مقالة منهجية

توصيف وظيفي من كاربوكسيليستيراسيس في البيت مقاومة المبيدات الحشرية الذباب و الذبابة مستأنسة

DOI:

10.3791/58106

⸱

أغسطس 23, 2018

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لإنتاج البيت كاربوكسيليستيراسي يطير البروتينات في المختبر مع نظام تعبير خلية الحشرات باكولوفيروس بوساطة ولاحقا وظيفيا تميز أدوارها في التاييض بيرميثرين، وبالتالي، تمنح للبيرويثرويد المقاومة بدراسات تستند إلى خلية MTT المقايسة و في المختبر الأيضية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتقد أن تلعب دوراً رئيسيا في مقاومة المبيدات الحشرية في مختلف الحشرات الأيض كاربوكسيليستيراسي بوساطة. وعثر عدة كاربوكسيليستيراسي الجينات حتى ينظم في سلالة ذبابة المنزل مقاومة، بينما ظلت أدوارهن في منح مقاومة المبيدات الحشرية إلى استكشاف. هنا، لقد قمنا بتصميم بروتوكول لتوصيف وظيفي كاربوكسيليستيراسيس. يتم عرض تجارب المثال ثلاثة: (1) التعبير وعزل البروتينات كاربوكسيليستيراسي عن طريق الحشرات باكولوفيروس بوساطة نظام التعبير خلية فروجيبيردا سبودوبتيرا (Sf9)؛ (2) MTT يستند إلى الخلية (3-[4، 5-ديميثيكثيازول-2-يل]-2، 5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) الإنزيم سيتوتوكسيسيتي لقياس تسامح خلايا الحشرات إلى علاجات بيرميثرين مختلفة؛ (3) في المختبر الأيضية دراسات واستكشاف قدرات كاربوكسيليستيراسيس تجاه بيرميثرين الأيضية. يطير سلالة ألف الجين كاربوكسيليستيراسي MdαE7 تم استنساخ من منزل مقاومة وتستخدم لبناء باكولوفيروس المؤتلف لعدوى الخلايا Sf9. وقيست فيابيليتيس الخلية ضد بيرميثرين مختلف العلاجات مع فحص MTT. التسامح الخلية المحسنة للمجموعة التجريبية (MdαE7-المؤتلف باكولوفيروس إصابة الخلايا) بالمقارنة مع تلك المجموعات المراقبة (لجنة مناهضة التعذيب-المؤتلف باكولوفيروس إصابة الخلايا والخلايا باكولوفيروس المصابة بروتينات فلورية خضراء-المؤتلف) بيرميثرين واقترح علاجات قدرات MdαE7 في التاييض المبيدات، وبالتالي حماية الخلايا من الأضرار الكيميائية. وباﻹضافة إلى ذلك، أعرب في الحشرات Sf9 الخلايا البروتينات كاربوكسيليستيراسي ومعزولة لإجراء دراسة الأيض في المختبر . نتائجنا أوضحت كبيرا في المختبر ايضية كفاءة MdαE7 تجاه بيرميثرين، مباشرة تشير إلى تورط كاربوكسيليستيراسيس في التاييض مبيدات الحشرات وهكذا يمنح مقاومة المبيدات الحشرية في المنزل الذباب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقاومة المبيدات الحشرية حاليا قضية رئيسية من مجلس النواب مراقبة الطيران في جميع أنحاء العالم1،2. الجهود الرامية إلى تحديد إليه لمقاومة المبيدات الحشرية ويسهل فهم أفضل لهذه المسألة، وبالتالي توفير رواية استراتيجيات فعالة في منع أو تقليل انتشار مقاومة التنمية3. كاربوكسيليستيراسيس، كواحد من الإنزيمات الرئيسية إزالة السموم، وقد اجتذبت الكثير من الاهتمام لأدوارها في عزل والتاييض مبيدات الحشرات في مختلف الحشرات4،،من56. وحددت الدراسة السابقة كاربوكسيليستيراسيس متعددة في البيت الذباب ومستويات التعبير لم تكن فقط مؤثرا حتى ينظم في سلالة الهف مقاومة ولكن يمكن أيضا أن يكون المحرض على أعلى المستويات استجابة للعلاجات بيرميثرين7 . ومع ذلك، تظل الأوصاف الوظيفية لهذه الجينات كاربوكسيليستيراسي في التاييض مبيدات الحشرات إلى استكشاف.

منذ صدور التقرير الأول في أوائل الثمانينات8، استخدمت نظام تعبير جينات أجنبية باكولوفيروس بوساطة على نطاق واسع نظراً لكفاءة إنتاج نسبة عالية من البروتين والبروتين التوكسينات تجهيز قدرات9. هذا نظام ثنائي يتألف من عنصرين أساسيين: باكولوفيروس المؤتلف شيدت إيصال جينات أجنبية إلى الخلايا المضيفة، والتعبير على نطاق واسع من البروتينات المهتمين بالخلايا المصابة المؤتلف باكولوفيروس. العقود الماضية، نظام التعبير خلية باكولوفيروس بوساطة قد استخدمت على نطاق واسع لإنتاج آلاف بروتينات المؤتلف، بدءاً من الإنزيمات سيتوسوليك للبروتينات الغشاء زمنياً في الحشرات والثدييات خلايا10. وعبرت دراستنا السابقة بنجاح عدة إنزيمات CYP450 في الخلايا Sf9 الحشرات مع هذا النظام11. في هذه الدراسة، ونحن باكولوفيروس كاربوكسيليستيراسي-المؤتلف لتصيب الحشرات Sf9 الخلايا التي شيدت، استكشاف التسامح الخلية إلى علاجات بيرميثرين مختلفة، وعلى نطاق واسع كاربوكسيليستيراسي أعرب عن البروتينات في المختبر للوظيفية الاستكشاف. بدلاً من التحقيق عدة خلائط isozyme كاربوكسيليستيراسي من هوموجيناتيس الحشرات التي اعتمدتها الدراسات السابقة12،13، يسمح هذا النظام التعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية تعبيراً محدداً و عزل البروتينات المستهدفة لوصف أفضل من خصائصها البيوكيميائية والهيكلية.

التحليل القائم على الملح tetrazolium (MTT) أسلوب قياس ألوان الفائق المتقدمة والأمثل لقياس جدوى الخلية. ويستند هذا التحليل الآلية التي الخلايا الحية فقط قادرون على التاييض الكاشف MTT اللون الأصفر إلى متسرعا formazan لون أرجواني مظلمة، التي يمكن أن تحلل بعد حله في المذيبات العضوية14كولوريميتريكالي، 15. وقد وضعت عدة أكثر دقة لكن أساليب تستغرق وقتاً طويلاً، مثل استبعاد تريبان الأزرق و thymidine معايرة الإنزيم16،17، في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، المسلم الإنزيم MTT يستند إلى الخلية لا يزال حاليا كالأسلوب الأكثر سرعة وتشغيلها بسهولة بسرعة الكشف عن صلاحية خلية. هنا، نحن استخدام الإنزيم MTT لاستكشاف التسامح الخلية ضد المبيدات الحشرية العلاجات. يدعم التسامح المعززة للخلايا عند المصابين باكولوفيروس المؤتلف كاربوكسيليستيراسي بشدة أدوار الأيضية كاربوكسيليستيراسيس لمبيدات الآفات، التي بدورها تشير إلى مشاركتها في مقاومة المبيدات الحشرية.

بالإضافة إلى ذلك، أجرى في المختبر ايضية مقايسة أيضا في هذه الدراسة. وبالمقارنة مع فحوصات كاربوكسيليستيراسي العامة التي تستخدم ركائز مشتركة مثل اسيتات نابثيل α (α-نا) وبيتا-نافثيل خلات (β-نا) لتعكس أنشطة هيدروليكي كاربوكسيليستيراسيس، دراسة الأيض في المختبر يعتبر طريقة دقيقة لقياس أنشطة كاربوكسيليستيراسيس تجاه المبيدات الحشرية18مباشرة. قد استخدمت هذا الأسلوب بنجاح في مختلف الحشرات لتوصيف الفسفرة متعددة P450s بالاشتراك مع المبيدات الحشرية المقاومة11،،من1920. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا بعد طبق في الدراسات كاربوكسيليستيراسي. ومع توافر البروتينات كاربوكسيليستيراسي التي ينتجها نظام باكولوفيروس بوساطة التعبير، يمكننا تنفيذ في المختبر ايضية دراسة من كاربوكسيليستيراسيس تجاه بيرميثرين، كذلك يمكن أن توفر أدلة قوية على تورط من كاربوكسيليستيراسيس في منح المقاومة للبيرويثرويد في منزل الذباب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التعبير وعزل البروتينات المستهدفة مع نظام تعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية

  1. توجه استنساخ انتهت بلانت منتجات PCR البروتينات المستهدفة من الذباب البيت.
    1. تصميم [بكر] كبسولة تفجير من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) والجين MdαE7 ذبابة المنزل استناداً إلى تسلسل بهم والمتطلبات الخاصة لمكافحة ناقلات المختار (الجدول 1).
    2. استخدام بوليميراز الدنا الحرارة، وتصحيح التجارب المطبعية وكبسولة تفجير من الخطوة 1.1.1 لأداء فعل بكر 150 ميليلتر (30 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر دنتبس 10 ملم، 1.5 ميليلتر من دنا بوليميريز، 6 ميليلتر من البيت قالب يطير الحمض النووي، ميليلتر 7.5 من التمهيدي إلى الأمام ، 7.5 ميليلتر لعكس التمهيدي، مع الماء حجم نهائي 150 ميليلتر). الحرارة تفاعل PCR إلى 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تليها دورات 35 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 53 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية ل 60 s، ومن ثم تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة).
      1. تشغيل 1% [اغروس] هلام مع 150 ميليلتر من منتج PCR.
    3. المكوس الشظايا من الحمض النووي المستهدف من [اغروس] هلام مع مشرط حاد ونظيف: 1317 بي بي MdαE7 و 858 bp للتجارة والنقل. تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة استخراج هلام المتاحة تجارياً يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة (جدول المواد). يحل الحمض النووي المنقاة في 15 ميليلتر من الماء المقطر.
    4. تشغيل 1% [اغروس] هلام مع 1 ميليلتر لتنقية الحمض النووي للتحقق من سلامتها. استخدام آخر ميليلتر 1 لتنقية الحمض النووي لقياس تركيزات مع جهاز المطياف الضوئي.
  2. بناء إدخال بلازميد للبروتينات المستهدفة
    1. قم بإعداد رد فعل الاستنساخ. ميكس طازجة تنقية المنتجات الحمض النووي من الخطوة 1.1.3 ومتجهات الدخول المتاحة تجارياً تحتوي على توريL-مواقع (جدول المواد) بنسبة 1:1 مولى (0.5-2 ميليلتر منتج الطازج PCR تركيزات 70-200 نانوغرام/ميليلتر: 0.5 ميليلتر متجه). ثم أضف 1 ميليلتر المتاحة تجارياً حل الملح (كلوريد الصوديوم 1.2 م2 و 0.06 م MgCl2) وإضافة المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 6 ميليلتر. المزيج بلطف واحتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1.
    2. نقل 4 ميليلتر من استنساخ نواتج التفاعل في الخطوة 1.2.1 إلى 50 ميليلتر من كيميائيا المختصة كولاي الخلايا. تبني على الجليد ل 30 دقيقة صدمة الحرارة الخلايا لمدة 30 ثانية في حمام مائي 42 درجة مئوية دون المصافحة.
    3. وضع الأنبوب في الجليد لآخر دقيقة 2 إضافة 250 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة S.O.C. المتوسطة (تريبتوني 2%؛ استخراج الخميرة 0.5%؛ 10 ملم كلوريد الصوديوم؛ و 2.5 ملم بوكل؛ وملم 10 MgCl2؛ 10 مم MgSO4؛ الجلوكوز 20 مم). احتضان في 37 درجة مئوية ح 1 مع الهز برفق.
    4. نشر 50-200 ميليلتر من ثقافة البكتيرية في خطوة 1.2.3 على لوحات رطل الانتقائي (ز 1 من تريبتوني 1 غ من كلوريد الصوديوم 0.5 غ من الخميرة استخراج; 1.5 غرام من أجار المذاب في 100 مل ماء المقطر. اﻷوتوكﻻف وإضافة 0.1% كاناميسين 50 ملغم/مل). احتضان رطل لوحات ح 16 في 37 درجة مئوية لنمو مستعمرة.
    5. اختيار المستعمرات 5-10 وإعادة تعليق منهم على حدة إلى 5 ميليلتر من الماء المقطر.
    6. إجراء PCR بإضافة 5 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت، 0.5 ميليلتر من دنتبس 10 ملم، ميليلتر 0.25 بوليميراز الدنا، 1 ميليلتر من المستعمرات مع وقف التنفيذ، 1.25 ميليلتر من 10 ميكرون M13 التمهيدي إلى الأمام، ميليلتر 1.25 من 10 ميكرون التمهيدي عكس الجينات المستهدفة، والماء إلى الحجم النهائي من 25 ميليلتر. الحرارة بكر رد فعل على 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تليها دورات 35 98 درجة مئوية لمدة 10 ق، 53 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية ل 60 s، ومن ثم تمديد نهائي في 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة (الجدول 1).
    7. إعادة ثقافة 3 ميليلتر من المستعمرات مع وقف التنفيذ من الخطوة 1.2.5 في وسائل الإعلام السل (100 مل من الفوسفات مخزن يحتوي على 0.17 م خ2ص4 و 0.72 م ك2هبو4 مع 450 مل من مرق قاعدة المتوسطة التي تحتوي على 6 غرام تريبتوني، 12 غراما من خميرة و 2 مل من والغليسيرول، تعقيم، يحتوي على 0.1% 50 ملغم/مل كاناميسين) حاء 16 لاستخراج الحمض النووي بلازميد فائقة نقية عقب البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    8. استخدام 200 نانوغرام/ميليلتر بلازميد فائقة نقية من الخطوة 1.2.7 للتجاري سانغر التسلسل مع الإشعال إلى الأمام وعكس M13. التحقق من الإدراج الصحيح من الجينات المستهدفة في ناقلات استناداً إلى خريطة تسلسل توفيرها من قبل الشركة المصنعة.
    9. تخزين عينات الحمض النووي بلازميد نقية جداً التحقق من تسلسل MdαE7 والتجارة والنقل في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه هي إدخال بلازميد الدنا MdαE7 والتجارة والنقل.
  3. بناء باكولوفيروس المؤتلف بأداء أمداً جزئ (LR) رد فعل.
    1. على التوالي، مزيج 1 ميليلتر من 300 نانوغرام/ميليلتر إدخال بلازميد الحمض النووي للتجارة والنقل، و MdαE7 من الخطوة 1.2.7 أو إدخال بلازميد الحمض النووي من الكلورامفينيكول أسيتيلترانسفيراسي الجينات (CAT) المقدمة من مجموعة تعداء الخلايا مع 5 ميليلتر المتوفرة تجارياً ( تي تيل تحتوي على المواقع) ج-مصطلح الخطي الحمض النووي (التي تحتوي على مواقع تي تيآر) في 250 أنابيب PCR ميليلتر. إضافة المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات لجعل إجمالي حجم 8 ميليلتر.
      ملاحظة: استخدمت ردود فعل القط والتجارة والنقل كمجموعات المراقبة.
    2. إضافة 2 ميليلتر المتاحة تجارياً لامدا جزئ (LR) إنزيم مزيج من (جدول المواد) في كل خليط من الخطوة 1.3.1 لتحفيز رد فعل ل. ر. بلطف المزيج واحتضان عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح إيتش وان سيكس).
      ملاحظة: رد فعل LR يسهل اقترانها توريالمحتوية على L إدخال بلازميد الحمض النووي مع توريالمحتوية على البحث والتطوير ج-مصطلح خطية الحمض النووي لتوليد توريالمحتوية على ب من فيروس إذ تعرب عن. وتنتج هذه الخطوة باكولوفيروس المؤتلف لكل البروتين الهدف.
    3. تمييع 1 ميليلتر LR رد فعل المنتجات من الخطوة 1.3.2 20 X. إجراء PCR استخدام تمهيدي بوليهيدرين إلى الأمام وعكس V5 التمهيدي (الجدول 1). استخدام 5 ميليلتر من منتجات PCR لتشغيل 1% [اغروس] هلام للتحقق من الجودة. ويبين الشكل 1 مثال لنتاج رد فعل LR من الجينات MdαE7.

figure-protocol-1
رقم 1: نتائج المثال MdαE7 LR رد فعل تحليل PCR. تمييع 2 ميليلتر من رد فعل LR 200-fold واستخدام 2 ميليلتر لتمييع جنبا إلى جنب مع بوليهيدرين التمهيدي إلى الأمام وعكس التمهيدي V5 لأداء 25 ميليلتر PCR. استخدام 5 ميليلتر من منتجات PCR لتشغيل 1% [اغروس] هلام التحقق من جودة رد فعل ل. ر. أ

  1. ترانسفيكت الحشرات Sf9 الخلايا
    1. تعامل الخلايا Sf9 الحشرات الثقافة مع 5 مل من خلية كاملة النمو المتوسطة (المتوسطة خالية من المصل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS)) في T25 قوارير في 27 ˚C.
    2. إزالة المادة طافية وتدفق الخلايا المرفقة بالأسفل مع 3 مل متوسط نمو الخلية كاملة جديدة. نقل 0.5 مل من تعليق إعادة الخلايا إلى قارورة T25 معاملة جديدة. إضافة 4.5 مل متوسط النمو الكامل. احتضان عند 27 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام حتى نقل القادم.
    3. خلايا البذور 2 مل من سجل-مرحلة نمو الحشرات Sf9 ثقافة (≈3.0-5.0 × 106 خلايا) بالتساوي على ثقافة الخلية جيدا. السماح للخلايا نعلق على الأقل 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة.
    4. تحقق المرفق الخلية عن طريق مراقبة مع مجهر مقلوب المرحلة في 250 X. إزالة مستنبت الخلية واستبدالها مع 2 مل متوسط حشرة غريس.
    5. إعداد تعداء المخلوط بالحل (8 ميليلتر من الخلايا المتوفرة تجارياً العدوى كاشف (جدول المواد) مع 100 ميليلتر من متوسط حشرة غريس) وحل الخليط ب تعداء لكل الجينات المستهدفة (9 ميليلتر LR رد فعل المنتجات من الخطوة 1، 3 مع 100 ميليلتر من متوسط حشرة أونسوبليمينتيد نعمة) في 1.5 مل الطرد المركزي أنابيب، على التوالي.
    6. بلطف مزج خليط تعداء A و B معا بالتنصت على الأنابيب. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 35 دقيقة في غطاء محرك السيارة.
    7. بالتساوي إضافة الخليط من الخطوة 1.4.6 dropwise على خلايا المصنف من الخطوة 1-4-4. ختم الآبار مع الأشرطة واحتضان على 27 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    8. استبدال 2 مل من الحشرات متوسطة لنعمة مع 2 مل متوسط النمو الكامل. إضافة 100 ميكرومتر ganciclovir في كل بئر لتحديد سلبيا ضد باكولوفيروس غير المؤتلف. ختم الآبار مع الشريط واحتضان عند 27 درجة مئوية ح 72.
    9. جمع ح 72 وظيفة عدوى خلية الثقافة المتوسطة من كل بئر ونقل إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي. الطرد المركزي في 1,500 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لإزالة الخلايا أو الحطام الكبيرة.
    10. نقل المادة طافية في أنابيب الطرد المركزي 1.5 مل جديدة. تخزينها في 4 درجات مئوية مع الحماية من الضوء.
      ملاحظة: هذه هي الحلول التي تضطلع بها الفيروس P1 في المخزون لكل الجينات المستهدفة.
    11. تضخيم الأسهم المنخفضة-عيار P1 الفيروسية (1 × 105-1 × 106 بفو/mL) إلى مخزون عيار عالية P2 فيروسية (5 × 107-1 × 108 بفو/mL).
    12. خلايا البذور 2 مل من سجل-مرحلة نمو الحشرات Sf9 ثقافة (≈3.0-5.0 × 106 خلايا) بالتساوي على ثقافة الخلية جيدا. السماح للخلايا نعلق على الأقل 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة في غطاء محرك السيارة.
    13. تلقيح 5 ميليلتر من P1 فيروس الأسهم التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.10 في الخلية المصنف جيدا للخطوة 1.4.12، على التوالي. ثم إضافة 100 ميكرومتر ganciclovir لكل بئر. ختم الآبار واحتضان عند 27 درجة مئوية ح 72.
    14. جمع حلول الأسهم الفيروسات P2 72 ساعة بعد الإصابة. تخزين في 4 درجات مئوية مع الحماية من الضوء.
      ملاحظة: هذه هي الفيروسات P2 الحلول الأسهم لكل الجينات المستهدفة.
    15. (اختياري) كرر الخطوات 1.4.12-1.4.14 مع 5 ميليلتر مخزون الفيروسات P2 جمع P3 الفيروسات حلول الأسهم.
      ملاحظة: هذه هي الحلول التي تضطلع بها الفيروس P3 في المخزون لكل الجينات المستهدفة.
    16. تخزين جميع باكولوفيروس المشيدة في 4 درجات مئوية مع الحماية من الضوء.
      ملاحظة: كانت الجينات بروتينات فلورية خضراء والقط كمجموعة عنصر التحكم. وأظهر الرقم 2 علامات الخلايا عند المصابين باكولوفيروس بروتينات فلورية خضراء-المؤتلف في مراحل مختلفة من التضخيم.

figure-protocol-2
الشكل 2: مثال للمصابين علامات Sf9 الخلايا في مراحل التضخيم باكولوفيروس مختلفة- ويوضح الشكل بروتينات فلورية خضراء-المؤتلف باكولوفيروس الخلايا تحت الضوء الطبيعي والفلورية الخفيفة. مرحلة الإصابة P1، نسبة الإصابة منخفضة. مرحلة الإصابة P2، تعززت إلى حد كبير نسبة الإصابة. مرحلة الإصابة P3، أعراض تقريبا جميع الخلايا مفرزة من لوحة الثقافة الخلية، يزيد قطرها الخلية، فضلا عن وقف نمو الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. التعبير على نطاق واسع من البروتينات المستهدفة في الحشرات Sf9 الخلايا
    1. الثقافة 10 مل من سجل مرحلة نمو الحشرات Sf9 الخلايا مع متوسط النمو الكامل في قوارير T25 غير المعالجة.
    2. إضافة 200 ميليلتر P2 الفيروسات الحل الأوراق المالية (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.14) لتصيب الثقافات الخلية في خطوة 1.5.1 ح 72.
    3. جمع ح 72 وظيفة عدوى خلية الثقافة المتوسطة. أجهزة الطرد المركزي في 1,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. تجاهل حبيبات طافية ويغسل مرتين مع 1 مل من المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني م 0.1 (درجة الحموضة 7.5).
    5. حل كامل الكريات الخلية مع 1 مل من استخراج البروتين خلية الحشرات وتحلل المخزن المؤقت (جدول المواد). إضافة 10% والغليسيرول في تحلل الخلية. تخزين فورا في-80 درجة مئوية.
    6. كرر الخطوات 1.5.1-1.5.5 مع P2 الفيروسات الحل الأسهم القط البروتينات بمثابة السيطرة على المجموعة.
      ملاحظة: كرر الخطوة 1.5 في ثلاث نسخ لاستعدادات مختلفة من البروتين.

2-تحليل سيتوتوكسيسيتي MTT يستند إلى الخلية

  1. الثقافة 5 مل من سجل مرحلة النمو (1.5-2.5 × 106 خلايا/مل) الحشرات Sf9 الخلايا مع متوسط النمو الكامل في قوارير T25 غير المعالجة.
  2. إضافة 25 ميليلتر من P1 فيروس الأسهم الحل (تم الحصول عليها في الخطوة 1.4.14) لتصيب الثقافات خلية في الخطوة 2، 1 ح 48 مع الهز لطيف في 27 ˚C.
  3. إعداد 100 ملم بيرميثرين حلول الأسهم القياسية في الاسيتو الانيتريل. استخدام الاسيتو الانيتريل تمييع 50 مم، 25 مم، وعيار 12.5 ملم و 6.25 مم بإضافة 500 ميليلتر، 250 ميليلتر، ميليلتر 125 وحل الأسهم بيرميثرين ميليلتر 62.5 في إجمالي حجم 1,000 ميليلتر، على التوالي.
  4. البذور بالتساوي 200 ميليلتر من الثقافات الخلية المصابة من الخطوة 2، 2 وتستكمل مع 300 ميليلتر من متوسط النمو الكامل في لوحة 24-جيدا في كثافة 2 × 105 خلايا/مل.
  5. إضافة 4 ميليلتر بيرميثرين الحلول القياسية (6.25 مم، 12.5 مم، 25 مم و 50 مم) في كل بئر لجعل تركيز نهائي ميكرومتر 50، 100 ميكرومتر، 200 ميكرومتر و 400 ميكرون، على التوالي. فقط إضافة 4 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل في آبار للخلية استمرارية العمليات الحسابية (الشكل 3).
  6. ختم لوحات مع الأشرطة واحتضان عند 27 درجة مئوية عن 48 ساعة مع الحماية من الضوء.
  7. إعداد كاشف MTT (بروميد تيترازوليوم الأزرق ثيازوليل) 5 ملغ/مل حله في المخزن المؤقت (2.0 غرام من كلوريد الصوديوم، ز 0.05 من بوكل، ز 0.36 من نة2بو4∙2H2س، ز 0.28 نة2بو4، ز 0.05 من خ2PO4 حله في 200 مل من المقطر الماء ودرجة الحموضة 7.5).
  8. إزالة خلية الثقافة المتوسطة من الخطوة 2.6 بعد حضانة 48 ساعة دون لمس الطبقة المرفقة بأسفل الخلية. إضافة 200 ميليلتر من كاشف MTT في خطوة 2.7 في كل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 حتى تشكيل رواسب formazan الأرجواني الداكن في كل بئر (الشكل 3).
  9. احتضان في 37 درجة مئوية ح 4 حتى formazan الأرجواني الداكن رواسب النموذج في كل بئر. إضافة 500 ميليلتر من [دمس] بشكل كامل حل رواسب (الشكل 3).

figure-protocol-3
الشكل 3: مثال على نتائج MTT. بعد 48 ساعة بعد الإصابة بالفيروس P1 الحل الأسهم القط المؤتلف باكولوفيروس الحل، بالتساوي البذور 500 ميليلتر الخلايا التعبير عن الجينات القط في لوحة ثقافة خلية 24-جيدا. على التوالي، إضافة 4 ميليلتر بيرميثرين بجرعة مختلفة (6.25 مم، 12.5 مم، 25 مم و 50 مم) في كل صف لجعل التركيز النهائي إلى 50 ميكرومتر، 100 ميكرومتر، 200 ميكرومتر و 400 ميكرون. الصف التحكم تعامل مع الاسيتو الانيتريل فقط ووضع علامة ككورونا تشيكية في اللوحة. (أ) بعد 48 ساعة حضانة عند 27 درجة مئوية، تجاهل مستنبت الخلية في الطبقة العليا واستبدال مع 200 ميليلتر من الكواشف MTT اللون الأصفر. ثم احتضانها في 37 درجة مئوية ل h. 48 الأرجواني الداكن الحد الملونة رواسب النموذج في كل جيد مشيراً إلى أن بقاء الخلايا قادرون على التاييض اللون الأصفر الكواشف MTT إلى متسرعا اللون الأرجواني الداكن. (ب) 500 ميليلتر من المذيب [دمس] أضيفت في كل بئر بحل متسرعا المشكلة. تم اكتشاف قيمة امتصاص كل جيدا بجهاز المطياف الضوئي في 540 نانومتر. زيادة تركيزات بيرميثرين، سيتم تغيير اللون تدريجيا من الأحمر الداكن إلى الضوء الأحمر، مما يوحي بأن فيابيليتيس خلية قد انخفض تدريجيا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. نقل 200 ميليلتر من حل المذاب في لوحة 96-جيدا. قياس امتصاص القيم عند 540 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية (جدول المواد).
  2. حساب الجدوى خلية بمقارنة قيم امتصاص الخلايا بيرميثرين تعامل مع تلك الخلايا الاسيتو الانيتريل معاملة فقط.
  3. لمجموعة المراقبة، تكرار جميع الخطوات مع P2 الفيروسات الحل الأسهم من الكلورامفينيكول أسيتيلترانسفيراسي (CAT) المؤتلف باكولوفيروس التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 4.
  4. كرر هذه العملية 4 مرات للتحضيرات الفيروسات المختلفة.

3. في المختبر الفحص الأيضي

  1. إعداد 100 ملم بيرميثرين حلول الأسهم القياسية في الاسيتو الانيتريل. استخدام الاسيتو الانيتريل إلى تمييع 50 مم، 25 مم، وعيار 12.5 ملم و 6.25 مم. الكشف عن منطقة الذروة المقابلة تحت كل تركيز باستخدام [هبلك]. إنشاء وحساب منحنى بيرميثرين استناداً إلى منطقة الذروة بتركيزات مختلفة بيرميثرين القياسية.
  2. قياس تركيزات البروتين في الخطوة 1، 5 مع برادفورد أساليب21.
  3. إعداد ميليلتر 700 رد الفعل الأيضي مع معيار بيرميثرين ميكرومتر 40 و 1 ملغ من البروتينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 1، 5 حله في المخزن المؤقت 0.2 M تريس-HCl (درجة الحموضة 7.4). احتضان عند 30 درجة مئوية ح 2 مع الهز لطيف. حماية من الضوء.
  4. إخماد رد فعل عن طريق إضافة 700 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل المثلج. احتضان في ˚C 30 لآخر 30 دقيقة مع الهز لطيف. حماية من الضوء.
  5. الطرد المركزي خليط رد فعل في 16,000 س ز 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. جمع المادة طافية والتصفية عن طريق غشاء 0.45 ميكرومتر. نقل الترشيح في قارورة من الزجاج البنى التراكلين لتحليل [هبلك].
  6. تشغيل [هبلك] الظروف المثلى الكروماتوغرافي (المرحلة المتنقلة ج: 90% الاسيتو الانيتريل و 10% من المياه؛ المرحلة المحمول 5% الاسيتو الانيتريل تعديلها لدرجة الحموضة 2.3 مع حمض الفوسفوريك 85%.) التدرج الوت مع معدل تدفق من 1 مل/دقيقة والتدبير في طول موجي 232 شمال البحر الأبيض المتوسط.
  7. حساب نسبة استنفاد بيرميثرين بمقارنة مع ردود الفعل دون عينة البروتين المضافة.
  8. استخدام القط البروتين التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.5.6 ليكون بمثابة عنصر التحكم.
  9. كرر جميع الخطوات مع الاستعدادات البروتين المختلفة في خطوة 1.5.7.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بقاء الخلية نحو بيرميثرين مختلف العلاجات (مقايسة MTT)

سيتوتوكسيسيتي بيرميثرين بحثت في المؤتلف MdαE7 باكولوفيروس إصابة الخلايا Sf9 (المجموعة التجريبية) والقط-المؤتلف باكولوفيروس (المقدمة من مجموعة باكولوفيروس المصابة) إصابة الخلايا (الفئات الشاهدة). التحمل الخلية المحسنة إلى بيرميثرين في MdαE7 التعبير عن خلايا بقوة دعم أدوار الأيضية لهذه كاربوكسيليستيراسي ضد الخلايا وبالتالي حمايتها من الأضرار الكيميائية ومبيدات الحشرات. في دراستنا،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الأخيرة، استخدمت على نطاق واسع نظم التعبير مغايرة للتعبير عن وعزل كميات كبيرة من البروتينات، وبالتالي السماح البيوكيميائية والوظيفية وتحديد وتوصيف للإنزيمات في المختبر. وحتى الآن، عدة نظم نموذجية مختلفة بما في ذلك الإشريكيّة القولونية، باستوريس بيتشيا، سيريفيسيا ساكتششاروميسيسو فروجيبيردا سبودوبتيرا وقد تم تكييف للتعبير البروتين المؤتلف، والاختيار في المختبر نظام أمر حاسم لتوليد واسعة النطاق من البروتينات المهتمة22،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Q5 عالية الدقة DNA PolymeraseNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquickQIAGEN28704
pENTR / D-TOPO مجموعة الاستنساخ ، مع طلقة واحدة TOP10 بكتريا قولونية المختصة كيميائيامن قبل تقنيةK240020تم تضمين بادئات التسلسل M13 المتوسطة والعالمية في هذه المجموعة.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogen by life technologyK210002
Gateway LR Clonase II مزيج إنزيم ل BaculoDirect TM< / sup> أطقمInvitrogen بواسطة تقنية الحياة11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection KitInvitrogen by life technology12562-019تضمين كاشف تعداء Cellfectin و ganciclovir في هذه المجموعة
pENTR-CAT البلازميدInvitrogen بواسطة تقنيةالمدرجة في مجموعة نقل الحمض النووي الخطي BaculoDirect C-Term ، التركيز: 0.5 ميكروغرام / لتر
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة ، معتمدمن Gibco من Life Technologies10082-139
خلايا Sf9 في Sf-900 III SFMGibco من Life Technologies12659017
خلية الحشرات - PE LB استخراج بروتين خلية الحشرات و ؛ Lysis BufferG Biosciences بواسطة A Geno Technology Inc786-411
Sf-900 III SFM (1 & times;) سيروم خال من المصل متوسط كاملجيبكو من لايف تكنولوجيز12658-019
إنسكت ميد ، جيبكو غير مكملمن لايف تكنولوجيز11595030
بيرميثرين (أيزوميرات) المعيار التحليليSUPELCO من Solutions WithinTM< / sup>442748
الميثانول (المصنف التحليلي)سيجما ألدريتش67-56-1
أسيتونيتريل (متدرج تحليليا)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 مم مرشحات حقنة مع 0.45 & mu ؛ غشاء م GHP (معتمد من HPLC)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 HPLC SystemWaters
T100 Thermal CycleBio-Rad Laboratories Inc.1861096
Nanodrop 2000 / 2000c مقاييس الطيف الضوئيThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 خلايا التصوير قارئ متعدد الأوضاعBioTek
مجموعة استخلاص الجل الحياة تم الحياة جريس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al. A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica. BMC Genomics. 14, 803(2013).
  3. Liu, N. Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions. Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).
  4. Grigoraki, L., et al. Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus. e0003771. 9, e0003771(2015).
  5. Grigoraki, L., et al. Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin. PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533(2017).
  6. Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).
  7. Feng, X., Li, M., Liu, N. Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).
  8. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  9. Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
  10. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  11. Gong, Y., Li, T., Feng, Y., Liu, N. The function of two P450s, CYP9M10 and CYP6AA7, in the permethrin resistance of Culex quinquefasciatus. Scientific Reports. 7 (1), 587(2017).
  12. Cao, C. W., Zhang, J., Gao, X. W., Liang, P., Guo, H. L. Overexpression of carboxylesterase gene associated with organophosphorous insecticide resistance in cotton aphids, Aphis gossypii (Glover). Pesticide Biochemistry and Physiology. 90 (3), 175-180 (2008).
  13. Zhang, L., Gao, X., Liang, P. Beta-cypermethrin resistance associated with high carboxylesterase activities in a strain of house fly, Musca domestica (Diptera: Muscidae). Pesticide Biochemistry and Physiology. 89, 65-72 (2007).
  14. Van Meerloo, J., Kaspers, G. J., Cloos, J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Cancer cell culture. , Humana Press. 237-245 (2011).
  15. Stockert, J. C., Blázquez-Castro, A., Cañete, M., Horobin, R. W., Villanueva, Á MTT assay for cell viability: Intracellular localization of the formazan product is in lipid droplets. Acta Histochemica. 114 (8), 785-796 (2012).
  16. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , A3-B (2001).
  17. Riss, T. L., Moravec, R. A., Niles, A. L., Duellman, S., Benink, H. A., Worzella, T. J., Minor, L. Cell viability assays. Assay Guidance Manual. , (2013).
  18. Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides. Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).
  19. Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. R. Molecular mechanisms of metabolic resistance to synthetic and natural xenobiotics. Annual Review of Entomology. 52, 231-253 (2007).
  20. Nakamura, Y., et al. The in vitro metabolism of a pyrethroid insecticide, permethrin, and its hydrolysis products in rats. Toxicology. 235 (3), 176-184 (2007).
  21. Kruger, N. J. The Bradford method for protein quantitation. The protein protocols handbook. , Humana Press. 15-21 (2002).
  22. Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).
  23. Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nature Biotechnology. 22 (12), 1583(2004).
  24. Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 72 (2), 211(2006).
  25. Bulter, T., et al. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied Microbiology and Biotechnology. 69 (2), 987-995 (2003).
  26. Stepanenko, A. A., Dmitrenko, V. V. Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability. Gene. 574 (2), 193-203 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sf9 MTT

مقالات ذات صلة