يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"

8.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58079

⸱

أغسطس 29, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1The Smidt Heart Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 2Advanced Clinical Biosystems Research Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Institute of Analytical Chemistry of the Czech Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا لأداء polysome التنميط في قلب الماوس perfused معزولة. يصف لنا أساليب للقلب نضح و polysome التنميط والتحليل للكسور بوليسومي فيما يتعلق مرناس وميرناس والبروتين بوليسومي.

الملخص

دراسات في التغيرات الدينامية في ترجمة البروتين تتطلب أساليب متخصصة. هنا قمنا بدراسة التغيرات في البروتينات المركبة حديثا ردا على الاسكيمية وضخه باستخدام القلب معزولة الماوس perfused مقترنة بالتنميط polysome. زيادة فهم التغيرات الدينامية في ترجمة البروتين، نحن تتميز مرناس التي كانت محملة ريبوسوم سيتوسوليك (بوليريبوسوميس أو بوليسوميس) وأيضا استرداد mitochondrial polysomes ومقارنة توزيع مرناً والبروتين في الكسور ذات الكفاءة العالية (ريبوسوم العديدة المرفقة مرناً)، منخفضة الكفاءة (أقل ريبوسوم المرفقة) التي شملت أيضا polysomes الميتوكوندريا، والكسور غير ترجمة. ميرناس يمكنك أيضا إقران مرناس التي يتم ترجمتها، مما يقلل من كفاءة الترجمة، وقمنا بدراسة توزيع ميرناس عبر الكسور. وكان بحث توزيع مرناس، ميرناس، والبروتينات تحت ظروف perfused القاعدية، في نهاية 30 دقيقة عالمية لا التدفق الاسكيمية، وبعد 30 دقيقة من ضخه. نقدم هنا الأساليب المستخدمة لإنجاز هذا التحليل – على وجه الخصوص، لا وصف النهج الأمثل لاستخراج البروتين من التدرج السكروز، كهذا قبل – وتقديم بعض النتائج التمثيلية.

المقدمة

يستجيب القلب لإصابة الاسكيمية (ط) وضخه (صاد) بطريقة ديناميكية. ومع ذلك، هناك القليل من التبصر في التغيرات الحادة في تخليق البروتين خلال الاستجابة. لمعالجة هذه المسألة، ونحن استغل طريقة راسخة polysome التنميط1 التعرف على التغيرات في وفرة البروتين التي تعكس إعادة توزيع ريبوسوم والعوامل التنظيمية متعدية الجنسيات من سيتوسول إلى بوليسوميس، الزيادة في البروتينات المركبة حديثا (مسحنا). في الإعداد لانا/R، تحدث الزيادة في تخليق البروتين الجديد في غضون فترة زمنية لا تتسق مع النسخ الجديدة مرناس2؛ وعلاوة على ذلك، كانت الخلافات بين مستويات التعبير مرناً ووفرة البروتين عنها3. لهذه الأسباب، اخترنا لتحليل التغيرات التي طرأت البروتين الحيوي كما يتبين من ترجمة البروتين. للقيام بذلك، قياس مرناً في الكسور بوليسومي، وتحليل تكوين البروتين في كسور polysome. أخيرا، لأن ميكرورناس (ميرس) تنظيم توافر مرناس للترجمة، ويمكن أن تتداخل مع كفاءة البروتين الترجمة4،5قمنا بدراسة توزيع ميرس في الكسور بوليسومي، مع التركيز على واستجابة لانا/ر.

لقد اخترنا باستخدام الماوس المعزولة لانجيندورف نضح النموذجي والأنسجة المقطوع تحت ظروف القاعدية التروية المستمرة، بعد الاسكيمية لا التدفق العالمي و 30 دقيقة، وبعد 30 دقيقة من الاسكيمية التي تليها 30 دقيقة من ضخه. ثم أننا solubilized أنسجة القلب وفصل polysomes عبر تدرج سكروز، يليها تحليل البروتين والكشف الانتقائي مرناس وميرناس بكر وميكرواري، على التوالي. وهذا المزيج من أساليب يمثل نهجاً قويا لفهم البروتين الحيوي، تمكين الكشف المتزامن مرناً وميرنا، ومسحنا، وكذلك إعادة توزيع البروتينات التنظيمية وميرنا ومرناً بين الكسور نونترانسلاتينج، بوليسوميس الكفاءة المنخفضة، وبوليسوميس ذات الكفاءة العالية (انظر الشكل 1). سيتم توسيع رؤى في تنظيم هذه العملية الحيوية بمزيد من التحليل الفسفرة عوامل التنظيمية الرئيسية مثل eIF2α أو mTOR. يتم وصف هذه الخطوات الفردية الآن بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الدراسات الحيوانية بتنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والموافقة عليها برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لارز سيناء مركز طبي.

1-لانجيندورف التروية للقلب الماوس

  1. نضح لانجيندورف من قلب الماوس مع الاسكيمية وضخه
    1. إدارة داخل بينتوباربيتال الصوديوم 70 ملغ/كغ للماوس الكبار (8-الأسبوع-القديمة، ذكر، C57BL6/j). تأكيد التخدير العميق بعدم الانسحاب إلى أخمص القدمين قرصه.
    2. Anticoagulate مع الهيبارين داخل 500 يو/كغ.
    3. فتح الصدر عبر شق القصية. فتح الحجاب الحاجز، وقطع على طول الحدود الساحلية للمحور الابطي الأمامي. بعد ذلك، قص على محور الابطي الأمامي حتى فوريليمب لفتح القفص الصدري تماما. بعد، تصور القلب، المشبك الشريان الاورطي تصاعدي مع الملقط والمكوس سرعة القلب. الموت سبب اكسسانجوينيشن. مكان القلب في كريبس الباردة (كلوريد الصوديوم 6.9 غرام/لتر، بوكل 0.35 غرام/لتر، ناكو3 2.1 غرام/لتر، خ2بو4 0.16 غرام/لتر، مجسو4 0.141 غرام/لتر، والسكر 2 غرام/لتر وكاكل2 0.373 غرام/لتر).
    4. كانولاتي الشريان الاورطي بإبرة بلانت-نصيحة ونتخلل القلب ريتروجراديلي بحل كريبس في وضع الضغط المستمر.
    5. وبعد فترة استقرار لمدة 15 دقيقة، رهنا بالقلب الاسكيمية لا التدفق عالمي لمدة 30 دقيقة تليها ضخه لمدة 30 دقيقة.
    6. حصاد قلوب بعد 15 دقيقة نضح خط الأساس، وبعد 30 دقيقة الاسكيمية، أو بعد 30 دقيقة ضخه. تقليم قبالة في الاذينين، والأداة الإضافية-تجميد الأنسجة في نيتروجين سائل.
    7. تخزين في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام

2-الترسب التدرج التجانس الأنسجة، سولوبيليزيشن، وكثافة السكروز

  1. إعداد التدرج
    1. إعداد حلول 2 (15% و 50%) السكروز 100 مل، خلط 4 مل من كلوريد الصوديوم 2.5 متر؛
      0.8 مل مجكل2 1.25 متر؛ 1 مل تريس-HCl 1 م، درجة الحموضة 7.5؛ ز 15 أو 50 غ من السكروز (15 في المائة و 50 في المائة، على التوالي)؛ الماء عالي النقاوة لتصل إلى 100 مل؛ وزايلين زيلين نفط (0.02 مغ/مل) للون الحل 15%
    2. تصفية كل حل (0.22 ميكرون المرشحات)
    3. إعداد 40 مل محلول السكروز كل يوم التدرج لاستخدامها، وإضافة سيكلوهيكسيميدي إلى كل الحلول لتحقيق التركيز النهائي من 100 ميكروغرام/مل
      1. استخدم صانع تدرج لإعداد مزيج بين الحلول السكروز 15% و 50%
      2. ملء المقصورة اليسرى مع 5 مل من التدرج السكروز 15%
      3. ملء حجرة الحق مع التدرج السكروز 50%
      4. فتح الصنبور والتبديل على مضخة لإثارة المقصورات الصغيرة اثنين مع محرض المغناطيسي
      5. استخدام أنبوب مرتبطة بالحنفية الثانية للسماح بمحلول السكروز مختلطة بالتدفق في أنبوب الترا-الطرد المركزي ذات جدران رقيقة. ستكون وحدة التخزين النهائي حوالي 10 مل.
    4. الاحتفاظ التدرجات في 4 درجات مئوية (بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر، ولكن لم يعد)
  2. تجانس أنسجة القلب
    1. مجانسة قلب الطازجة أو المجمدة مع بوليترون في المخزن المؤقت لتحلل المصفاة (تعديل لوجود التدرج السكروز) التي تحتوي على 100 مم بوكل، 20 مم تريس درجة الحموضة 7.5، مجكل2، 5 ملم 0.4% NP-40. وتشمل سيكلوهيكسيميدي 100 ميكروغرام/مل للحفاظ على هيكل بوليسومي، 0.1 "رناسي ش" المانع ومثبط البروتياز كوكتيل (قرص 1 50 مل).
    2. احتضان الجليد على 15 دقيقة.
    3. الطرد المركزي في س 18,000 ز لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية لإزالة المواد غير قابلة للذوبان وجمع المادة طافية.
    4. حجز 50 ميليلتر لتحديد البروتين وعزل الحمض النووي الريبي وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي (انظر الشكل 2).
    5. طبقة المادة طافية (500 – 100 ميليلتر) على رأس التدرجات وتحقيق التوازن بين الأنابيب مع تحلل المخزن المؤقت.
  3. الترسب وجمع الكسور
    1. أداء تنبيذ فائق لمدة 120 دقيقة في دورة في الدقيقة 37,000 في 4 درجات مئوية في دوار دلو يتأرجح. وفقا للشركة المصنعة، وهذا يتوافق مع 228,000 س ز في دائرة نصف قطرها القصوى.
    2. جمع كل التدرج ككسور 17 (حوالي 600 ميليلتر كل جزء) في أنابيب ميكروسينتريفوجي مع الرصد المستمر لامتصاص في 254 نانومتر (OD254).
    3. برنامج جامع الكسر كما يلي:
      1. تجاهل أول 3 دقائق من جمع (المقابلة للسائل الوارد في الأنابيب قبل التدرج)
      2. من 4 إلى 19 دقيقة، جمع الكسور بسرعة 1 مل/دقيقة في 17 الكسور.
    4. ضع الكسور على الجليد حالما يتم جمع كل منهما. تجميد عينات في-80 درجة مئوية، إذا هم لم يتم معالجتها فورا. ويرد في الشكل 1تتبع دينسيتوميتريك الأشعة فوق البنفسجية نموذجية للتدرج كما يتم جمعها.

3-عزل وتحليل مرناس من بوليسومي والكسور نونترانسلاتينج

  1. استخراج مرناً
    1. ذوبان الجليد الكسور في الجليد، وإذا كانت مجمدة في الفلاش بعد جمع
    2. نقل 200 ميليلتر لكل جزء في أنبوب جديد
      ملاحظة: في هذه الخطوة، كسور متتالية اثنين أو أكثر يمكن أن تجمع معا. وينبغي أن يتم ذلك بعناية بعد تحليل الرسم البياني OD254 حيث أن لا يحصل مختلطة الكسور بوليسومي وغير بوليسومي.
    3. إضافة 10 نانوغرام لوسيفراس الجيش الملكي النيبالي كالمراقبة الداخلية لكل عينة لغرض التطبيع.
      ملاحظة: يجب استخدام كبسولة تفجير لوسيفراس كرقابة داخلية لتطبيع النتائج.
    4. إضافة 700 ميليلتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي (حل أحادي الطور isothiocyanate الفينول وغوانيدين؛ انظر الجدول للمواد) لكل أنبوبة. يخلط جيدا واحتضان هذه الأنابيب لمدة 5 دقائق في الرايت (درجة حرارة الغرفة).
    5. إضافة 140 كلوروفورم ميليلتر ودوامه ل 15 إينكوباتي س. ل 2-3 دقيقة في الرايت
    6. الطرد المركزي في نماذج لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
    7. نقل المرحلة المائية العليا بعناية إلى أنبوب جديد.
    8. نظراً لمحتوى الحمض النووي الريبي للكسور ليست عالية، إضافة 10 ميكروغرام من الجليكوجين كحاملة لكل أنبوبة.
    9. إضافة 350 ميليلتر الايزوبروبانول لكل أنبوبة. يخلط جيدا واحتضان في-20 درجة مئوية ح 1 لزيادة الغلة.
    10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
    11. تجاهل المادة طافية وإضافة 700 ميليلتر الإيثانول 75% لغسل بيليه الجيش الملكي النيبالي.
    12. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 7,500 س ز في 4 درجات مئوية.
    13. إزالة الإيثانول واسمحوا بيليه الهواء الجاف لمدة 10 – 15 دقيقة.
      ملاحظة: الإفراط في تجفيف بيليه الحمض النووي الريبي سيمنع به solubilization كاملة في الماء.
    14. ريسوسبيند بيليه الجيش الملكي النيبالي في 50 ميكروليتر خالية رناسي عالي النقاوة H2o.
    15. احتضان هذه العينات لمدة 10 دقائق في 55 درجة مئوية.
    16. استخدم 2 ميكروليتر من كل عينة لقياس نوعية وكمية للجيش الملكي النيبالي استخراج وتخزين الباقي في-80 درجة مئوية.
  2. عكس النسخ وقبكر
    1. استخدام ميكروليتر 4 النسخ العكسي كدنا التوليف كيت (انظر الجدول للمواد) لفعل 20 ميكروليتر. إعداد سوبيرميكس وفقا لعدد العينات. نقل وحدة التخزين المطلوبة لكل أنبوبة وإضافة 5 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي بالإدخال لكل أنبوبة. يمكن تصحيح هذا المجلد لتكون ذات الصلة لمجموعة ظروف العمل بوليميريز بوليميراز.
    2. احتضان هذه الأنابيب في cycler حرارية مع البرنامج التالي الذي أوصت به الشركة المصنعة: 5 دقيقة عند 25 درجة مئوية، والنسخ العكسي 20 دقيقة لمدة 20 دقيقة في 46 درجة مئوية، والمنظمة المنتسخة العكسية لمدة 1 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    3. تشغيل قبكر مع البرنامج الأمثل لكل زوج من أجهزة الإشعال.
      ملاحظة: للكشف عن وجود بعض مرناس في الكسور، يجب استخدام حجم متساوية من كل جزء (من الجيش الملكي النيبالي المعزول) للنسخ العكسي.
  3. تحليل النتائج
    1. استخدام قيمة الأشعة المقطعية الجينات المعنية ولوسيفراس لحساب القيم المقطعية دلتا
    2. التعبير عن كل جزء دلتا Ct قيمة كنسبة مئوية من إجمالي قيمة مرناً الواردة في جميع الكسور لتصور توزيع مرناً عبر الكسور المختلفة (الجدول 1)

4-عزل وتحليل ميرناس من بوليسومي الكسور والكسور نونترانسلاتينج

  1. استخراج مرناً وميرنا
    ملاحظة: هذا البروتوكول يتبع إرشادات الشركة المصنعة، مع بعض التغييرات.
    1. ذوبان الجليد الجليكوجين والمصطلحات الخاصة بعنصر التحكم. الحفاظ على الجليد.
    2. إضافة 700 ميليلتر من كاشف استخراج ميرنا إلى 200 ميليلتر من العينة المجمعة.
    3. أضف 1 ميكروغرام/ميليلتر من الجليكوجين وتجانسه باستخدام ماصة. تبني عليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. إضافة 3.5 ميليلتر من 1.6 x8 10 سبايك في السيطرة ومزجها.
    5. إضافة 200 ميليلتر من كلوروفورم ودوامه عليه لمدة 15 ثانية على الأقل.
    6. احتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    8. استخدام ماصة، نقل المادة طافية على أنبوب 1.5 مل جديدة. تجاهل في المراحل الوسطى والسفلي.
    9. إضافة إلى حجم x 1.5 من الإيثانول 100% للمادة طافية ومزجها.
    10. نقل 700 ميليلتر من هذا الخليط إلى العمود استخراج ميرنا والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة ل 15 s RT وتجاهل التدفق عبر؛ كرر هذه الخطوة مع أي نموذج المتبقية.
    11. إضافة 700 ميليلتر من المخزن المؤقت 1 إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
    12. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت 2 إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 15 ثانية في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
    13. إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% إلى العمود والطرد المركزي أنه بأقصى سرعة لمدة 2 دقيقة في الرايت؛ تجاهل في التدفق من خلال.
    14. نقل العمود إلى أنبوب جديد 2 مل أزم وفتح الغطاء والطرد المركزي في RT لمدة 5 دقائق بأقصى سرعة؛ تجاهل في التدفق من خلال.
    15. إضافة ميليلتر 16 خالية رناسي المياه إلى العمود وأجهزة الطرد المركزي على كامل بسرعة لمدة 1 دقيقة في إبقاء الرايت النذرة على الجليد أو تخزين في-80 درجة مئوية للتحليل في المستقبل.
      ملاحظة: يمكن استخدام ميكروليتيرس اثنين لكل عينة لتحليل التطوير التنظيمي.
  2. عكس النسخ
    1. إعداد على الجليد. لكل رد فعل RT-PCR 20 ميليلتر، إضافة 4 ميليلتر من المخزن المؤقت RT ميرنا، 2 ميليلتر من الأحماض النووية، ميليلتر 9 مجموع الجيش الملكي النيبالي وميليلتر 2 إنزيم 3 ميليلتر من المياه مجاناً رناسي؛ أنها مزيج وأنها تدور إلى أسفل بإيجاز.
    2. تعيين Cycler الحرارية كما يلي:
      37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة؛
      95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛
      عقد 4 درجات مئوية.
    3. إزالة الأنابيب من cycler الحرارية وإضافة 200 ميليلتر من المياه خالية من رناسي. تخزين في-20 درجة مئوية، أو المضي قدما إلى PCR الوقت الحقيقي.
  3. بكر في الوقت الحقيقي
    ملاحظة: يتبع هذا البروتوكول 96 لوحة جيدا الشكل. إعداد مزيج رد فعل على الجليد.
    1. إعداد مزيج تفاعل PCR وإضافة كدنا (من ميرناس أعلاه) وفقا لنطاق مقبولة بموجب البروتوكول. يمكن إعداد ردود فعل متعددة دفعة واحدة.
    2. إضافة إجمالي 25 ميليلتر من مزيج PCR + كدنا في كل بئر.
    3. ختم اللوحة باستخدام ختم لوحة بصرية.
    4. الطرد المركزي في اللوحة لمدة 1 دقيقة في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة.
    5. برنامج cycler في الوقت الحقيقي كما يلي:
      خطوة التنشيط الأولى عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة؛
      3-الخطوة ركوب الدراجات: تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية؛ الصلب في 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ ملحق في 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية (القيام بجمع البيانات الفلورية)؛ إضافة دورات 40؛
      انصهار-منحنى حسب الافتراضي cycler.
  4. التحليل المقارن
    1. مثال للتطبيع (انظر الجدول 2):
      1. البحث عن القيمة الدنيا SCM.
      2. تطبيع جميع قيم المجلس الأعلى للقضاة إلى هذا الحد الأدنى.
      3. طرح هذه القيمة من قيم Ct ميرناس للفائدة (وزارة الداخلية) وإشارة الجينات (المرجع).
      4. تحليل البيانات باستخدام الصيغة 2-ΔCt .

5. تحليل البروتين البشري

  1. استخراج البروتينات من الكسور بوليسومي
    1. الجمع بين الكسور السكروز التي جمعت في ثلاثة كسور النهائي. علامة بالكسور الثقيلة (polysomes عالية الكفاءة في تجميع الكسور 4، 5 و 6 و 7 مع أعلى تركيز السكروز؛ السفلي من الأنبوب التدرج)، الضوء (polysomes انخفاض الكفاءة في كسر المجمعة 8، 9 و 10 و 11؛ والأوسط أنبوب التدرج) و غير ترجمة (كسور المجمعة 12، 13، 14 و 15 مع أدنى تركيز السكروز؛ العلوي من الأنبوب التدرج). إجراء مقايسة البروتين على الكسور المجمعة.
    2. إعداد الأوراق المالية 100% من حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وتخزينها في 4 درجات مئوية في الظلام. مزيج 0.5 مل عينة مع 60 ميليلتر من 100% TCA واحتضان في-20 درجة مئوية خلال الليل في الظلام.
      ملاحظة: استخدم البروتين منخفضة 1.5 مل الاحتفاظ بأنابيب (انظر الجدول للمواد).
    3. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، إذابة العينة على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز، 4 درجة مئوية للمادة 30 دقيقة تجاهل طافية.
      ملاحظة: يعطي 100 ميكروغرام من البروتين الكلي في عينة بيليه بروتين مرئية في أسفل الأنبوبة.
    4. قبل chill الأسيتون في الثلاجة-20 درجة مئوية. إضافة 0.5 مل الأسيتون البارد إلى بيليه البروتين وأجهزة الطرد المركزي في 15,000 س ز، 4 درجة مئوية للمادة 15 دقيقة تجاهل طافية. كرر هذه الخطوة مرتين.
    5. الهواء الجاف بيليه. ريسوسبيند بيليه في 360 ميليلتر من المخزن المؤقت تريس هيدروكلورايد 50 مم (درجة الحموضة 8).
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، استخدم سونيكاتور نبض إلى ريسوسبيند بيليه.
    6. إضافة 40 ميليلتر من ديثيوثريتول م 0.1 (تركيز نهائي 10 ملم) واحتضان في 55 درجة مئوية على شاكر ل 45 دقيقة إضافة 50 ميليلتر من إيودواسيتاميدي م 0.15 (التركيز النهائي 17 ملم) واحتضان في درجة حرارة الغرفة على شاكر لمدة 30 دقيقة في الظلام.
    7. إعداد حل التربسين: ريسوسبيند 20 ميكروغرام من التربسين في 100 ميليلتر من بيكربونات الأمونيوم 50 مم. إضافة إلى حجم المقابلة لحل التربسين بعينه في 01:50 (w/w) نسبة التربسين: البروتين، والتأكد من أن درجة الحموضة 8 واحتضان على شاكر على 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إضافة 1 م بيكربونات الأمونيوم تحقيق درجة الحموضة إلى 8.
    8. بعد الهضم التربسين، بارد العينة، الطرد المركزي بإيجاز في مقاعد البدلاء للطرد المركزي، إضافة حمض الفورميك 10% على درجة الحموضة 2 – 3 إخماد النشاط التربسين، والمضي قدما في عينة الملحي.
      ملاحظة: استخدم لوحة μ-شطف للعينة الملحي.
    9. شرط مسيل في الآبار 96 لوحة جيدا مع 200 ميليلتر من الميثانول استخدام الفراغ ثلاث مرات متبوعاً بتكييف 200 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% ثلاث مرات. تحميل عينة وأداء يغسل عينة باستخدام 200 ميليلتر من حمض الفورميك 0.1% ثلاث مرات. الوتي العينة مع 100 ميليلتر من حمض الفورميك acetonitrile/0.1% 50% مرتين في أنبوب 0.5 مل الاحتفاظ منخفض البروتين.
      ملاحظة: الوتي العينة ببطء في البداية استخدام الجاذبية متبوعاً بفراغ منخفضة.
    10. تتبخر النذرة عينة إلى جفاف استخدام مركزات وأما القيام مباشرة بتحليل الطيف الكتلي أو مخزن في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تحليل الطيف الكتلي
    1. إعادة تشكيل كل بيليه (تتألف من الببتيدات تريبتيك) في 50 – 100 ميليلتر وحقن 1 ميليلتر في مطياف كتلة.
      ملاحظة: تحسين وحدات إعادة تشكيل والحقن للحصول على أقصى شدتها إشارة LC/MS/MS. وفي حالتنا، إشارة الحد الأقصى (مجموع أيون الحالية؛ تيك) في قلب المسح كان في مجموعة من 1E8 إلى 2E9.
    2. استخدام عمود فخ C18 (300 ميكرون الهوية x 5 مم، 5 ميكرومتر، 100Å) تليها الببتيد الفاصل باستخدام عمود C18 (معرف ميكرومتر 75 × 250 ملم، 2 ميكرومتر، 100Å) مع تحديد معدل تدفق في 300 nL/دقيقة مجموعة درجة الحرارة الشعرية نانو-مصدر 275 درجة مئوية والجهد الرذاذ إلى 2 كيلو فولت.
    3. تطبيق تدرج خطي ب 5 – 35% لمدة 90 دقيقة، وب 35 – 95% لمدة 3 دقائق، عقد في 95% ب 7 دقائق والموازنة 5% ب لمدة 25 دقيقة (ج: 0.1% حمض الفورميك والمياه وب 0.1% حمض الفورميك في الاسيتو الانيتريل). الحصول على الأطياف MS2 للايونات كثافة أعلى 15 من كل عملية مسح MS1 استخدام وضع إدارة البحث الجنائي. 3 استخدام الطيف الكتلي وإنشاء نسخ متماثلة لكل عينة تم تحليلها.
      ملاحظة: تحسين واستخدام الظروف التجريبية والمعلمات التي مناسبة للعينات الخاصة بك في صك خاص الطيف الكتلي. الشروط/المعلمات المذكورة في الفرع 5-2. تم استخدامه والأمثل في المختبر.
  3. تحديد بروتين/كوانتيتيشن
    1. بعد تحليل الطيف الكتلي، تحويل الملفات الخام الأطياف في ملفات مزكسمل متوافقة باستخدام برنامج مسكونفيرت (http://proteowizard.sourceforge.net/tools/msconvert.html).
    2. إرسال الملفات المحولة إلى محرك البحث سيكويست مع معايير البحث، مثلاً، أونيبروتكب/السويسرية-بروت الماوس قاعدة (أحدث استعراض الكنسي)؛ هضم إنزيم شبه استخدام التربسين (بعد الخمير الحمر/--)؛ مع الانشقاقات الضائعة تصل إلى 2؛ النطاق الشامل السلائف: 400 إلى 4,500 اتحاد المغرب العربي؛ تعديل ثابت: كارباميدوميثيل (ج) 57.021465 اتحاد المغرب العربي؛ الببتيد التسامح الشامل: 50 جزء في المليون؛ جزء النوع الشامل: مونويسوتوبيك.
      ملاحظة: يمكن استخدام أخرى البروتين قاعدة بيانات البحث عن البيانات ومحركات خطوط الأنابيب. في حالة استخدام قاعدة بيانات مثل الفئران، وأقل اكتمالا من قواعد البيانات للماوس والإنسان، فقد تحتاج إلى البحث ضد الماوس (أو الإنسان) قواعد البيانات لزيادة التغطية بالبروتين. وفي هذه الحالة، سوف تحتاج إلى التكرار في أسماء البروتين المراد إزالتها.
    3. إجراء تحليل لبحث فيما بعد. تعيين عوامل التصفية لعرض البيانات. على سبيل المثال، تعيين احتمال الحد أدنى من بروتين (بروتين العتبة) 95% أو 99%، أي، سيتم عرض فقط البروتينات التي ينطوي تحليل إحصائي احتمال 95% أو 99% موجودة في العينة. تعيين عامل تصفية لعتبة الببتيد (مثلاً 95%)، أي احتمال الحد أدنى الذي سيتم استخدامه في تحديد ما إذا كان يعرف طائفة من ببتيد. حدد الحد الأدنى لعدد من الببتيدات التي ستحدد إذا كان بروتين موجود الببتيدات 2 كحد أدنى لتحديد البروتين (مستحسن).
    4. تقييم البروتينات المحددة للجودة/الكمية. ضمان استخدام الببتيدات بروتيوتيبيك للقياس الكمي. إذا تم التعرف على إيسوفورم التأكد من أنها قواعد على المراقبة الببتيد تريبتيك تتألف من تسلسل الأحماض الأمينية فريدة من نوعها إيسوفورم محددة. وينبغي أن يخضع أي البروتينات "شبيه" أو افتراضية مقارنة معرفة ما إذا كانت الملاحظة الببتيدات تتوافق مع بروتين معروفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحليل مرناً
ويمكن التعبير عن النتائج مرناً توزيع مرناً معين في كل جزء (الشكل 3 ألف)؛ للتحديد الكمي، الجمع بين الكسور ترجمة بوليريبوسومال ومقارنة للكسر غير ترجمة (الشكل 3B)، تقديم نسبة وفرة مرناً في ترجمة للكسور نونترانسلاتينج. اكتساب معلومات إضافية عن طريق فحص كسور بوليسومي كفاءة عالية بشكل منفصل من الكسور polysome منخفضة الكفاءة (ومنفصلة من الكسور نونترانسلاتينج). هذا مهم خاصة عند تحليل ميرناس، التي هي أثري في كسور م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ويتيح تحليل الشخصية polysome لدراسة البروتين الترجمة عن طريق تحليل الدولة المتعدية مرناً محددة أو6،الترنسكربيتوم كله7. كما أنها مساعدة كبيرة عندما الترجمة المحلية يحتاج إلى دراسة مثل سينابتوسوميس8. تقليديا، ينطوي هذا الأسلوب على فصل أحادية الطور و polyribosomes ومرناس المرتبطة بها في تدرج سكروز التي يمكن أن تقترن بالجينوم أو تقنيات البروتين للحصول على النتائج المرجوة6،9. على سبيل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

HL112730 P01 المعاهد الوطنية للصحة (خرقه، جف)، HL132075 R01 المعاهد الوطنية للصحة (خرقه، جف)، باربرا سترايسند المرأة مركز القلب (خرقه، جف)، يرأس دوروثي وهاء-فيليب ليون في القلب الجزيئية (خرقه)، وهبت جليزر إريكا كرسي في صحة القلب للمرأة (جف) وأكاديمية العلوم التشيكية الدعم المؤسسي رفو: 68081715 (مللي ثانية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PentobarbitalVortech Phamaceuticals9373للقتل الرحيم
HeparinSagent103424 تستخدم في ملقط تحضير langendorff
أدوات العلوم الدقيقة91110-10تستخدم لتعليق نظام Langendorff للقلب
Radnoti + محلي الصنعn / aنظام "أربعة قلوب" يتكون من زجاج منفوخ مخصص وأنابيب وحمامات مائية
كلوريد الصوديومسيجماS7653-5KGكربس العازلة وتدرج السكروز
KClSigmaP5405Krebs العازلة ومحلول التحلل
KH2< / sub>PO42< / sub>SigmaP-5504Krebs buffer
MgSO4< / sub>SigmaM7774-500GKrebs buffer
GlucoseSigmaG5767عازلة كريبس
CaCl 2 < / sub >SigmaC1016-500Gمسحوق السكروز العازلة Krebs
SigmaS0389-1KGتدرج السكروز
MgCl 2< / sub >سيجما208337تدرج السكروز وعازلة التحلل
Tris-baseSigmaT1503-1KGتدرج السكروز وعازلة التحلل
Xylene CyanoleSigmaX-4126تدرج السكروز
CycloheximideSigma-aldrich239763تدرج السكروز وعازلة التحلل
RNaseOUTLife TechnologiesC00019مثبط RNAse لعازلة التحلل
Igepal CA-360 (NP40)SigmaI3021عازلة التحلل
5056489001
Roche خالية من EDTAأنبوب ، Thinwall ، فائق الوضوح ، 13.2 مل ، 14 مم × 89 ممBeckman Coulter344059
جهاز طرد مركزي فائقBeckmanLE-80Kالطرد المركزي الفائق للتدرجات
الدوارBeckmanSW41الطرد المركزي الفائق للتدرجات
Biologic LP (مضخة)Biorad731-8300تجزئة التدرجات
BioFracBiorad741-0002تجزئة التدرجات
الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf RNA / DNA LoBind ، أنبوب 2 ملSigmaZ666513-100EAجزء التدرج واستخراج الحمض النووي
تقنيات حياة كاشف TRIzolAM9738استخراج الحمض النووي الريبي
Luciferase التحكم في الحمض النوويPromegaL4561استخراج الحمض النووي الريبي
الكلوروفورمفيشر ScientificC606-4RNA استخراج
الجليكوجين ، الحمض النووي الريبي الصفThermo Fisher ScientificR0551استخراج الحمض النووي الريبي
IsopropanolSigmaI9516استخراج الحمض النووي الريبي استخراج الحمض
الريبي الإيثانولSigmaE7023-1Lاستخراج الحمض النووي الريبي
iScript cDNA Synthesis KitBioRad170-8891النسخ العكسي
iTaq Universal SYBR Green SupermixBioRad175-5122مجموعة PCR
الكمية miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084Kit لعزل الحمض النووي الريبي
الكلي miScript II RT Kit (50)Qiagen218161Kit للنسخ العكسي miScript
Sybr Green PCR Kit (200)Qiagen218073Kit لتحليل تعبير PCR في الوقت الفعلي لأجهزة الطرد المركزي miRNAs
5424REppendorfللطرد المركزي لأنابيب 1.5 مل أو 2.0 مل في درجات حرارة مختلفة. السرعة القصوى - 21130 × جم
جهاز طرد مركزي 5810REppendorfللطرد المركزي للوحة PCR في الوقت الفعلي في درجات حرارة مختلفة. السرعة القصوى - 2039 × جم
My Cycler Thermal CyclerBio-Radللنسخ العكسي
CFX96 نظام الوقت الحقيقي / C1000 Touch Thermal CyclerBio-Radلتحليل PCR في الوقت الفعلي
miRNeasy Serum / Plasma Spike-in ControlQiagen219610لمراقبة جودة عزل الحمض النووي الريبي
Hard-Shell 96-Well PCR ، منخفض ، جدار رقيق ، ملتوي ، أخضر / شفافBio-RadHSP9641لتحليل PCR في الوقت الحقيقي
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film ، لاصق ، بصريBio-RadMSB1001لختم لوحة PCR في الوقت
الحقيقي Research بالإضافة إلى ماصة أحادية القناة ، رمادي ؛ 0.5-10 & LEppendorfUX-24505-02لسحب
الماصات PIPETMAN Classic Pipetman ، P20GilsonF123600Gلسحب الماصات
PIPETMAN Classic ، P200GilsonF144565لسحب العينات
Rainin L-1000XLS Pipet-Lite XLS LTS ماصة 100-1000 & micro ؛ LGilson17011782لسحب
العينات الجليكوجين ، درجة الحمض النوويالريبي Thermo Fisher ScientificR0551يحسن كفاءة عزل الحمض النووي الريبي الكلية
Posi-Click 1.7 مل أنابيب Posi-Click 1.7 مل ،DenvilleC2170RNA عزل وتخزين ؛ مزيج الكاشف
أنابيب الدراجات الحرارية -0.2 مل أغطية فردية ، أنابيب قياسية 0.2 مل مع بصرياDenvilleC18098-4 (1000910)تفاعل النسخ العكسي
Sharp 10 نصائح حاجز دقيقDenvilleP1096-FRلسحب العينات
Sharp 20 نصائح حاجز دقيقDenvilleP1121لسحب
العينات Sharp 200 نصائح حاجز دقيقDenvilleP1122لنصائح سحب العينات
LTS 1 مل مرشحRaininRT-L1000Fلسحب العينات
فحص التمهيدي miScript ( 200)Qiagen(يتغير وفقا ل miRNA)لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي
التدرج الرئيسي الإصدار 5.3 موديل 108أدوات BioCompلتحضير تدرجات السكروز
، حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، سيجما ألدريتشT6399
، الأسيتونسيجما ألدريتش650501
تريس هيدروكلوريدأمريسكوM108
ديثيوثريتولفيشر ScientificBP172
يودوأسيتاميدGbiosciencesRC-150
درجة التربسين المعدل ، خنازيرPromegaV5111
بيكربونات الأمونيومBDHBDH9206
حمض الفورميك ، Optima LC / MSFisher ChemicalA117
ميثانول ، Optima LC / MSفيشر كيميكالA454
أسيتونيتريل ، أوبتيما LC / MSفيشر كيميكالA996
بروتين أنابيب LoBind 0.5 ملأنابيب Eppendorf AG22431064
Protein LoBind 1.5 ملEppendorf AG22431081
HLB & micro ؛ لوحة الحذف 30 & مالواحة186001828BA
مكثفSpeedVac الحراري ScientificSavant SPD2010
سونيكاتورQsonicaOasis180
طرد مركزيThermo ScientificSorvall Legend micro 21R
LC عمود فخ PepMap 100 C18العمود الفصل 160454
الحراري العلمي LC PepMap RSLC C18الحراري العلمي 164536
Thermo ScientificOrbitrap Elite مطياف
MSConvert برنامجProteoWizard Toolkit
Sorcerer-SEQUESTSage-N Research، Inc.
أقراص كوكتيل مثبط للبريتياز ، أنابيب الريبي الريبي النووي لون طبيعي ، تسلسل جهاز مطياف الكتلة كتلة مصيدة الأيونات برنامج

المراجع

  1. Pourpirali, S., Valacca, C., Merlo, P., Rizza, S., D’Amico, S., Cecconi, F. Prolonged pseudohypoxia targets ambra1 mrna to p-bodies for translational repression. PLoS ONE. 10, e0129750(2015).
  2. Andres, A. M., Tucker, K. C., Thomas, A., Taylor, D. J., Sengstock, D., Jahania, S. M., Dabir, R., Pourpirali, S., Brown, J. A., Westbrook, D. G., Ballinger, S. W., Mentzer, R. M. Jr, Gottlieb, R. A. Mitophagy and mitochondrial biogenesis in atrial tissue of patients undergoing heart surgery with cardiopulmonary bypass. JCI Insight. 2, e89303(2017).
  3. Kislinger, T., Cox, B., Kannan, A., Chung, C., Hu, P., Ignatchenko, A., Scott, M. S., Gramolini, A. O., Morris, Q., Hallett, M. T., Rossant, J., Hughes, T. R., Frey, B., Emili, A. Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: Combined proteomic and transcriptomic profiling. Cell. 125, 173-186 (2006).
  4. Kren, B. T., Wong, P. Y., Shiota, A., Zhang, X., Zeng, Y., Steer, C. J. Polysome trafficking of transcripts and micrornas in regenerating liver after partial hepatectomy. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 297, G1181-G1192 (2009).
  5. Gottlieb, R. A., Pourpirali, S. Lost in translation: Mirnas and mrnas in ischemic preconditioning and ischemia/reperfusion injury. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 95, 70-77 (2016).
  6. Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling. Journal of Visualized Experiments. , (2014).
  7. Lorsch, J. Methods in enzymology. Laboratory methods in enzymology: Rna. Preface. Methods in Enzymology. 530, xxi(2013).
  8. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mrnas. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  9. He, S. L., Green, R. Polysome analysis of mammalian cells. Methods in Enzymology. 530, 183-192 (2013).
  10. Molotski, N., Soen, Y. Differential association of micrornas with polysomes reflects distinct strengths of interactions with their mrna targets. RNA. 18, 1612-1623 (2012).
  11. Maroney, P. A., Yu, Y., Fisher, J., Nilsen, T. W. Evidence that micrornas are associated with translating messenger rnas in human cells. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1102-1107 (2006).
  12. Paul, P., Chakraborty, A., Sarkar, D., Langthasa, M., Rahman, M., Bari, M., Singha, R. S., Malakar, A. K., Chakraborty, S. Interplay between mirnas and human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233, 2007-2018 (2018).
  13. Rupaimoole, R., Slack, F. J. Microrna therapeutics: Towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16, 203-222 (2017).
  14. Nelson, P. T., Hatzigeorgiou, A. G., Mourelatos, Z. Mirnp:Mrna association in polyribosomes in a human neuronal cell line. RNA. 10, 387-394 (2004).
  15. Nottrott, S., Simard, M. J., Richter, J. D. Human let-7a mirna blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nature Structural and Molecular Biology. 13, 1108-1114 (2006).
  16. Kim, J., Krichevsky, A., Grad, Y., Hayes, G. D., Kosik, K. S., Church, G. M., Ruvkun, G. Identification of many micrornas that copurify with polyribosomes in mammalian neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 360-365 (2004).
  17. Androsavich, J. R., Chau, B. N., Bhat, B., Linsley, P. S., Walter, N. G. Disease-linked microrna-21 exhibits drastically reduced mrna binding and silencing activity in healthy mouse liver. RNA. 18, 1510-1526 (2012).
  18. Kraushar, M. L., Thompson, K., Wijeratne, H. R., Viljetic, B., Sakers, K., Marson, J. W., Kontoyiannis, D. L., Buyske, S., Hart, R. P., Rasin, M. R. Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the rna-binding protein hu antigen r. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , E3815-E3824 (2014).
  19. McClatchy, D. B., Ma, Y., Liu, C., Stein, B. D., Martinez-Bartolome, S., Vasquez, D., Hellberg, K., Shaw, R. J., Yates, J. R. 3rd Pulsed azidohomoalanine labeling in mammals (palm) detects changes in liver-specific lkb1 knockout mice. Journal of Proteome Research. 14, 4815-4822 (2015).
  20. Schiapparelli, L. M., McClatchy, D. B., Liu, H. H., Sharma, P., Yates, J. R. 3rd, Cline, H. T. Direct detection of biotinylated proteins by mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 13, 3966-3978 (2014).
  21. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  22. Rajalingam, D., Loftis, C., Xu, J. J., Kumar, T. K. Trichloroacetic acid-induced protein precipitation involves the reversible association of a stable partially structured intermediate. Protein Science. 18, 980-993 (2009).
  23. Fic, E., Kedracka-Krok, S., Jankowska, U., Pirog, A., Dziedzicka-Wasylewska, M. Comparison of protein precipitation methods for various rat brain structures prior to proteomic analysis. Electrophoresis. 31, 3573-3579 (2010).
  24. Sashital, D. G., Greeman, C. A., Lyumkis, D., Potter, C. S., Carragher, B., Williamson, J. R. A combined quantitative mass spectrometry and electron microscopy analysis of ribosomal 30s subunit assembly in e. Coli. Elife. 3, (2014).
  25. Liang, S., Bellato, H. M., Lorent, J., Lupinacci, F. C. S., Oertlin, C., van Hoef, V., Andrade, V. P., Roffé, M., Masvidal, L., Hajj, G. N. M., Larsson, O. Polysome-profiling in small tissue samples. Nucleic Acids Research. 46, e3(2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

دينامية البروتين وميرنا "تحليل بوليسوميس" من "قلب الفأرة متفرقة بعد نضح لانجيندورف"
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.