Method Article

توصيف وظيفي من كاربوكسيليستيراسيس في البيت مقاومة المبيدات الحشرية الذباب و الذبابة مستأنسة

DOI:

10.3791/58106

⸱

August 23rd, 2018

 , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن نقدم بروتوكولا لإنتاج البيت كاربوكسيليستيراسي يطير البروتينات في المختبر مع نظام تعبير خلية الحشرات باكولوفيروس بوساطة ولاحقا وظيفيا تميز أدوارها في التاييض بيرميثرين، وبالتالي، تمنح للبيرويثرويد المقاومة بدراسات تستند إلى خلية MTT المقايسة و في المختبر الأيضية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتقد أن تلعب دوراً رئيسيا في مقاومة المبيدات الحشرية في مختلف الحشرات الأيض كاربوكسيليستيراسي بوساطة. وعثر عدة كاربوكسيليستيراسي الجينات حتى ينظم في سلالة ذبابة المنزل مقاومة، بينما ظلت أدوارهن في منح مقاومة المبيدات الحشرية إلى استكشاف. هنا، لقد قمنا بتصميم بروتوكول لتوصيف وظيفي كاربوكسيليستيراسيس. يتم عرض تجارب المثال ثلاثة: (1) التعبير وعزل البروتينات كاربوكسيليستيراسي عن طريق الحشرات باكولوفيروس بوساطة نظام التعبير خلية فروجيبيردا سبودوبتيرا (Sf9)؛ (2) MTT يستند إلى الخلية (3-[4، 5-ديميثيكثيازول-2-يل]-2، 5-ديفينيلتيترازوليوم بروميد) الإنزيم سيتوتوكسيسيتي لقياس تسامح خلايا الحشرات إلى علاجات بيرميثرين مختلفة؛ (3) في المختبر الأيضية دراسات واستكشاف قدرات كاربوكسيليستيراسيس تجاه بيرميثرين الأيضية. يطير سلالة ألف الجين كاربوكسيليستيراسي MdαE7 تم استنساخ من منزل مقاومة وتستخدم لبناء باكولوفيروس المؤتلف لعدوى الخلايا Sf9. وقيست فيابيليتيس الخلية ضد بيرميثرين مختلف العلاجات مع فحص MTT. التسامح الخلية المحسنة للمجموعة التجريبية (MdαE7-المؤتلف باكولوفيروس إصابة الخلايا) بالمقارنة مع تلك المجموعات المراقبة (لجنة مناهضة التعذيب-المؤتلف باكولوفيروس إصابة الخلايا والخلايا باكولوفيروس المصابة بروتينات فلورية خضراء-المؤتلف) بيرميثرين واقترح علاجات قدرات MdαE7 في التاييض المبيدات، وبالتالي حماية الخلايا من الأضرار الكيميائية. وباﻹضافة إلى ذلك، أعرب في الحشرات Sf9 الخلايا البروتينات كاربوكسيليستيراسي ومعزولة لإجراء دراسة الأيض في المختبر . نتائجنا أوضحت كبيرا في المختبر ايضية كفاءة MdαE7 تجاه بيرميثرين، مباشرة تشير إلى تورط كاربوكسيليستيراسيس في التاييض مبيدات الحشرات وهكذا يمنح مقاومة المبيدات الحشرية في المنزل الذباب.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقاومة المبيدات الحشرية حاليا قضية رئيسية من مجلس النواب مراقبة الطيران في جميع أنحاء العالم1،2. الجهود الرامية إلى تحديد إليه لمقاومة المبيدات الحشرية ويسهل فهم أفضل لهذه المسألة، وبالتالي توفير رواية استراتيجيات فعالة في منع أو تقليل انتشار مقاومة التنمية3. كاربوكسيليستيراسيس، كواحد من الإنزيمات الرئيسية إزالة السموم، وقد اجتذبت الكثير من الاهتمام لأدوارها في عزل والتاييض مبيدات الحشرات في مختلف الحشرات4،،من56. وحددت الدراسة السابقة كاربوكسيليستيراسيس متعددة في البيت الذباب ومستويات التعبير ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التعبير وعزل البروتينات المستهدفة مع نظام تعبير باكولوفيروس بوساطة الحشرات الخلية

  1. توجه استنساخ انتهت بلانت منتجات PCR البروتينات المستهدفة من الذباب البيت.
    1. تصميم [بكر] كبسولة تفجير من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) والجين MdαE7 ذبابة المنزل استناداً إلى تسلسل بهم والمتطلبات الخاصة لمكافحة ناقلات المختار (الجدول 1).
    2. استخدام بوليميراز الدنا الحرارة، وتصحيح التجارب المطبعية وكبسولة تفجير من الخطوة 1.1.1 لأداء فعل بكر 150 ميليلتر (30 ميليلتر من رد فعل المخزن المؤقت، 3 ميليلتر دنتبس 10 ملم، 1.5 ميليلتر من دنا بوليميريز، 6 ميليلتر من البيت قالب يطير الحمض النووي، ميليلتر 7.5 من التمهيدي إلى الأمام ، 7.5 ميليلتر ل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بقاء الخلية نحو بيرميثرين مختلف العلاجات (مقايسة MTT)

سيتوتوكسيسيتي بيرميثرين بحثت في المؤتلف MdαE7 باكولوفيروس إصابة الخلايا Sf9 (المجموعة التجريبية) والقط-المؤتلف باكولوفيروس (المقدمة من مجموعة باكولوفيروس المصابة) إصابة الخلايا (الفئات الشاهدة). التحمل الخلية المحسنة إلى بيرميثرين في MdαE7 التعبير عن خلايا بقوة دعم أدوار الأيضية لهذه كاربوكسيليستيراسي ضد الخلايا وبالتالي حمايتها من الأضرار الكيميائية ومبيدات الحشرات. في دراستنا،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقود الأخيرة، استخدمت على نطاق واسع نظم التعبير مغايرة للتعبير عن وعزل كميات كبيرة من البروتينات، وبالتالي السماح البيوكيميائية والوظيفية وتحديد وتوصيف للإنزيمات في المختبر. وحتى الآن، عدة نظم نموذجية مختلفة بما في ذلك الإشريكيّة القولونية، باستوريس بيتشيا، سيريفيسيا ساكتششاروميسيسو فروجيبيردا سبودوبتيرا وقد تم تكييف للتعبير البروتين المؤتلف، والاختيار في المختبر نظام أمر حاسم لتوليد واسعة النطاق من البروتينات المهتمة22،

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Q5 عالية الدقة DNA PolymeraseNew England Biolabs inc.M0491L
QIAquickQIAGEN28704
pENTR / D-TOPO مجموعة الاستنساخ ، مع طلقة واحدة TOP10 بكتريا قولونية المختصة كيميائيامن قبل تقنيةK240020تم تضمين بادئات التسلسل M13 المتوسطة والعالمية في هذه المجموعة.
PureLink HiPure Plasmid Miniprep KitInvitrogen by life technologyK210002
Gateway LR Clonase II مزيج إنزيم ل BaculoDirect TM< / sup> أطقمInvitrogen بواسطة تقنية الحياة11791-023
BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection KitInvitrogen by life technology12562-019تضمين كاشف تعداء Cellfectin و ganciclovir في هذه المجموعة
pENTR-CAT البلازميدInvitrogen بواسطة تقنيةالمدرجة في مجموعة نقل الحمض النووي الخطي BaculoDirect C-Term ، التركيز: 0.5 ميكروغرام / لتر
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارة ، معتمدمن Gibco من Life Technologies10082-139
خلايا Sf9 في Sf-900 III SFMGibco من Life Technologies12659017
خلية الحشرات - PE LB استخراج بروتين خلية الحشرات و ؛ Lysis BufferG Biosciences بواسطة A Geno Technology Inc786-411
Sf-900 III SFM (1 & times;) سيروم خال من المصل متوسط كاملجيبكو من لايف تكنولوجيز12658-019
إنسكت ميد ، جيبكو غير مكملمن لايف تكنولوجيز11595030
بيرميثرين (أيزوميرات) المعيار التحليليSUPELCO من Solutions WithinTM< / sup>442748
الميثانول (المصنف التحليلي)سيجما ألدريتش67-56-1
أسيتونيتريل (متدرج تحليليا)Sigma-Aldrich75-05-8
GHP Acrodisc 25 مم مرشحات حقنة مع 0.45 & mu ؛ غشاء م GHP (معتمد من HPLC)Pall Life Sciences21890388
Alliance Waters 2695 HPLC SystemWaters
T100 Thermal CycleBio-Rad Laboratories Inc.1861096
Nanodrop 2000 / 2000c مقاييس الطيف الضوئيThermoFisher ScientificND2000CLAPTOP
Cytation 5 خلايا التصوير قارئ متعدد الأوضاعBioTek
مجموعة استخلاص الجل الحياة تم الحياة جريس

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Scott, J. G., et al. Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles. Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).
  2. Li, M., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Carboxylesterase CharacterizationInsecticide ResistanceSf9 Cell ExpressionBaculovirus SystemMTT Cytotoxicity AssayIn Vitro MetabolismPermethrin ToleranceProtein IsolationCell ViabilityGene Cloning

Related Articles