حوالي 5 – 7 أيام في وقت لاحق، متى نضجت ذرية1 و إلى سن البلوغ، مكان يصل إلى 5 أشخاص بالغين1 و أونوينجيد على مصنع جديد لمضيف. إزالة من البالغين 24 ساعة في وقت لاحق.
    3. متى نضجت السكان2 و إلى سن البلوغ، هذه الفئة من السكان على استعداد لاستخدامها في التجارب.
      ملاحظة: هذه العملية تضمن أن السكان التجريبية هو تقريبا نفس العمر وهي ولد تقريبا نفس سن الأمهات.
  5. تأكيد أوضح الاختلافات بين خطوط إيسوكلونال القبض على الحقل باستخدام ساتل الوراثي (الموصوفة أدناه، الأبواب 3 و 4).

3. استخراج الحمض النووي

  1. إعداد
    1. استخدام تقنيات عقيمة لتحضير 1 لتر تحلل المخزن المؤقت (0.1 M كلوريد الصوديوم، السكروز 0.2 M، 0.1 M تريس (pH 9.1)، يدتا 0.05 متر مكعب، والحزب الديمقراطي الصربي 0.05%).
    2. الحارة إلى كتلة تدفئة أو مياه حمام إلى 65 درجة مئوية.
  2. تجانس الأنسجة وتحلل
    1. ضع أولاً بأول القرب من الجزء السفلي من أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل العقيمة،.
    2. ضع مدقة العقيمة في الأنبوب مع المن وتزج الجزء السفلي من الأنبوبة في النيتروجين السائل.
      ملاحظة: تفكك النسيج الأمثل يتحقق عندما يتم وضع المن بين المدقة والجانب من الأنبوب.
    3. طحن المن مع المدقة البداية الخلايا.
    4. المن البالغين واحد، استخدم 200 ميليلتر (تقسيم إلى مختبرين 2 × 100 ميليلتر) تحلل المخزن المؤقت. إضافة قاسمة الأولى طحن وريسوسبيند المن سحقت حتى تفككت العينة هو ظاهر، ثم استخدم قاسمة الثانية ليغسل المدقة.
    5. احتضان المن سحقت في المخزن المؤقت لتحلل عند 65 درجة مئوية في كتلة المياه حمام أو الحرارة لمدة 30 دقيقة.
  3. ترسيب الحمض النووي
    1. بينما الأنبوب دافئة، إضافة 14 ميليلتر من 8 م كوك. عكس أنبوب للمزيج. تخزين العينة على الجليد لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا، ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة.
    2. الطرد المركزي في س 13,000 ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل الجديدة مع ماصة. كن حذراً لا إزالة أي من الحطام الأعلاف.
    3. تحسين التصور بيليه الحمض النووي، إضافة 2 ميليلتر الجليكوجين (20 ميكروغرام/مل) للمادة طافية. إذا كان حجم العينة كبيرا بدرجة كافية، قم بحذف هذه الخطوة.
    4. إضافة 200 ميليلتر الباردة الإيثانول الجزيئية الصف 100% للمادة طافية. عكس أنابيب لخلط واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا، ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة.
    5. الطرد المركزي في س 13,000 ز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة الإيثانول بواسطة بيبيتينج.
  4. أغسل الحمض النووي وشطف
    1. إضافة 200 ميليلتر الباردة الإيثانول الجزيئية الصف 70%. ثم نفض الغبار على أنبوب ريسوسبيند وتغسل بيليه.
    2. أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 5 دقائق. بينما تصور بيليه، بعناية إزالة الإيثانول واسطة بيبيتينج وإضافة 200 ميليلتر الباردة الإيثانول الجزيئية الصف 100%.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 13,000 س ز لمدة 5 دقائق. بينما تصور بيليه، بعناية إزالة الإيثانول بيبيتينج.
      ملاحظة: تكرار 100-70-100 الإيثانول يغسل إذا لزم الأمر.
    4. الهواء الجاف الكريات عن 5 – 10 دقيقة مع وضع أنبوب مفتوحة أفقياً على ورقة الأنسجة.
    5. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي في ميليلتر 80 منخفضة الشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، يدتا 0.1 ملم).
    6. تحديد كمية الحمض النووي ريسوسبينديد باستخدام جهاز المطياف الضوئي.
    7. مخزن في 4 درجات مئوية.

4-ساتل PCR وتسلسلها للتنميط أولاً بأول

  1. ترتيب الإشعال F و R المناسبة ساتل التسلسل (1 الجدول20).
    ملاحظة: ينبغي تعديل تسلسل عكس التمهيدي مع تسميات الفلورسنت 5 '6-الاتحاد الماليزي أو 5' 5-ست عشري للسماح لعينات متعدد لتسلسل الصغرية.
  2. إجراء PCR مع عينات من الحمض النووي أولاً بأول واحد (الوارد وصفها في الفقرة 3) والإشعال ساتل المسمى فلوريسسينتلي.
    1. مزيج PCR ردود الفعل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (0.2 ميكرون كل F/R التمهيدي، 2.5 مم مجكل2، 50 – 200 نانوغرام قالب الحمض النووي).
    2. استخدام إعدادات ثيرموسيكلير التالية: تمسخ الأولى في 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، 35 دورات 94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية مقابل 35 s، 72 درجة مئوية ل 45 s، وخطوة نهائية استطالة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. تجمع العينات PCR مع مختلف العلامات الفلورية الحد من عدد عينات متسلسلة وتسلسل العينات الصغرية في منشأة للتنميط.
  4. تحليل الملفات الخام عينة.fsa باستخدام برمجيات التحليل ساتل.

5. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. جمع عينات المن لاستخراج الحمض النووي الريبي في 1.5 مل رناسي/خالية من الدناز أنابيب والتجميد الفوري في نيتروجين سائل.
    ملاحظة: إذا لم يتم تنفيذ الخطوات التالية فورا، يمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
  2. تجانس الأنسجة
    1. مع مدقة العقيمة في الأنبوب مع المن، تجميد في النتروجين السائل عن 10 – 15 ثانية، حتى الأزيز وقف عينة. سحق المن جيدا مع المدقة كما هو موضح في الخطوة 3، 2.
      ملاحظة: تفكك النسيج الأمثل يتحقق عندما يتم وضع المن بين المدقة والجانب من الأنبوب.
    2. في غطاء الدخان، إضافة 800 ميليلتر من جوانيدينيوم استخراج ثيوسيانات-الفينول-كلوروفورم كاشف للعينة (1 – 5 المن الكبار). مجانسة عينات مع مدقة والتخلص من المدقة.
  3. فصل المرحلة
    ملاحظة: ينبغي إجراء جميع الخطوات في غطاء دخان.
    1. احتضان هذه العينات المتجانس لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 160 ميليلتر من كلوروفورم للعينة. هزة بقوة باليد لمدة 15 ثانية.
    2. احتضان لمدة 2-3 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بعد الطرد المركزي، يفصل الخليط إلى 3 طبقات: مرحلة أقل، وأحمر فينول-كلوروفورم والطور البيني مرحلة مائي عديم اللون العلوي. ويظل الجيش الملكي النيبالي حصرا في المرحلة مائي. وسوف يكون حجم مائي ميليلتر ~ 480.
  4. الجيش الملكي النيبالي هطول الأمطار
    1. في غطاء دخان، نقل المرحلة المائية إلى أنبوب طازجة وخالية من رناسي. عدم الإزعاج في المرحلة المتوسطة.
    2. يعجل بالجيش الملكي النيبالي بإضافة 400 ميليلتر من الايزوبروبانول واحتضان العينة في-20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا، ويمكن تخزين العينات في-20 درجة مئوية تصل إلى 24 ساعة.
    3. الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقائق في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
  5. الجيش الملكي النيبالي غسيل وشطف
    1. إزالة المادة طافية؛ لمشاهدة بيليه الجيش الملكي النيبالي.
    2. أغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي مع 1 مل إيثانول 75% في المياه المعالجة ديبك. مزيج من فورتيكسينج بطيئة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 7,500 س ز في 4 درجات مئوية.
    3. كرر الخطوات 5.5.1–5.5.2 للمساعدة على إزالة الملوثات الفينول.
    4. إزالة المادة طافية والهواء الجاف بيليه ل 5-10 دقيقة مع وضع أنبوب مفتوحة أفقياً على مقاعد البدلاء عقيمة. لا تدع بيليه الحمض النووي الريبي جاف تماما.
    5. حل بيليه الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي أو تعامل ديبك. بلطف "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج. احتضان في 55 – 60 درجة مئوية لمدة 10 – 15 دقيقة.

6-رناسيق دي نوفو الترنسكربيتوم الجمعية وشرح وتحليل التعبير التفاضلية

  1. تحليل تركيز عينة الحمض النووي الريبي والجودة باستخدام نظام الغرواني الكهربي شعرية المستندة إلى شرائح.
    ملاحظة: نظام التفريد شعرية القائم على رقاقة هو الأسلوب المفضل من خيار سوى تحليل مع جهاز المطياف الضوئي لأنه يوفر مقياسا أكثر دقة وحساسية لتركيز الحمض النووي الريبي والجودة.
    1. إذا كانت عينات من نوعية مناسبة (≥ رين (عدد سلامة الحمض النووي الريبي) مجموع نانوغرام من ≥ 250 5)، إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي.
      ملاحظة: الأهم من ذلك، لأنه سيتم استخدام هذه البيانات التسلسل لكلا الجمعية الترنسكربيتوم التنميط و حيثياته التعبير، اقرأ المزيد سيؤدي إلى عمق الترنسكربيتوم نوعية أعلى. لتجميع شاملة معقولة باستخدام تكنولوجيا التسلسل إيلومينا bp 100 100 مليون، سيكون نهاية الاقتران ما يلي نقطة انطلاق الموصى بها. مجموع إعداد مكتبة مرناً وتسلسل الحمض النووي الريبي أجريت بمنشأة لتسلسل.
  2. التحقق من جودة ما يلي: استخدام سريع QC22.
  3. الجمع بين كل عينة القراءات وتجميع الترنسكربيتوم نوفو دي استخدام الثالوث23،24 (تريموماتيك تصفية نوعية في تمكين).
  4. صقل الجمعية
    1. استخدام ترانسديكودير25 لتحديد إطارات القراءة المفتوحة (Orf) التي الحد ني أحماض الأمينية 100 في الطول.
    2. تنفيذ عمليات بحث التماثل ل Orf المترجمة ضد Pfam26 وأونيبروت27 قواعد البيانات باستخدام بلاستب28 و29من حمير، على التوالي.
    3. إزالة النصوص البكتيرية (أي تسلسل المترجمة التي انفجرت أفضل كان جين البكتيري مع درجة بت أكثر من 300 وهوية تسلسل الأحماض الأمينية الحد أدنى 50%).
    4. انهيار أي Orf كاملة، المترجمة التي هي على الأقل 99% مماثلة على مستوى الأحماض الأمينية استخدام مؤتمر نزع السلاح--ضرب30.
    5. انهيار Orf المتبقية غير مكتملة، وأن يتم على الأقل 95% مماثلة على صعيد النوكليوتيدات باستخدام القرص المضغوط--ضرب30.
    6. تعيين تسلسل النوكليوتيدات المتبقية مع معرفات فريدة من نوعها وإبلاغها (مثلاً، أفني 0001).
  5. تقييم مدى اكتمال الجمعية المكرر، استخدام رابطة (http://busco.ezlab.org/) وفي dataset الجينات المفصليات31.
  6. الشرح الترنسكربيتوم
    1. أولاً، تعليق توضيحي الترنسكربيتوم المكررة باستخدام حمير ضد ال26،قاعدة بيانات فام29.
    2. وثانيا، تعليم الترنسكربيتوم استخدام بلاستب ضد ال27،قاعدة بيانات أونيبروت28.
    3. وثالثاً، تعليم الترنسكربيتوم استخدام بلاستب ضد تسلسل الترميز المحدد من الحشرات جينومات المنشورة، المشروح.
    4. آخر، إضافة تعليق توضيحي الترنسكربيتوم باستخدام بلاستب ضد قاعدة البروتين المن البازلاء فقط.
    5. استخدام ترينوتاتي لإنشاء التعليقات التوضيحية بالذهاب من الانضمام أونيبروت.
    6. استخدم ترينوتاتي لتنظيم جميع نتائج تعليق توضيحي إلى قاعدة بيانات SQLite وإنشاء تقرير بشرح.
  7. تحليل التعبير التفاضلية
    ملاحظة: باستخدام الترنسكربيتوم المكررة كمرجع، محاذاة، والتحديد الكمي لكل مكتبة على حدة.
    1. استخدم تريموماتيك لتصفية نوعية وتقليم قراءة الملفات الأصلية32.
      ملاحظة: إذا كان إجراء هذه الخطوة بعد إنشاء جمعية ثالوث، واحد قد بدلاً من ذلك استخدم الإخراج تريموماتيك من تلك الخطوة.
    2. إجراء التحالفات المحلية لكل عينة باستخدام Bowtie233.
    3. استخراج قراءة التهم من كل عينة على حدة باستخدام سامتولس34.
    4. حساب التعبير التفاضلية بين عينات اهتمام باستخدام DESeq2 مع المعلمات الافتراضية وتناسب حدودي35.

7-قبكر التحقق من "الجينات وأعرب خلطات"

ملاحظة: إذا كان المستخدمين مهتمة بالجينات أعرب متفاوتاً من التجارب التي تقوم بها رناسيق، يمكن استخدام البروتوكول التالي للتحقق من أنماط التعبير التفاضلية.

  1. إنشاء عينات الحمض النووي الريبي كما هو موضح أعلاه (الخطوة 5).
  2. كوانتيتاتي الاستخراج الجيش الملكي النيبالي باستخدام جهاز المطياف الضوئي التحقق من النوعية والحصول على التركيز.
  3. توليف كدنا العينات باستخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً حسب توصية الشركة المصنعة.
  4. تحديد كفاءات التمهيدي لجينات اهتمام لضمان دقة شقين [بكر] تضخيم.
    1. استناداً إلى الأصل تركيزات الحمض النووي الريبي، إجراء تخفيف المسلسل (101) للحصول على 3 كدنا تركيزات.
    2. باستخدام مزيج رئيسي PCR كمي، مزيج qPCR ثلاث ردود الفعل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة باستخدام ثلاثة تركيزات التمهيدي (مثلاً 100 نانومتر، 200 نانومتر، 300 نانومتر) مع ثلاثة تركيزات كدنا المخفف متسلسل (مثلاً 0.1 نانوغرام/ميليلتر، 10 نانوغرام/ميليلتر، 100 نانوغرام/ميليلتر).
    3. لكل الجينات المستهدفة، حساب انحدار الخط الذي تم إنشاؤه باستخدام قيمt C يعني لكل عينة المتغيرات التابعة والسجل (تركيز كدنا) المتغيرات المستقلة (مجموع النقاط الثلاث) (م).
    4. تستخدم المعادلة التالية لحساب كفاءة التمهيدي (ه) حيث m هو منحدر المحسوبة في 7.4.3:
      E = 10^(-1/m)
      ملاحظة: الفعالية التمهيدي بين 90-110% مناسبة للتحليلات. تضمن هذه العملية التضخيم تساوي جميع الجينات المدرجة في الحسابات.
  5. استخدم الأسلوبt ΔΔC مع جين التدبير المنزلي لقياس التعبير التفاضلية للجينات للفائدة36.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

مصنع الثقافات: بذور سوف يستغرق ما يقرب من أسبوعين إلى أربعة أسابيع، اعتماداً على الموسم، وتنمو كبيرة ما يكفي لتكون إعادة محفوظ بوعاء (الشكل 1أ). سوف تأخذ الشتلات إعادة أصيص آخر أسبوعين إلى أربعة أسابيع تنمو إلى حجم أمثل المن الثقافات (الشكل 1ب).

المن الثقافات: الكبار نيري (أ) تتميز ببعض كودا مظ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد اعترف منذ وقت طويل أن أبوسيماتيك نيري (أ) يمكن أن توفر أفكاراً في الأنماط والآليات لمقاومة الدفاعات النباتية ولا سيما الكيميائية تنحية18،37. ظهرت مؤخرا عددا من الموارد الجينية نيري (أ)10، تتيح فرصاً جديدة للدراسات الجينومية الإيكولوجية والوظيفية التي تستخدم نيري (أ) كنموذج. أننا مخطط البروتوكولات الأساسية في الثقافة أولاً بأول، والنبات، والتقنيات الجزيئية/الجينوم، مع الافتراض بأن العمل المقبل بشأن هذه الأنواع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

نود أن نشكر ميشيل القمر (جامعة فاندربيلت) للحصول على المساعدة مع التصوير الفوتوغرافي. جامعة فاندربيلت تقدم الدعم للسلطة الفلسطينية وسلب معتمد من قبل 1445197 دج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صن جرو فافارد ميكس إنباتهامرت إنترناشيونال10-0952-2
صن جرو فارد 3B / مترو ميكسهامرت إنترناشيونال10-0951-2
2 × 4 بوصة وعاء قياسي دائريأواني أندرسون1503
دريم تك بوليميرازالحمض النووي ثيرموفيشر العلميEP0701
تريزولثيرموفيشر ساینتفيك15596026
SuperScript® III طقم توليف الخيط الأولThermoFisher Scientific18080051
Power SYBR Green PCR Master MixThermoFisher Scientific4367659

المراجع

  1. Brisson, J. A., Stern, D. L. The pea aphid, Acyrthosiphon pisum.: an emerging genomic model system for ecological, developmental and evolutionary studies. BioEssays. 28, 747-755 (2006).
  2. Dixon, A. F. G. Aphid Ecology: An Optimization Approach. , Springer. Netherlands. (1985).
  3. Consortium, T. I. A. G. Genome Sequence of the Pea Aphid Acyrthosiphon pisum. PLoS Biology. , 1000313(2010).
  4. Srinivasan, D. G., Brisson, J. A. Aphids: A Model for Polyphenism and Epigenetics. Genetics Research International. 2012, 1-12 (2012).
  5. Wenger, J. A., et al. Whole genome sequence of the soybean aphid, Aphis glycines. Insect Biochememistry and Molecular Biology. , 1-10 (2017).
  6. Aphidbase. Genouest.org. , Available from: bipaa.genouest.org/is/aphidbase/ (2018).
  7. Li, Z. -Q., et al. Ecological adaption analysis of the cotton aphid (Aphis gossypii) in different phenotypes by transcriptome comparison. PLoS ONE. 8, 83180(2013).
  8. Wang, D., Liu, Q., Jones, H. D., Bruce, T., Xia, L. Comparative transcriptomic analyses revealed divergences of two agriculturally important aphid species. BMC Genomics. 15 (1), 1023-1024 (2014).
  9. Wu, S., et al. De novo characterization of the pine aphid Cinara pinitabulaeformis Zhang et Zhang transcriptome and analysis of genes relevant to pesticides. PLoS ONE. 12, 0178496-0178517 (2017).
  10. Birnbaum, S. S. L., Rinker, D. C., Gerardo, N. M., Abbot, P. Transcriptional profile and differential fitness in a specialist milkweed insect across host plants varying in toxicity. Molecular Ecology. , (2017).
  11. Dixon, A. F. G. Insect Herbivore-Host Dynamics. , Cambridge University Press. Cambridge. (2005).
  12. Goggin, F. L. Plant-aphid interactions: molecular and ecological perspectives. Current Opinion in Plant Biology. 10, 399-408 (2007).
  13. Will, T., Furch, A., Zimmermann, M. R. How phloem-feeding insects face the challenge of phloem-located defenses. Frontiers in Plant Science. 4, 1-12 (2013).
  14. Webster, B. The role of olfaction in aphid host location. Physiological Entomology. 37, 10-18 (2012).
  15. Agrawal, A. A., Petschenka, G., Bingham, R. A., Weber, M. G., Rasmann, S. Toxic cardenolides: chemical ecology and coevolution of specialized plant-herbivore interactions. New Phytologist. 194, 28-45 (2012).
  16. Dobler, S., Petschenka, G., Pankoke, H. Coping with toxic plant compounds- the insect's perspective on iridoid glycosides and cardenolides. Phytochemistry. 72, 1593-1604 (2011).
  17. Opitz, S. E. W., Müller, C. Plant chemistry and insect sequestration. Chemoecology. 19, 117-154 (2009).
  18. Birnbaum, S. S. L., Abbot, P. Insect adaptations toward plant toxins in milkweed-herbivores systems - a review. Entomologia Experimentalis et Applicata. 58, 579-610 (2018).
  19. Rothschild, M., von Euw, J., Reichstein, T. Cardiac glycosides in the oleander aphid, Aphis nerii. Journal of Insect Physiology. 16, 1141-1145 (1970).
  20. Harrison, J. S., Mondor, E. B. Evidence for an invasive aphid 'superclone': extremely low genetic diversity in oleander aphid (Aphis nerii) populations in the southern United States. PLoS ONE. 6, 17524(2011).
  21. Mooney, K. A., Halitschke, R., Kessler, A., Agrawal, A. A. Evolutionary trade-offs in plants mediate the strength of trophic cascades. Science. 327, 1642-1644 (2010).
  22. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc (2010).
  23. Grabherr, M. G., et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome. Nature Biotechnology. 29, 644-652 (2011).
  24. Haas, B. J., et al. De novo transcript sequence reconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for reference generation and analysis. Nature Protocols. 8, 1494-1512 (2013).
  25. Transdecoder. , Available from: http://transdecoder.sf.net (2018).
  26. Finn, R. D., et al. The Pfam protein families database: towards a more sustainable future. Nucleic Acids Research. 44, Database Issue 279-285 (2016).
  27. The UniProt Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Research. 45, 158-169 (2017).
  28. Johnson, M., et al. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 1 (36), 5-9 (2008).
  29. Hmmer.org. , Available from: http://hmmer.org (2018).
  30. Fu, L., Niu, B., Zhu, Z., Wu, S., Li, W. CD-HIT: accelerated for clustering the next generation sequencing data. Bioinformatics. 28 (23), 3150-3152 (2012).
  31. Simão, F. A., Waterhouse, R. M., Ioannidis, P., Kriventseva, E. V., Zdobnov, E. M. BUSCO: assessing genome assembly and annotation completeness with single-copy orthologs. Bioinformatics. 31, 3210-3212 (2015).
  32. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, 2114-2120 (2014).
  33. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9, 357-359 (2012).
  34. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
  35. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 31(2014).
  36. Rieu, I., Powers, S. J. Real-time quantitative RT-PCR: design, calculations, and statistics. Plant Cell. 21, 1031-1033 (2009).
  37. Malcolm, S. B. Chemical defence in chewing and sucking insect herbivores: plant-derived cardenolides in the monarch butterfly and oleander aphid. Chemoecology. 1, 12-21 (1990).
  38. Agrawal, A. A., Underwood, N., Stinchcombe, J. R. Intraspecific variation in the strength of density dependence in aphid populations. Ecological Entomology. 29, 521-526 (2004).
  39. Zehnder, C. B., Hunter, M. D. A comparison of maternal effects and current environment on vital rates of Aphis nerii, the milkweed-oleander aphid. Ecological Entomology. 32, 172-180 (2007).
  40. Hartbauer, M. Collective defense of Aphis nerii and Uroleucon hypochoeridis (Homoptera, Aphididae) against natural enemies. PLoS ONE. 5, 10417(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA RNA qPCR

مقالات ذات صلة