يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام

12.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58077

⸱

نوفمبر 16, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Vienna, 2Laboratory of Experimental Allergy, Division of Immunology, Allergy and Infectious Diseases, Department of Dermatology, Medical University of Vienna

في هذه المقالة

ملخص

على توسيع عدد الحيوية رواية هندسيا لإصلاح آفات العظام الكبيرة بشكل مستمر بهدف تعزيز شفاء العظام والتغلب على التعقيدات المرتبطة بزرع العظام. وهنا، نقدم استراتيجية متعددة التخصصات للتجارب قبل الإكلينيكية توافق مع الحياة الحيوية لإصلاح العظام.

الملخص

كسور العظام الكبيرة غير الاتحاد تحديا كبيرا في جراحة العظام. على الرغم من السيارات وترقيع العظام متمكنة ممتازة لشفاء هذه الآفات، هناك المضاعفات المحتملة مع استخدامها. وهكذا، وضع العلماء المواد الحيوية الاصطناعية، متوافق حيويا للتغلب على هذه المشاكل. في هذه الدراسة، نقدم منصة متعددة التخصصات لتقييم المواد الحيوية لإصلاح العظام. ونحن يجمع بين الخبرة من عظم علم الأحياء وعلم المناعة وضع النظام الأساسي بما في ذلك في المختبر اوستيوكلاست (OC) وفحوصات osteoblast (OB) و في فيفو نماذج الماوس إصلاح العظام، الاستمناع وتحسسيه. ونحن لشرح كيفية إجراء التجارب وتلخيص النتائج وتقرير عن مادة بيولوجية توافق مع الحياة. على وجه الخصوص، نحن اختبار صلاحية المكشوف والتمايز، وتمعدن وصلاحية قائد والتمايز في سياق الأقراص β-tricalcium الفوسفات (β-TCP). نحن أيضا اختبار رغوة (β-TCP/ج) β-TCP/الكولاجين الذي مادة متوفرة تجارياً تستخدم سريرياً لإصلاح العظام في نموذج ماوس عيب العظام كالفاريال الحجم الحرج لتحديد الآثار في المرحلة المبكرة من التئام العظام. في تجارب موازية، يمكننا تقييم الاستجابات المناعية والحساسية في الفئران. نهجنا ينشئ ملف تعريف توافق البيولوجي لمادة بيولوجية العظام مع مجموعة من المعلمات اللازمة للتنبؤ بتوافق مع الحياة الحيوية المستخدمة لشفاء العظام وإصلاح في المرضى.

المقدمة

إصلاح العظام هو عملية معقدة تبدأ بتشكيل ورم دموي، التهاب، callus تشكيل وثم يعيد البناء1،2. تجديد العظام المحتملة غير محدود بحجم1،3كسر العظام. على سبيل المثال، قد لا تشفي كسور العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات النفسية أو السرطان أو مرض هشاشة العظام وتسمى كسور العظام غير الأعضاء في الاتحاد. غالباً ما تتطلب هذه الآفات العظام العلاج تعزيز إصلاح صحي العظام الفسيولوجية وتجديدها. حاليا، هو زرع العظام أوتوجرافت و allograft نهج خيار4 مع إجراءات استبدال العظام 2.2 مليون سنوياً5. على الرغم من أن هذه الإجراءات قد ارتفاع نسبة نجاح، قد يكون هناك مضاعفات، على سبيل المثال، التوافر المحدود للعظام والإصابة، والجهات المانحة الموقع الاعتلال، ورفض4. بدائل جديدة لهندسة الأنسجة العظام يجري التصدي لهذه التحديات.

تصميم الحيوية على أساس البوليمرات الطبيعية أو الاصطناعية أو bioceramics أو المعادن في تركيبة مع الخلايا والجزيئات النشطة بيولوجيا في ارتفاع6. فهمنا الحالي للعظام الفسيولوجية الشفاء والشفاء في سياق الحيوية يعتمد على عوامل متعددة مثل الخصائص الميكانيكية والعوامل المحلية والنظم متعددة بما في ذلك الخلايا من التداول وكسر موقع7 ،،من89. الحيوية لتجديد العظام وتهدف إلى تعزيز أوستيوجينيسيتي ويندمج10 ومثالي متوافق حيويا والقابلة للتحلل، والمساميه (تشجيع الهجرة الخلية والأكسجين والمواد الغذائية). أنهم أيضا بحاجة إلى أن تكون قوية بما فيه الكفاية لدعم موقع الكسر لتخفيف الألم. بالإضافة إلى ذلك، العوامل التحريضية المطلوبة للشروع في عملية الشفاء. ومع ذلك، إذا كان يدفع مادة بيولوجية التهاب المفرط واستجابات حساسية، هذا قد تحد من أو تمنع العظام شفاء11،12. وهكذا، نهج متعدد التخصصات اللازمة لتقييم المواد الحيوية المتقدمة لإصلاح العظام.

في هذه الدراسة، ونحن تقديم تقييم قبل الإكلينيكية للمواد التمثيلية، فيتس 1) أورثوفيتا الرغوة وبديل الاختلاس عظم اسفنجي متاحة تجارياً يتألف من tricalcium الفوسفات تتكون من الحجم نانومتر نقية β-tricalcium جزيئات الفوسفات (β-TCP) و 1 نوع الكولاجين البقري (ج) (β-TCP/C رغوة) و 2) الأقراص β-TCP. هنا، نحن توضيح اختبار توافق مع الحياة الحيوية هذه استخدام osteoblast الأولية (OB) وفحوصات اوستيوكلاست (OC)، نموذجا في فيفو لإصلاح العظام، تقييما مناعية تتألف في المختبر انتشار اللمفاويات T و إنتاج سيتوكين، و في فيفو الاستمناع وتحسسيه، كما ذكر سابقا13.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الإجراءات التي تم القيام به مع الفئران بالب/ج جميع المبادئ التوجيهية التالية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية لوزارة التعليم والعلوم والأبحاث النمساوي وأقرتها اللجنة المعنية بأخلاقيات وزارة التعليم والعلوم النمساوية والبحوث.

1-الأساسي للماوس OB الثقافة

  1. الحريق المكشوف في معزل عن الماوس الولدان كالفاريا استخدام الهضم الأنزيمي
    1. Euthanize 1-2 اليوم القديمة الجراء الولدان (60 في المجموع) بقطع الرأس والرؤساء في طبق بتري مع العقيمة 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
    2. عقد الرئيس بمؤخر العنق، وقطع الجلد باستخدام مقص معقم بعيداً. جداً كالفاريوم واسطة خارقة لأنها (حوالي 0.1 – 0.3 مم) مع زوج من مقص ثم إدراجها تحت كالفاريوم في مؤخرة الرأس عند قاعدة الجمجمة، وقطع على طول حافة كالفاريال أفقياً من الخلف إلى الأمام فوق الأذنين ومن ثم abov (ه) جسر الآنف (الشكل 1).
    3. احتضان كالفاريا تشريح مع 8 مل من محلول الهضم تصفية تعقيم (300 وحدة/مل كولاجيناز النوع الرابع و 2.14 وحدة/مل ديسباسي الثاني حله في α-الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (α-MEM)) في أنبوب 50 مل مخروطية في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حاضنة تهتز في يهز 200 دور/دقيقة.
    4. تجاهل المادة طافية الأولى وكرر الإجراء الهضم ثلاث مرات مع 8 مل من محلول الهضم. جمع المادة طافية تحتوي على الخلايا بعد كل خطوة من خطوات عملية الهضم وإضافته إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تخزين 50 مل الأنبوبة المخروطية مع الخلايا في حمام الماء المثلج حتى يتم إكمال عملية الهضم (حوالي 40 دقيقة).
    5. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية (مع تعلق على فراغ مضخة ماصة باستور) وريسوسبيند في 40 مل من العظام النمو المتوسطة (BGM) التي تتضمن α-الفنزويلية مع 10% معطل الحرارة الجنيني البقري المصل (FBS)، و 1% الحل البنسلين والستربتوميسين. ثم أضف 10 مل تعليق خلية إلى 4 لوحات زراعة الأنسجة (10 سم).
    6. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 حتى التقاء (2 – 3 أيام).
    7. في التقاء، نضح المتوسطة القديمة وغسل الأطباق زراعة الأنسجة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x (37 درجة مئوية). ثم نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل محلول التربسين 1 x يحتوي على 0.5% حمض الإيثيلين (يدتا) لكل لوحة زراعة الأنسجة 10 سم.
    8. احتضان ثقافة 4 اللوحات في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 5 دقائق ومن ثم تحقق اللوحات مع مجهر مقلوب خفيفة لضمان أن يتم فصل الخلايا من البلاستيك. ثم نقل جميع خلايا المعلقات (مجموع 8 مل) إلى أنبوب 50 مل مخروطية التي تحتوي على 10 مل BGM الطازجة. تغسل كل لوحة مع 5 مل الطازجة BGM ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل نفسه.
    9. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 16 مل BGM الطازجة. إعداد 16 10 سم زراعة الأنسجة لوحات جديدة (تقسيم 1:4) التي تحتوي على 9 مل BGM. أضف 1 مل تعليق خلية لكل لوحة.
    10. كرر الخطوات 1.1.6. ل 1.1.8.
    11. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند في 10 مل BGM الطازجة. عد الخلايا وحساب تركيز الخلية.
      ملاحظة: هذا الإجراء بإنشاء حوالي 7.5 – 8.3 × 105 خلايا/ألجرو.
    12. الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، ونضح المادة طافية وريسوسبيند في تجميد المتوسطة التي تحتوي على 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]), α-الفنزويلية 40% و 50% FBS. نقل 1.5 مل تعليق خلية إلى كريوفيالس 2 مل بإجمالي 2 × 106 خلايا للقنينة الواحدة.
    13. فلاش تجميد القنينات في النتروجين السائل للتخزين على المدى الطويل في خزان النتروجين سائل. استخدام الخلايا في غضون سنة للتأكد من الأداء الوظيفي الكامل. استخدم هذه OBs الأولية لتقييم انتشار (الخطوة 1، 2)، التمايز (فحوصات الب: الخطوة 1، 4.، 1.5.) والتمعدن (الخطوة 1.6.) حضور الحيوية. تستخدم هذه الخلايا لنضوج السلائف OC المشتقة من نخاع العظام في ثقافة المشارك (الخطوة 2، 3).
  2. تحليل انتشار الحريق المكشوف
    1. احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 مم في 1 مل BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة لوحات قياسية زراعة الأنسجة استخدام هذه الأولية لعناصر التحكم وتعليق لوحات الثقافة للعينات مادة بيولوجية لما قبل تجنب مرفق الخليوي للبلاستيك.
    2. نضح المتوسطة ما قبل الحضانة وثم ريسوسبيند OBs الماوس الأساسي في BGM. إضافة 4.4 × 104 OBs/سم2 على أقراص قبل المحتضنة β-برنامج التعاون الفني في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا ومجموعة مراقبة، في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا (1 مل/جيد). سوف نعلق بس للوحة زراعة الأنسجة أو مادة بيولوجية.
    3. احتضان لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. خلال فترة الحضانة، تغيير في المتوسط كل 2 – 3 أيام وإضافة 1 مل BGM جديدة لكل بئر.
    4. لتقييم انتشار الحريق المكشوف، نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني في أيام 7 و 14 لآبار جديدة لاستبعاد الإشارات من الخلايا المزروعة في لوحة الثقافة تعليق.
    5. نضح المتوسطة القديمة، وإضافة 0.5 مل BGM (37 درجة مئوية)، واحتضان ثقافة لوحات لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. ثم قم بإضافة ميليلتر 55 10 × خلية انتشار كاشف (01:10 إضعاف) مباشرة إلى ثقافة جيدا. الفراغات، بإعداد ثلاثة آبار المحتوية على 0.5 مل BGM وميليلتر 55 من الكاشف انتشار الخلية 10 x. احتضان كل الألواح لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    6. سحب ونقل 150 ميليلتر من المادة طافية من كل بئر في لوحة سوداء 96-جيدا وقراءة الأسفار مع الإثارة في 560 نانومتر والانبعاثات في 590 نانومتر. طرح قراءات فارغة من قراءات العينة.
  3. فحوصات والتمايز والتمعدن OB
    1. قبل احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 ملم في 1 مل BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة لوحات قياسية زراعة الأنسجة استخدام هذه لضوابط وتعليق لوحات الثقافة للعينات مادة بيولوجية لتجنب مرفق خلية للبلاستيك.
    2. نضح المتوسطة ما قبل الحضانة وثم ريسوسبيند OBs الماوس الأساسي في BGM. إضافة 8.8 × 104 OBs/سم2 على أقراص قبل المحتضنة β-برنامج التعاون الفني في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا ومجموعة مراقبة، في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا (1 مل/جيد). سوف نعلق بس للوحة زراعة الأنسجة أو العينة مادة بيولوجية.
    3. استبدال BGM مع 1 مل من التمعدن osteogenic المتوسطة (مم) التي تحتوي على BGM و 50 ميكروغرام/ملليلتر حمض الأسكوربيك و 5 مم β-جليسيروفوسفاتي 24 ساعة بعد إضافة OBs واحتضان لمدة 14 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. قم بتغيير كل 2 – 3 أيام مع 1 مل مم الطازجة المتوسطة لكل بئر.
  4. تمايز OB يقيمها النشاط الفوسفاتيز القلوية (حزب العمال الأسترالي) من خلية ليساتيس
    1. لقياس نشاط حزب العمال الأسترالي في اليوم السابع بعد إضافة مم، نضح المتوسطة الثقافة من الآبار ويغسل مع 1 مل من س 1 العقيمة PBS (37 درجة مئوية). نضح بعناية برنامج تلفزيوني للسماح للخلايا المرفقة لتبقى على زراعة الأنسجة من البلاستيك أو مادة بيولوجية وتجميد الألواح في-80 درجة مئوية.
    2. بعد 24 ساعة (أو ما يصل إلى 2 أسابيع)، ذوبان الجليد في لوحة التحكم زراعة الأنسجة ومادة بيولوجية تعليق لوحة الثقافة في درجة حرارة الغرفة (RT) للتحضير لتحلل OB. لعينات مادة بيولوجية، نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني في صفيحة تعليق ثقافة جديدة لاستبعاد الخلايا تعلق على اللوحة. إضافة ميليلتر 75 الواحدة من 1 × العازلة تحلل الخلية جيدا لكل اللوحات. اهتز لوحات لمدة 5 دقائق على شاكر في 400 يهز/دقيقة.
    3. نقل الخلية ليستي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 0.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 6 دقيقة في RT لإزالة الحطام. إضافة 50 ميكروليتر من عينة خلية المادة طافية ليستي لوح أسود 96-جيدا، ثم قم بإضافة 50 ميليلتر حل تتألف من 200 ميكرومتر فوسفات 6,8-ديفلورو-4-ميثيلومبيليفيريل (ديفموب) فلوروجينيك الركازة المذاب في 2 × الب المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني 10) لكل بئر. إعداد بئرين فارغة مع 100 ميليلتر من محلول 1:1 يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل الخلية x 1 و x 2 الب المخزن المؤقت.
    4. إعداد معايير مرجعية 8 مع 100 ميكروليتر/جيدا مع 6,8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (ديفمو) تتراوح بين 0.5 إلى 200 ميكرومتر المذابة في محلول 1:1 يحتوي على المخزن المؤقت لتحلل الخلية x 1 و 2 x الب العازلة لإنشاء منحنى مرجعية قياسية.
    5. احتضان اللوحة السوداء في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومن ثم قراءة الأسفار مع الإثارة في 358 نيوتن متر والانبعاثات في 455 نانومتر. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.
    6. تطبيع نشاط إنزيم الب من ليساتيس الخلية إلى المبلغ الإجمالي للبروتين باستخدام مقايسة اللونية لتركيز البروتين. إعداد ألبومين المصل البقري معايير مرجعية البروتين (BSA) في طائفة من 0.05 – 2.5 ميكروغرام/ميليلتر حله في 1 × العازلة تحلل الخلية لتوليد منحنى قياسي.
    7. إعداد نموذج الخلية ليساتيس ومستويات البروتين جيش صرب البوسنة في التكرارات. إضافة 5 ميليلتر من الخلية عينة ليستي أو 5 ميليلتر من البروتين جيش صرب البوسنة الموحدة في لوحة 96-جيدا ثم قم بإضافة 25 ميليلتر من الكاشف A ' و 200 ميليلتر من كاشف المجموعة باء عن بئرين فارغة مع 5 ميليلتر من 1 × العازلة تحلل الخلية. احتضان اللوحات على RT لمدة 15 دقيقة ومن ثم قراءة امتصاص في 690 نانومتر. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.
  5. OB التمايز تلطيخ الب في خلية ثقافة تقييم
    1. وصمة عار الب في OBs المستزرعة في اليوم السابع بعد إضافة ملم في لوحة تحكم زراعة الأنسجة ومادة بيولوجية في لوحة ثقافة تعليق.
    2. نضح المتوسطة الثقافة من الآبار واستبدله 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية). نضح في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا التي تفرخ لهم في 0.5 مل فورمالين 10% مخزنة في RT لمدة 1 دقيقة.
    3. نضح الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وإضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (0.05% Tween20 في برنامج تلفزيوني س 1).
    4. حل تيترازوليوم (بسب/NBT) فوسفات 5-bromo-4-chloro-3-indolyl/نيترو الأزرق واحد الركازة الكمبيوتر اللوحي في 10 مل من الماء عالي النقاوة ودوامه حتى يذوب تماما. يجب حمايته من الضوء الحل واستخدامها ضمن ح 2.
    5. نضح في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واستبدال مع 0.5 مل من محلول الركازة بسب/NBT واحتضان اللوحة في RT في الظلام لأدنى 10 Aspirate الحل المصبوغة واستبدال مع 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
    6. نقل الأقراص β-TCP الملون في بئر جديدة وتفحص لوحات ملطخة بحزب العمال الأسترالي مع ماسح ضوئي مسطح تقليدية إلى تلطيخ الب السجل.
  6. التمعدن OB يقيمها تلطيخ مع الأليزارين الأحمر S (جمعية الإغاثة اﻷرمنية)
    1. نضح المتوسطة الثقافة من الآبار التي تحتوي على أيام OBs 14 الابتدائي بعد إضافة ملم وشطف مرتين مع 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت أسبيراتي برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا عن طريق إضافة مخزنة 0.5 مل من ال 10% فورمالين الحل في RT لمدة 10 دقائق.
    2. نضح الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة، ويغسل مرتين مع 0.5 مل من الماء عالي النقاوة.
    3. ل OBs الثابتة، إضافة 0.25 مل من 40 مم أرس المصبوغة الحل (pH 4.2) المذابة في الماء عالي النقاوة واحتضان اللوحة على RT لمدة 10 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة.
    4. نضح الحل المصبوغة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة والشطف مع 1 مل من الماء عالي النقاوة. كرر هذه الخطوة 5 – 10 مرات لإزالة غير محدد تلطيخ.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون الحل الشطف دون لون.
    5. نضح الماء عالي النقاوة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. احتضان اللوحة على RT لمدة 10 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة.
    6. نضح برنامج تلفزيوني ونقل الأقراص β-TCP الملون إلى بئر جديد وفحص اللوحات مع الماسح ضوئي مسطح التمعدن سجل.
    7. إضافة 0.25 مل محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% واحتضان اللوحة على RT لمدة 15 دقيقة على شاكر في يهز 100/دقيقة لاستخراج الصبغة جمعية الإغاثة اﻷرمنية.
    8. نقل سوبيرناتانتس إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت
    9. إضافة 10% محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم إلى المقتطفات بتخفيف نسبة 01:10 – 01:20 وإضافة العينات (300 ميليلتر) في لوحة 96-جيدا بما في ذلك بئرين فارغة تحتوي على كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% فقط.
    10. إعداد 7 معايير مرجعية ARS تتراوح بين 4 إلى 400 ميكرون بتمييع ARS 40 مم تلطيخ الحل (pH 4.2) مع محلول كلوريد سيتيلبيريدينيوم 10% لإنشاء منحنى قياسي.
    11. إضافة 300 ميليلتر من معيار مرجعي في التكرارات للوحة 96-جيدا.
    12. قراءة امتصاص عينات، فراغات، والإشارة إلى المعايير على 520 نانومتر.
    13. طرح قراءات فارغة من المعايير المرجعية وقراءات العينة.

2. الماوس OB OC ثقافة المشارك لاشتقاق ناضجة مكتب الدعم الدستوري

  1. الإعداد والتعقيم لشرائح البقر العظام القشرية
    1. تنظيف الأجزاء من العظام من الأنسجة المحيطة وإزالة trabecular العظام ونخاع العظام.
    2. الجاف للعظام عند 50 درجة مئوية ح 24.
    3. شريحة العظم إلى قطع أصغر وقطع إلى شرائح (حوالي 300 – 350 ميكرون سميكة) باستخدام سرعة منخفضة وشهد مع شفرة الماس.
    4. مقطعة شرائح 300 – 350 ميكرون الأقراص التربيعية (1 سم2).
    5. لتنظيف محرك الأقراص العظام (1 سم2)، وضعها في قنينة زجاجية قابلة للقفل، وملء مع الماء المقطر. نقل القنينة الزجاجية المشغولة في حمام الموجات فوق الصوتية، و sonicate للحد الأدنى 5 كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
    6. من أجل إيقاف الماء المقطر وإضافة الإيثانول 70% sonicate لمدة 5 دقائق.
    7. من أجل إيقاف الإيثانول 70% واستبدال مع الإيثانول 100%.
      ملاحظة: تخزين الشرائح العظام في الإيثانول 100% عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 أسابيع.
    8. تشعيع شرائح العظام مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة على كل جانب تحت ظروف معقمة. تخزين الشرائح العظام المعقم في لوحة ثقافة عقيمة في الرايت حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. عزل سلائف OC نخاع العظام
    1. Euthanize 8 – 12 أسبوع القديمة السذاجة بالب/ج الفئران باستخدام حقنه داخل (القائمة) لحل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
    2. عزل السلائف OC نخاع العظام من قصبة الماوس وتايبي.
    3. إزالة الساقين مع مقص معقم من أقرب نقطة إلى الهيئة في الورك وقطعت أطرافه في مفاصل الركبة والكاحل وإزالة الأنسجة اللينة مع مشرط معقم والملقط. قطع في epiphyses. طرد وتعليق النخاع مع 1 مل BGM إلى طبق بتري معقم 6 سم استخدام إبرة ز 27 تعلق بحقنه 1 مل للحصول على تعليق خلية.
    4. إضافة تعليق خلية أنبوب مخروطي 50 مل، يغسل سم 6 طبق بيتري مع 5 مل من BGM ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل نفسه. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في OC التمايز المتوسطة (مارك ألماني) تحتوي على BGM، 1 نانومتر 1,25-(OH)2-فيتامين D3 و 1 ميكرومتر بروستاغلاندين ه2 (1 مل/جيد).
      ملاحظة: واحد بالب/ج الماوس توفر إعداد كافية من السلائف قائد لوحة الثقافة 24-بئر واحدة.
  3. إعداد الماوس OB OC ثقافة المشارك مع مادة بيولوجية
    1. قبل احتضان الأقراص β-TCP قطر 14 مم أو العظم البقري شرائح (1 سم2) في 1 مل من BGM في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة قبل إضافة الخلايا.
      ملاحظة: شرائح العظم البقري مجموعة مراقبة الركازة الفسيولوجي لدراسة التمايز OC حضور الحيوية.
    2. إضافة 8.8 × 104 خلايا/سم2 من الابتدائي بس علقت في BGM على الحيوية أو العظام التحكم في لوحة ثقافة تعليق 24-جيدا أو لوح زراعة الأنسجة 24-جيدا. احتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: إرفاق OBs البلاستيك أو العظم مادة بيولوجية أو الأبقار.
    3. إضافة طازجة معزولة نخاع العظام OC السلائف إلى ح 24 مثقف الابتدائي OBs والثقافة في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لمدة 5 أيام. استبدال المتوسطة مع "مارك ألماني قائد" الطازجة كل يوم. ثم وصمة عار مكتب الدعم الدستوري طرطرات مقاومة حمض الفوسفاتيز (TRAP) لتقييم التمايز OC.
  4. تمييز قائد يقيمها تلطيخ فخ
    1. وصف OCs مولتينوكليتيد الناضجة، التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.3.3، نضح المتوسطة الثقافة من لوحة التحكم زراعة الأنسجة ولوحة الثقافة تعليق مادة بيولوجية وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني (37 درجة مئوية). نضح في برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا التي تفرخ لهم في 1 مل من محلول فورمالين 10% مخزنة في RT لمدة 10 دقائق.
    2. نضح الحل الفورمالين 10% مخزنة مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وإضافة 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في الرايت كرر هذه الخطوة ثلاث مرات، ثم نضح برنامج تلفزيوني، واستبدال مع 1 مل من فخ المخزن المؤقت (درجة الحموضة 5) واحتضان اللوحات في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. نضح فخ المخزن المؤقت وإضافة 1 مل إيثانول الأسيتون و 100% 1:1. احتضان اللوحة في الرايت 30 س بسرعة حل aspirate الأسيتون-الإيثانول مع بيبيت تستخدم مرة واحدة وجاف تماما اللوحات في الرايت
    4. لفخ تلطيخ الحل، وإعداد 10 ملغ/مل الحل فوسفات نافثول-AS-MX الأسهم في حل N، N-dimethylformamide، 0.6 ملغ/مل بنفسجي الأحمر سريع الملح في فخ المخزن المؤقت، وإضافة 0.1 مل من محلول مخزون فوسفات نافثول-AS-MX إلى 10 مل ملح البنفسجي الأحمر سريع في فخ المخزن المؤقت.
    5. أضف 1 مل فخ تلطيخ الحل واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم نضح في فخ تلطيخ الحل، وإضافة 1 مل من الماء عالي النقاوة التوقف عن رد فعل.
    6. نقل الأقراص β--برنامج التعاون الفني وشرائح العظم البقري بعد تلطيخ في بئر جديدة، مراقبة مكتب الدعم الدستوري الملون الأحمر استخدام مجهر ضوء (التكبير: 10 X) وتعداد فخ + ناضجة مكتب الدعم الدستوري مع نويات ثلاثة أو أكثر.

3-الحرجة الحجم الماوس عيب كالفاريال النموذجي

  1. حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ تحت الجلد (الليبي) في الفئران بالب/ج 8-الأسبوع القديمة للتسكين.
  2. تخدير الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة، وإضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  3. يحلق الفراء على قمة الرأس بين الأذنين وتنظيف السطح مع البوفيدون 7.5 ٪ اليود الحل و 70% إيثانول.
  4. جعل شق خط الوسط السهمي على رأس الجمجمة بين الأذنين مع مشرط معقم فضح كالفاريوم وإزالة الأنسجة الضامة بيريكرانيوم أعلاه العظم الجداري الأيمن بإلغاء ذلك مع مشرط.
  5. إنشاء عيب الحجم الحرج في العظم الجداري الأيمن باستخدام تريفيني أسنان عقيمة التي يبلغ قطرها 4 مم (2000 لفة في الدقيقة) تحت الري المستمر مع المحلول الملحي العادي تحقيقها العظم الجداري الأيمن وقطع طريق اكتوكورتيكس وبعض اندوكورتيكس.
  6. لمنع الأضرار الأم الجافية، استخدام مصعد periosteal صغيرة لاختراق اندوكورتيكس المتبقية، بعناية ورفع العظم كالفاريال وإزالته بالملقط. ينبغي أن يكون الخلل الناجم عن ذلك التعميم، وحوالي 3.5 ملم في القطر.
  7. ملء العيب كالفاريال مع غارقة قبل (PBS العقيمة 1 x في RT) رغوة β-TCP/C باستخدام الملقط.
  8. إعداد العدد المناسب من مطابقة العمر، الشام والضوابط السلبية مع عيب فارغة.
  9. للاحتفاظ مادة بيولوجية في مكان، وضع 0.5 ميليلتر من لاصق الأنسجة عند حافة العيب في نقطتين المعاكس.
  10. إغلاق الجلد خياطة غير امتصاص.
  11. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  12. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  13. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي للعلاج مسكن بعد الجراحة مرتين يوميا ل 72 حاء عودة تعافي تماما الفئران في اقفاصها.
  14. لتحديد مدى فعالية مادة بيولوجية، euthanize القائمة الفئران مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  15. في غرس ما بعد الأسابيع 8-12، قطع رأس الماوس euthanized مع مقص حاد.
  16. إصلاح الماوس مقطوعة الرأس في 30 مل من 4.5% مخزنة الحل الفورمالين 1-2 أسابيع لضمان كامل اختراق مثبت الأنسجة.
  17. نقل الرؤساء إلى إيثانول 70% للتخزين على المدى الطويل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة.
  18. يحسب الدقيقة استخدام تقنيات نسيجية أونديكالسيفيد موحدة لتقييم التجدد العظام أو التصوير المقطعي (ميكروكت). فمن الممكن لاستخدام ميكروكت المسح على عينات تشريح الجثة بدقة عالية (90 كيلو فولت، 4 دقيقة) في 2D و 3D السهمي وطائرات أمامي.
  19. لعلم الأنسجة أونديكالسيفيد، يذوي الرؤساء في ترتيب تصاعدي درجات الإيثانول وتضمين في ميثاكريلات الميثيل غليكول.
  20. قص القطع جزءا لا يتجزأ من ميتاكريليت الميثيل غليكول مع رأي الماس وطحن الأقسام لسمك حوالي 80 – 100 ميكرون.
  21. تقييم لاكزكو ليفي الملون أقسام العظام لتحديد تكوين العظام الجديدة14.

4. في المختبر الاستجابات المناعية

  1. Euthanize السذاجة 8-الأسبوع القديمة بالب/ج الفئران القائمة مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  2. ضع الماوس على الجانب الأيمن والفراء على الجانب الأيسر للحلاقة وتنظيف الجلد على الجانب الأيسر من البطن مع الإيثانول 70%.
  3. جعل 10 مم طويل وشق عميق 1 ملم في جلد الماوس على الجانب الأيسر من الخلف بعد الأضلاع حول المعدة باستخدام مقص معقم.
  4. فتح الجلد وتكشف ثم الصفاق. جعل 10 مم طويل وأقل من 1 ملم الشق العميق في الصفاق استخدام مقص تحت ظروف معقمة.
  5. دفع المعدة بروكسيمالي لفضح الطحال.
  6. عقد الطحال بلطف مع ملقط معقم وإزالته عن طريق قطع الأنسجة والأوعية المرفقة أدناه.
  7. ضع الطحال سليمة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من البرد 1 × PBS العقيمة.
  8. إعداد تعليق خلية مفردة تنميق الطحال باستخدام ملقط معقم 2 أو 2 شرائح زجاجية معقمة.
  9. إزالة الأنقاض التي يمر مصفاة خلية 40 ميكرومتر عقيمة مع برنامج تلفزيوني الباردة 1 x باستخدام المكبس لحقنه 1 مل.
  10. الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في 300 x ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في أنبوب 50 مل مخروطية ونضح وتجاهل المادة طافية. ثم ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC).
  11. احتضان تعليق خلية لمدة 14 دقيقة على RT ووقف رد الفعل بإضافة 45 مل متوسطة معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي).
  12. الطرد المركزي في الخلايا بعد تحلل الخلية في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وثم تجاهل المادة طافية.
  13. سبلينوسيتيس ريسوسبيند في ربمي المتوسطة التي تحتوي على 10% الحرارة-إبطال FBS الحل البنسلين والستربتوميسين 1%، 0.1% الجنتاميسين، 0.2% ß-mercaptoethanol والأحماض الأمينية غير الأساسية 1%.
  14. قبل احتضان الرغوة β-TCP/C في لوحة ثقافة عقيمة 96-كذلك يتضمن المتوسطة ربمي عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 قبل البذر الخلية.
  15. إضافة سبلينوسيتيس في معاير الأرقام، على سبيل المثال.، 1.25 × 105، 2.5 × 105 و 5 × 105/well للآبار في صفيحة زراعة الأنسجة 96-كذلك يتضمن ربمي المتوسطة وإضافات، مع أو بدون الرغوة β-TCP/ج المحتضنة مسبقاً.
  16. إضافة 10 ميكروغرام/مل كونكانافالين (Con A) الذائبة في المتوسطة لما مجموعة 100 ميليلتر/بئر إلى الآبار المناسبة واحتضان ثم في 37 درجة مئوية و 5% CO2 لح 72.
  17. قياس انتشار الخلايا مع الإنزيم بروموديوكسيوريديني (بردو). إضافة 10 ميليلتر/جيدا لحل وضع العلامات بردو في ح 48 خلية الثقافة واحتضان ثم لوحة 24 ساعة إضافية.
  18. في ح 72، جمع المادة طافية وتخزينها في-20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  19. إضافة 200 ميليلتر/بئر الحل التثبيت لكل بئر واحتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت أسبيراتي ثم تثبيت الحل. إضافة 100 ميليلتر/بئر الحل بردو مكافحة جسم العامل واحتضان لمدة 90 دقيقة.
  20. نضح الحل جسم وشطف الآبار ثلاث مرات مع 200-300 ميليلتر/جيد للغسيل حل وإزالة الحل الغسيل.
  21. إضافة 100 ميليلتر من الركازة الحل واحتضان لمدة 3-10 دقيقة في الرايت، ثم قياس امتصاص 450 نانومتر.
  22. قياس انترلوكين-1β (إيل-1β)، interleukin-2 (إيل-2)، 4-انترلوكين (إيل-4) والانترفيرون γ (IFN-γ) في supernatants جمعها استخدام أليسا قياسية.

5-ارتفاع الإنتاجية داخل نموذج

  1. تخدير الإناث القديمة 6-8-أسبوع بالب/ج الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة وإضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  2. يحلق الفراء البطن وتنظيف مع 7.5% البوفيدون اليود الحل و 70% إيثانول.
  3. جعل شق خط الوسط طويلة 8 مم من خلال الجلد على طول ينيا ألبا. إجراء شق صغير في الغشاء البريتوني باستخدام مشرط.
  4. مكان PBS العقيمة غارقة الطعوم الرغوة β-TCP/C (2 × 2 × 2 مم3) في التجويف الصفاقى أو دون إضافة مواد للفئران التحكم مطابقة العمر الشام.
  5. خياطة الصفاق والجلد بخياطة قابلة للامتصاص وعدم الامتصاص، على التوالي.
  6. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  7. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  8. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. العودة الفئران تعافي تماما إلى اقفاصها.
    ملاحظة: هذا الإجراء يدفع الحد الأدنى من الألم. عادة العلاج مسكن بعد الجراحة ليست ضرورية. إذا كانت تعمل الحيوانات تظهر علامات الألم، حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي أو دواء مسكن ملائم آخر لتخفيف الألم.
  9. Euthanize الفئران غرس ما بعد 7 أيام، مع إيجاد حل للقائمة xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ
  10. في غرس ما بعد 7 أيام، الغسل التجويف الصفاقى 1 مل باستخدام المحاقن بإبرة ز 25 لما مجموعة 3 مل من برنامج تلفزيوني الباردة بضغط رأس الماوس وإدخال الإبرة في الربع البطني السفلي الأيسر وتهدف بروكسيمالي.
    ملاحظة: يجب أن يكون السائل البريتوني خالية من كرات الدم الحمراء.
  11. الطرد المركزي الغسل البريتوني السوائل في 300 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وجمع السائل البريتوني لتخزين في-20 درجة مئوية للقياسات أليسا السيتوكينات إيل-1β، وايل-2، وايل-4.
  12. نضح المادة طافية، ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من برنامج تلفزيوني، ومن عد الخلايا البريتوني باستخدام تريبان الأزرق في هيموسيتوميتير.
  13. سيتوسينتريفوجي تعليق خلية في 5 × 105 خلايا إلى الشرائح الزجاجية، السماح للشرائح لتجف ووصمة عار لعدد خلايا المتمايزة.
  14. استخدام مجهر ضوء، عد كحد أدنى من 300 الخلايا في المجموع والتفريق بين الضامة، الحمضات، العَدلات واللمفاويات.

6-الفمية النموذجي تحت الجلد

  1. تخدير الإناث الأسبوع 6-8 القديمة بالب/ج الفئران بخليط من 100 مغ/كغ الكيتامين و 5 ملغ/كغ إكسيلازيني القائمة، إضافة جل أو مرهم للعين الحفاظ عليها رطبة وضع الماوس على لوحة تدفئة في 37 درجة مئوية خلال الإجراء بأكمله لمنع انخفاض حرارة الجسم. تقييم عمق التخدير عن طريق رشة أخمص القدمين والذيل.
  2. ضع الماوس على ظهرها ويحلق الفراء البطن وتنظيف سطح حلق مع البوفيدون 7.5 ٪ اليود الحل و 70% إيثانول.
  3. جعل شق خط الوسط طويلة 8 مم من خلال الجلد على طول ينيا ألبا البطن باستخدام المبضع وزرع برنامج تلفزيوني ثم غارقة مادة بيولوجية (2 × 2 × 2 مم3) تحت الجلد أو إضافة أية مواد للفئران التحكم مطابقة العمر الشام.
  4. خياطة الجلد مع خياطة غير امتصاص.
  5. قم بتنظيف جميع الأدوات الجراحية بالتعقيم البارد للحفاظ على ظروف معقمة قبل إجراء الجراحة القادم المعني ماوس أنيسثيتيزيد.
  6. لتلقي العلاج بعد الجراحة، ضع الحيوانات على لوحة تدفئة نظيفة وجافة في 37 درجة مئوية في مجال الجراحة للرصد المناسبة خلال فترة الانتعاش. مراقبة معدل التنفس ودرجة حرارة الجسم ولون الأغشية المخاطية وعيون كل 10 دقائق حتى أنها تنبيه.
  7. نقل الفئران واعية تعمل في قفص مع الغذاء والماء يفصل بين الحيوانات الأخرى حتى الشفاء التام. العودة الفئران تعافي تماما إلى اقفاصها.
    ملاحظة: هذا الإجراء يدفع الحد الأدنى من الألم. عادة العلاج مسكن بعد الجراحة ليست ضرورية. إذا كانت تعمل الحيوانات تظهر علامات الألم، حقن البوبرينورفين 0.1 مغ/كغ الليبي أو مسكن مناسب آخر.
  8. عندما تكون جاهزاً لدراسة الموقع غرس، euthanize القائمة الفئران مع حل xylazine الكيتامين و 24 ملغم/كغ 200 مغ/كغ.
  9. غرس ما بعد ثمانية أسابيع، المكوس الموقع غرس مع المحيطة بالانسجة (1 سم2).
  10. إصلاح النسيج في محلول الفورمالين 4.5% معزولة بين عشية وضحاها، وتضمين في البارافين ومقطعة 4 ميكرومتر المقاطع.
  11. وصمة عار 4 أقسام الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين ميكرومتر والهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) لالتهاب أو Masson's trichrome لترسيب الكولاجين والتليف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تقييم β-TCP لفعاليته مادة بيولوجية لإصلاح العظام، استخدمنا في المختبر و في فيفو فحص الطرق. أولاً، قمنا بقياس ردود المكشوف على الأقراص β--برنامج التعاون الفني بالمقارنة مع خط الأساس الضوابط وحدها متوسطة. يوضح الشكل 2 صلاحية OB ردا على الأقراص β--برنامج التعاون الفني في 7 و 14 يوما للثقافة. بقاء الخلية تقاس من الخلايا النشطة أيضي في آبار الثقافة هي نفسها بالنسبة OBs مع المتوسط في زراعة الأنسجة من البلاستيك وكذلك مع الأقراص β--برنامج التعاون ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نعرض نهجاً متعدد التخصصات للتقييم السريري لتوافق مع الحياة للممثل الحيوية المتقدمة لإصلاح وتجديد العظام. وقمنا باختبار ردود OBs، مكتب الدعم الدستوري، ونموذج رد فيفو في الشفاء في عيب حرجة العظام في الفئران، وكذلك في المختبر و في فيفو الاستجابات المناعية. أننا هدف لإظهار كيفية عمل فحوصات وتلخيص البيانات والاستنتاجات المستمدة من دراسة المواد الحيوية. نظهر أن استراتيجيتنا يقوم بإنشاء ملف تعريف قيمة من العظم مادة بيولوجية توافق مع الحياة.

واستخدمت فحوصات الخلايا الأو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا المشروع البحثي تلقت تمويلاً من الاتحاد الأوروبي "البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) في إطار المنحة الاتفاق رقم 263363.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<المواد الحيوية <القوية> / القوية >
؛ أقراص فوسفات ثلاثي الكالسيوم (& beta ؛ -TCP ، 14 مم)تم تلبيد الأقراص في فرن دثر عند درجة حرارة 1150 درجة مئوية. يمكن العثور على وصف مفصل للإنتاج في Zimmer et al (doi: 10.1002 / jbm.a.34639). تم تشعيع العينات بالأشعة فوق البنفسجية (15 دقيقة لكل جانب) قبل استخدامها في مزارع الخلايا.
رغوة Orthovita Vitoss (رغوة بيتا ؛ -TCP / C)Orthovita2102-1405
<قوية > ثقافة بانيات العظم الفأر< / قوي>
أليزارين ريد SSigma-AldrichA5533
ALP المخزن المؤقت (2x) درجة الحموضة 10.4إذابة 200 ملي مولار جلايسين ، 2 ملي كلوريد المغنيسيوم ، 2 ملي كلوريد الزنك في ماء عالي النقاء واضبطه على درجة الحموضة 10.
وسط نمو العظام (BGM)&alpha ;-MEM + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين
مخزن تحلل الخلية: CyQuant تحلل الخلايا العازلة 20x التركيزThermo ScientificC7027تمييع مخزون تحلل الخلايا المركز 20 ضعفا في الماء فائق النقاء.
كاشف صلاحية الخلية: كاشف بقاء الخلية الزرقاء PrestoInvitrogen ، Thermo Fisher ScientificA13261
Collagenase من النوع الرابع من المطثية هيستوليتيكومSigma-AldrichC5138
DC مجموعة فحص البروتين IIBio Rad5000112DC تحتوي على الكاشف A والكاشف B والكاشف S و BSA للمعيار المرجعي. بالنسبة للكاشف A '، أضف 20 & micro ؛ كاشف L S إلى 1000 & micro ؛ كاشف L A. 
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418فلتر معقم DMSO قبل الاستخدام.
Dispase II (البروتياز المحايد ، الدرجة الثانية)Roche4942078001
EnzCheck Phosphatase Assay Kit لنشاط الفوسفاتيز القلوي   ؛Invitrogen ، Thermo Fisher ScientificE12020EnzCheck Phosphatase Assay Kit على 6،8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate (DiFMUP) و N ، N-dimethylformamide و 6،8-difluoro-7-hydroxy-4-methylcoumarin (DiFMU). 
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Sigma-AldrichF7524
محلول الفورمالين المحايد مخزن 10٪سيجما ألدريتشHT501128
جلايسينسيجما ألدريتشG8898
هيكساديسيلبيردينيوم (سيتيل بيريدينيوم) كلوريد أحادي الهيدراتسيجما ألدريتشC9002
حمض الأسكوربيك 2-فوسفات سيسكوي مغنيسيوم ملح هيدراتSigma-AldrichA8960
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM2670
MEM ألفا متوسط (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
وسط التمعدن العظمي (مم)&alpha ؛ -MEM + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين - ستربتومايسين + 50 & ميكرو ؛ جم / مل حمض الأسكوربيك + 5 ملي مولار & بيتا ؛ - جليسيروفوسفات
بنسلين - ستربتومايسين   ؛  Sigma-AldrichP4333
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
Sigmafast BCIP / NBTSigma-AldrichB5655
Trypsin-EDTA (0.5٪) ، بدون فينول أحمر (10x)Gibco ، Thermo Fisher Scientific   ؛15400054تمييع محلول المخزون المركز 10 أضعاف في 1x PBS.
Tween20Sigma-AldrichP1379
ماء عالي النقاء: ماء زراعة الخلايا خالي من البيروجينVWRL0970-500
عازلةAdd  0.05٪ Tween20 إلى 1x PBS.
كلوريد الزنكSigma-Aldrich1.08816
& بيتا ؛ - هيدرات ملح ثنائي الصوديومGlycerophosphate Sigma-AldrichG5422
لوحة ثقافة معلقة 24 بئراGreiner bio-one662102
24 بئرا لوحة زراعةالأنسجة Greiner bio-one662160
50 مل أنبوب مخروطيGreiner bio-one227261
96 بئر لوحة سوداءGreiner bio-one655076
96 بئر لوحة شفافةGreiner bio-one655001
الطرد المركزي: VWR Mega Star 600RVWR
حاضنة CO2: HeraCell 240Thermo Scientific
Cryovial 2 ملGreiner bio-one122263
وحدة تصفية يمكن التخلص منها FP30 / 0.2 CA-SGE Healthcare Life Sciences Whatman10462200للترشيح المعقم لمحلول الإنزيم.
الماسح الضوئي المسطح: Epson Perfection 1200 PhotoEpson
Infinite M200 Pro قارئ الألواح الدقيقةTecan
أنبوب الطرد المركزي الدقيق: أنبوب Eppendorf قفل آمن 0.5 ملVWR20901-505
أنبوب الطرد المركزي الدقيق: أنبوب Eppendorf قفل آمن 1.5 ملVWR21008-959
شاكر التمرير (المداري والأفقي)  إدموند بوهلر 
حاضنة الاهتزاز GFL3032GFL 3032
ماصة ذات استخدام واحد: مصل ماصةGreiner bio-one612301
أدوات معقمة (مقص ، ملقط ، ملقط منحني) صفيحة
زراعة الأنسجة (10 سم)Greiner bio-one664960
< قوي > بانيات العظم - ناقضات العظم المشتركة < قوي >
1 & alpha ؛ 25- ثنائي هيدروكسي فيتامين D3سيجما ألدريتش179361000x مخزون مركز (10 وميكرو ؛ M في الإيثانول 100٪)
AcetoneVWR Chemicals22065.327
وسط نمو العظام (BGM)&alpha ؛ -MEM + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين ستربتومايسين
ماء مقطركارل روث3478.4
إيثانول (100٪ حجم / حجم)VWR Chemicals20821.365
الإيثانول (70٪ حجم / حجم)VWR للكيماويات93003.1006
سريع بنفسجي أحمر LB ملحSigma-AldrichF3381
مصل بقري الجنين (FBS)Sigma-AldrichF7524
محلول فورمالين محايد مخزن مؤقت 10٪Sigma-AldrichHT501128
MEM alpha Medium (α-MEM)Gibco Life Technologies 11900-073
N ، N-DimethylformamideSigma-AldrichD4551
Naphthol AS-MX فوسفاتSigma-AldrichN4875
وسط تمايز الظامرة (DM)&alpha ؛ -MEM + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ بنسلين ستربتومايسين + 1 نانومتر 1،25- (OH) 2-فيتامين D3 + 1 & micro ؛ م البروستاجلاندين E2  
البنسلين - الستربتومايسين  Sigma-AldrichP4333
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4Gibco, Thermo Fisher Scientific 10010023
البروستاجلاندين E2 (PGE2)شركة كايمان للكيماويات9003016مخزون مركز 1000x (1 ملي مولار في الإيثانول 100٪)
أسيتات الصوديوم ثلاثي هيدراتسيجما ألدريتشS7670
طرطرات الصوديوم ثنائي القاعدة ثنائي الهيدراتسيجما-ألدريتشS8640
أدوات معقمة (مقص ، ملقط ، مشرط)
فخ الرقم الهيدروجيني المخزن المؤقت 5.0قم بإذابة 40 ملي من أسيتات الصوديوم ، 10 ملي من طرطرات الصوديوم في ماء فائق النقاء واضبطه على درجة الحموضة 5.
مياه عالية النقاء: ماء زراعة الخلايا خال من البيروجينVWRL0970-500
لوحة ثقافة معلقة 24 بئراGreiner bio-one662102
24 بئرا لوحة زراعة الأنسجةGreiner bio-one662160
50 مل أنبوب مخروطيGreiner bio-one227261
جهاز طرد مركزي: VWR Mega Star 600RVWR
حاضنة CO2: شفرة رقاقة HeraCell 240Thermo Scientific
Diamond (10.2 سم × 0.3 سم)منشار Buehler
Isomet منخفض السرعةطبق بوهلر
بتري (6 سم)Greiner bio-one628،161
زجاجة زجاجية ذات غطاء لولبي 20 ملCarl RothEXY4.1
حقنة معقمة للاستخدام مرة واحدة 1 ملهنري 9003016 Schein Animal Health
التخدير: الكيتامين (كيتاميدور) ، زيلازين (رومبون)ريختر فارما إيه جي / باير هيلث كير
معقم بارد: Safesept MaxHenry Schein Animal Health9882765
الإيثانول (70٪ حجم / حجم) VWRChemicals93003.1006
مرهم العين: VitA POS 5 جمUrsapharm
محلول ملحي عادي (محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪)Fresenius Kabi
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي   ؛10010023
محلول اليود بوفيدون: براونول 1000 ملB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5٪ فورمالين مخزنكارل روث2213.6
لاصق الأنسجة: Histoacryl 5 × 0.5 مل & nbsp ؛1050060الجراحية
معدات الحماية الشخصية: قفازات جراحية ، قبعة وقناع ، ثوبهنري شاين 1045073 صحة، 1026614 ، 9009062 ، 370406
أدوات معقمة (مشرط ، مقص ، ملقط ، حامل إبرة)
إبر معقمة: إبر تحت الجلد RW 27 جم × 3/4 بوصة و 30 جم × 1/2 بوصة >9003340 هنري شاين لصحة، 9003630
حقنة معقمة تستخدم مرة واحدة 1 ملهنري شاين 9003016
لوحة التسخين: مسحات شاش معقمة PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
هنري شاين صحة220192
مشرط معقم يمكن التخلص منه (فيغور 20)هنري شاين لصحة9008957
الحفر الجراحي / الأسنان: المزروع SI-923W & H Dentalwerk Bü rmoos GmbH16929000
قبضة من النوع S-IIW & H Dentalwerk Bü rmoos GmbH30056000
تريفين ، قطر 4 ممHager& مجموعة أنابيب الري Meisinger GmbH229040
2.2 مW & H Dentalwerk Bü rmoos GmbH4363600
مصعد سمحاق 2 مم / 3 ممهنري شاين صحة472683
خياطة غير قابلة للامتصاص: بوليستر أخضر ، DS19 ، مت. 1.5 ، USP 4/0 75 سمهنري شاين صحة300715
في المختبر < / em> الاستجابات المناعية < / قوية >
التخدير للقتل الرحيم: الكيتامين (Ketamidor) ، Xylazine (Rompun)Richter Pharma AG / Bayer HealthCare
Cell Proliferation ELISA و BrdU (colorimetric)Sigma-Aldrich11647229001تحتوي المجموعة على محلول وضع العلامات BrdU ، ومحلول التثبيت (FixDenat) ، ومحلول الأجسام المضادة المضادة ل BrdU ، ومحلول الغسيل ومحلول الركيزة.
Concanavalin A (ConA)MP Biomedicals150710
زراعة خلاياRPMI المتوسطة + 10٪ FBS معطل بالحرارة + 1٪ محلول البنسلين والستربتومايسين + 0.1٪ جنتاميسين + 0.2٪ ß ؛ -mercaptoethanol + 1٪ أحماض أمينية غير أساسية
الإيثانول (70٪ حجم / حجم)VWR Chemicals93003.1006
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Gibco ، Thermo Fisher Scientific & نب سب.10500064
جنتاميسينجيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي   ؛15750037
ماوس IL-1 & بيتا ؛ ELISA جاهزة للذهاب!Invitrogen ، Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
Mouse INF-& gamma ؛ ELISA MAX StandardBioLegend430801
محلول الأحماض الأمينية غير الأساسيةGibco ، Thermo Fisher Scientific   ؛11140050
البنسلين - ستربتومايسين   ؛Gibco, Thermo Fisher Scientific 15140122
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي   ؛10010023
المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء (RBC): BD Pharm LyseBioscience555899
RPMI 1640 medium و HEPESGibco و Thermo Fisher Scientific   ؛52400025
β-MercaptoethanolGibco, Thermo Fisher Scientific 31350010
50 مل أنبوب مخروطيGreiner bio-one227261
96 بئر لوحة زراعة الأنسجةGreiner bio-one655180
أجهزة الطرد المركزي: VWR Mega Star 600RVWR
مصفاة خلية 40 & micro ؛ mBD Bioscience352340
Infinite M200 Pro قارئ الصفيحةTecan
حقنة معقمة ذات استخدام واحد 1 ملهنري شاين صحة9003016
أدوات جراحية معقمة (ملقط ، شرائح زجاجية)
< قوي > عالي الإنتاجية داخل الصفاق < / قوي>
التخدير: الكيتامين (كيتاميدور) ، زيلازين (رومبون)ريختر فارما AG / باير هيلث كير
معقم بارد: Safesept MaxHenry Schein Animal Health9882765
الإيثانول (70٪ حجم / حجم)VWR Chemicals93003.1006
مرهم العين: VitA POS 5 جمUrsapharm
Mouse IL-1 & beta ؛ ELISA جاهزة للذهاب!Invitrogen ، Thermo Fisher Scientific88-7013-88
Mouse IL-2 ELISA MAX StandardBioLegend431001
Mouse IL-4 ELISA MAX StandardBioLegend431101
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4Gibco ، Thermo Fisher Scientific   ؛10010023
محلول اليود بوفيدون: Braunol 1000 ملB. Braun3864154
Shandon Rapid-Chrome Kwik-Diff StainingKit Thermo Scientific9990700لعدد الخلايا التفاضلية.
لوحة التسخين: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
مقياس الدم الحجمي: غرفة NeubauerCarl RothPC72.1
خياطة غير قابلة للامتصاص: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
خياطة قابلة للامتصاص: جهازPolysorb CovidienSL-5628
Shandon للسيتوبسينThermo Scientific
حقنة معقمة تستخدم مرة واحدة 1 ملهنري شاين صحة9003016
مسحات شاش معقمةهنري شاين صحة220192
إبر معقمة: إبر تحت الجلد RW 27 جم × 3/4 بوصة و 25 جمهنري شاين 9003340 صحة، 420939
الأدوات الجراحية المعقمة (مشرط ، مقص ، ملقط ، حامل إبرة)
محلول تريبان الأزرق 0.4٪جيبكو ، ثيرمو فيشر العلمي   ؛15250061
<قوي >نموذج تحت الجلد تحت المزمن< / قوي >
التخدير: الكيتامين (كيتاميدور) ، زيلازين (رومبون)ريختر فارما AG / باير هيلث كير
معقم بارد: Safesept MaxHenry Schein صحة9882765
الإيثانول (70٪ حجم / حجم)VWR Chemicals93003.1006
مرهم العين: VitA POS 5 جمUrsapharm
محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) درجة الحموضة 7.4Gibco ، Thermo Fisher Scientific   ؛10010023
محلول اليود بوفيدون: براونول 1000 ملB. Braun3864154
Roti-Histofix 4.5٪ فورمالين مخزنكارل روث2213.6
لوحة التسخين: PhysitempRothacher MedicalTCAT-2LV
خياطة غير قابلة للامتصاص: Ethibond Excel 4-0Ethicon6683H
معدات الحماية الشخصية: جراحية قفازات ، قبعة وقناع ، ثوبهنري شاين 1045073 صحة، 1026614 ، 9009062 ، 370406
حقنة معقمة تستخدم مرة واحدة 1 ملهنري شاين صحة9003016
مسحات شاش معقمةهنري شاين صحة220192
أدوات معقمة (مشرط ، مقص ، ملقط ، حامل إبرة)
إبرة معقمة: إبر تحت الجلد RW 27 جم × 3/4 ''   ؛هنري شاين 9003340 صحة، 420939
بيتا يحتوي غسيل ماصة ذات استخدام واحد: ماصة مصل Greiner bio-one 612301 إبرة معقمة: إبرة تحت الجلد RW 27 جم × 3/4 بوصة هنري شاين لصحة 9003340 <قوي > نموذج عيب كالفاري للفأر< / قوي > تسكين: بوبرينورفين (بوباك) ريختر فارما إيه جي ب. براون صحة الطحال المتوسطة الشكل الدقيقة طرد مركزي

المراجع

  1. Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
  2. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  3. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plastic and Reconstructive Surgery. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  4. O'Brien, F. J. Biomaterials & scaffolds for tissue engineering. Materials Today. 14 (3), 88-95 (2011).
  5. Stanovici, J., et al. Bone regeneration strategies with bone marrow stromal cells in orthopaedic surgery. Current Research in Translational Medicine. 64 (2), 83-90 (2016).
  6. Anderson, J. M. Future challenges in the in vitro and in vivo evaluation of biomaterial biocompatibility. Regenerative Biomaterials. 3 (2), 73-77 (2016).
  7. Chen, Z., et al. Osteoimmunomodulation for the development of advanced bone biomaterials. Materials Today. 19 (6), 304-321 (2016).
  8. Ono, T., Takayanagi, H. Osteoimmunology in bone fracture healing. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 367-375 (2017).
  9. Tsiridis, E., Upadhyay, N., Giannoudis, P. Molecular aspects of fracture healing: Which are the important molecules? Injury. 38, S11-S25 (2007).
  10. Velasco, M. A., Narvaez-Tovar, C. A., Garzon-Alvarado, D. A. Design, materials, and mechanobiology of biodegradable scaffolds for bone tissue engineering. BioMed Research International. 2015, 729076(2015).
  11. Bastian, O., et al. Systemic inflammation and fracture healing. Journal of Leukocyte Biology. 89 (5), 669-673 (2011).
  12. El-Jawhari, J. J., Jones, E., Giannoudis, P. V. The roles of immune cells in bone healing; what we know, do not know and future perspectives. Injury. 47 (11), 2399-2406 (2016).
  13. Changi, K., et al. Biocompatibility and immunogenicity of elastin-like recombinamer biomaterials in mouse models. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 106 (4), 924-934 (2018).
  14. Laczko, J., Levai, G. A simple differential staining method for semi-thin sections of ossifying cartilage and bone tissues embedded in epoxy resin. Mikroskopie. 31 (1-2), 1-4 (1975).
  15. Nakayama, T., et al. Polarized osteoclasts put marks of tartrate-resistant acid phosphatase on dentin slices--a simple method for identifying polarized osteoclasts. Bone. 49 (6), 1331-1339 (2011).
  16. Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6, 22585(2016).
  17. Epstein, N. E. An analysis of noninstrumented posterolateral lumbar fusions performed in predominantly geriatric patients using lamina autograft and beta tricalcium phosphate. Spine Journal. 8 (6), 882-887 (2008).
  18. Epstein, N. E. Beta tricalcium phosphate: observation of use in 100 posterolateral lumbar instrumented fusions. Spine Journal. 9 (8), 630-638 (2009).
  19. Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
  20. Lo, D. D., et al. Repair of a critical-sized calvarial defect model using adipose-derived stromal cells harvested from lipoaspirate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  21. Gosain, A. K., et al. Osteogenesis in calvarial defects: contribution of the dura, the pericranium, and the surrounding bone in adult versus infant animals. Plastic and Reconstructive Surgery. 112 (2), 515-527 (2003).
  22. Levi, B., et al. Dura mater stimulates human adipose-derived stromal cells to undergo bone formation in mouse calvarial defects. Stem Cells. 29 (8), 1241-1255 (2011).
  23. Wang, J., Glimcher, M. J. Characterization of matrix-induced osteogenesis in rat calvarial bone defects: II. Origins of bone-forming cells. Calcified Tissue International. 65 (6), 486-493 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Alizarin Red S
الشخصية التوافق البيولوجي في الحيوية لتجديد العظام
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.