يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس لوني سائل عالي الأداء كينورينيني وحمض كينورينيك: الكيمياء الحيوية المتعلقة بالإدراك والنوم في الفئران

10.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58129

⸱

أغسطس 19, 2018

 ,  ,  , 
1Maryland Psychiatric Research Center, Department of Psychiatry, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Pharmacology, University of Maryland School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

التعديلات في الأيض نيورواكتيفي المسار (KP) كينورينيني متورطون في الأمراض النفسية. تحقق النتائج الفنية كينورينيني غيرت مسار الأيض في فيفو في القوارض قد تساعد في توضيح نهج علاجية جديدة. البروتوكول الحالي يجمع بين نهج الكيمياء الحيوية والسلوكية للتحقيق أثر تحديا كينورينيني الحاد في الفئران.

الملخص

مسار كينورينيني (KP) تدهور التربتوفان متورط في الاضطرابات النفسية. على وجه التحديد، المستمدة من أستروسيتي المستقلب كينورينيك الحامض (كينا)، خصم في كلا ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) ومستقبلات النيكوتين أستيل (α7nACh) α7، كان متورطا في العمليات الإدراكية في الصحة والمرض. كما كينا مستويات مرتفعة في أدمغة المرضى الذين يعانون من مرض الفصام، وعطل فني في جلوتاماتيرجيك والمستقبلات اتروبين يعتقد أن تكون مرتبطة سببياً بالخلل المعرفي، في أحد المجالات أساسية للأمراض النفسية للمرض. كينا قد تلعب دوراً هاما باثوفيسيولوجيكالي في الأفراد مع مرض الفصام. من الممكن رفع كينا الذاتية في الدماغ القوارض بمعاملة الحيوانات مع كينورينيني بيوبريكورسور مباشرة، وقد أثبتت الدراسات الإكلينيكية في الفئران أن الارتفاعات الحادة في كينا قد يؤثر على عمليات التعلم والذاكرة. البروتوكول الحالي يصف هذا النهج التجريبي بالتفصيل، ويجمع بين أ) تحليل الكيمياء الحيوية من مستويات كينورينيني في الدم والدماغ تشكيل كينا (باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء)، اختبار ب) السلوكية للتحقيق هيبوكامبال تعتمد على الذاكرة السياقية (نموذج تجنب السلبية)، وج) تقييما للنوم-اليقظة سلوك [تسجيلات القياس البعدي الجمع بين للالكهربائي (EEG) وإشارات electromyogram (EMG)] في الفئران. مجتمعة، هو دراسة علاقة بين كينا مرتفعة، والنوم، والإدراك، ووصف هذا البروتوكول بالتفصيل نهج تجريبي لفهم نتائج الدالة من ارتفاع كينورينيني وكينا تشكيل في فيفو في الفئران. النتائج التي تم الحصول عليها من خلال أشكال مختلفة من هذا البروتوكول سيتم اختبار الفرضية القائلة بأن عملية كيمبرلي وكينا يخدم دور محوري في تحوير النوم والإدراك في الصحة والمرض.

المقدمة

عملية كيمبرلي المسؤولة على اللاإنسانية ما يقرب من 95 في المائة من التربتوفان من الأحماض الأمينية الأساسية1. في الدماغ الثدييات، ويتم استقلاب كينورينيني في أستروسيتيس في جزيء صغير نيورواكتيفي كينا أساسا من الإنزيم كينورينيني aminotransferase (كات) ثانيا2. كينا بمثابة خصم في مستقبلات NMDA و α7nACh في المخ2،،من34، وأيضا أهداف إشارات مستقبلات بما في ذلك مستقبلات هيدروكربون أريل (فهرس) وز-البروتين إلى جانب مستقبلات 35 (GPR35)5 ،6. في الحيوانات التجريبية، أظهرت ارتفاعات في الدماغ كينا يضر بأدائهم المعرفي في صفيف من فحوصات السلوكية2،،من78،9،10 . وتقترح فرضية ناشئة أن كينا يلعب دوراً أساسيا في تحوير الوظائف المعرفية التي تؤثر على سلوك النوم-اليقظة11، ومن ثم زيادة دعم دور الجزيئات المشتقة من أستروسيتي في تحوير بيولوجيا الأعصاب للنوم و 12من الإدراك.

سريرياً، وجدت ارتفاعات في كينا في السائل الدماغي النخاعي وأنسجة الدماغ بعد الوفاة من المرضى الذين يعانون من مرض الفصام13،14،،من1516، اضطراب نفسية المنهكة وتتميز بالإعاقات الإدراكية. المرضى الذين يعانون من مرض الفصام وغالباً ما تعاني من اضطرابات النوم التي قد تؤدي إلى تفاقم المرض17. فهم دور KP الأيض وكينا في تحوير علاقة بين النوم والإدراك، لا سيما بين التعلم والذاكرة، وقد يؤدي إلى تطوير علاجات جديدة لعلاج هذه النتائج السيئة في مرض الفصام وغيرها الأمراض النفسية.

طريقة موثوقة ومتسقة لقياس نواتج الأيض عملية كيمبرلي من المهم أن أؤكد أن البحوث الناشئة من مختلف المؤسسات يمكن أن تدمج في الفهم العلمي للبيولوجيا عملية كيمبرلي. في الوقت الحاضر، يمكننا وصف المنهجية قياس كينورينيني في بلازما الفئران وكينا في الدماغ الفئران بواسطة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). هذا البروتوكول، الذي يستفيد من الكشف عن فلوريميتريك حضور Zn2 +، وضعت أولاً شيباتا18 وتكييفها مؤخرا والأمثل ديريفاتيزي مع خلات الزنك 500 ملم ككاشف العمود بعد، مما يسمح لأكثر الكشف عن كميات nanomolar الذاتية، من كينا في الدماغ11.

لتحفيز إنتاج كينا حيثياته الذاتية كما هو موضح في هذا البروتوكول، يتم حقن كينورينيني بيوبريكورسور مباشرة إينترابيريتونيلي (القائمة) بالنسبة للفئران. في تركيبة مع تقييمات البيوكيميائية تحديد درجة إنتاج كينا، آثار كينورينيني التحدي على الذاكرة هيبوكامبال المعتمدة (نموذج الأبطال السلبي) وبنية النوم-اليقظة (إشارات EEG وفريق الإدارة البيئية) أيضا 11من التحقيق. مزيج من هذه التقنيات تسمح لدراسة أثر البيوكيميائية والوظيفية من كينورينيني التحدي في فيفو في الفئران.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

لدينا البروتوكولات التجريبية كانت وافقت عليها لجنة الاستخدام ومؤسسات الرعاية الحيوانية في جامعة ميريلاند، واتباع دليل "المعاهد الوطنية للصحة" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

ملاحظة: استخدمت ويستار الذكور البالغين (250 – 350 غ) في جميع التجارب. واستخدمت مجموعات منفصلة من الحيوانات لتحليل الكيمياء الحيوية، والتجارب السلوكية، وتسجيلات النوم-اليقظة. تم إيواء الحيوانات في منشأة للتحكم في درجة الحرارة في مركز أبحاث الأمراض النفسية بولاية ماريلاند. وضعوا على دورة ضوء الظلام ح 12/12، مع الأضواء الوقت زيتجيبير (ZT) 0 والانوار في ZT 12. تلقي الحيوانات متواصلة للحصول على الغذاء والماء خلال التجارب. وكان معتمداً المرفق تماما الرابطة الأمريكية "الاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية".

1-كينورينيني داخل الإدارة للفئران

ملاحظة: في هذا البروتوكول، كينورينيني كانت تدار في ZT 0 (بداية المرحلة الخفيفة) وتم جمع الأنسجة في ZT 2 و ZT 4 لتحديد مسار وقت استقلاب كينورينيني. واستخدمت حقن المحلول الملحي الحيوانات كعنصر تحكم. على سبيل المثال، إذا فأر تزن 500 جرام والجرعة المطلوبة 100 مغ/كغ، يجب أن تتلقى الفئران حقن 5 مل الحل 10 ملغ/مل من كينورينيني.

  1. تزن من كبريتات L-كينورينيني ("كينورينيني") ووضعه في قنينة زجاج 20 مل. تأكد من الحفاظ كينورينيني على الجليد في جميع الأوقات.
  2. إضافة المحلول الملحي لتحقيق التركيز المطلوب وضبط درجة الحموضة إلى 7.6 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم N 1 (هيدروكسيد الصوديوم). دوامة و sonicate الحل حتى كينورينيني قد حلت تماما.
    تنبيه: اتبع كل توصية الاحتياطات أثناء التعامل مع هيدروكسيد الصوديوم.
    1. على سبيل المثال، للتوصل إلى حل 10 ملغ/مل، يزن من 200 مغ كينورينيني ووضعه في قنينة زجاجية. إضافة 15 مل من المحلول الملحي ودوامه و sonicate (20 كيلوهرتز ل 5 – 10 ق، ميكروتيب قطرها 1/8 بوصة) إلى حل. باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، ضبط الأس الهيدروجيني للحل. وأخيراً، استخدام المياه المالحة لضبط حجم الصوت إلى 20 مل.
  3. تزن كل الفئران التجريبية وحساب حجم حقن كل على أساس وزن الجسم الحيوان وجرعة العلاج المطلوب. بعناية إزالة الحيوان من قفصة المنزل وحقن الحل إينترابيريتونيلي وإرجاع الحيوان إلى قفصة.

2-كينورينيني القياسات باستخدام عالية الأداء اللوني السائل

  1. جمع الأنسجة
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، كينورينيني كانت تدار في ZT 0 (بداية المرحلة الخفيفة) وتم جمع الأنسجة في ZT 2 و ZT 4 لتحديد مسار وقت استقلاب كينورينيني. واستخدمت حقن المحلول الملحي الحيوانات كعنصر تحكم.
    1. استخدام ثاني أكسيد الكربون إلى euthanize الحيوان. بعد توقف علامات التنفس لمدة 1 دقيقة، تنفيذ أسلوب القتل رحيم ثانوية بقطع الرأس.
    2. لجمع الدم الجذع كله، ضع قمع المتاح إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 20 ميكروليتر من ك3-يدتا (0.5 م). يسمح الدم إلى استنزاف من الجسم في الأنبوب. عكس أنبوب مرارا وتكرارا للتأكد من يدتا مختلطة في جميع أنحاء.
    3. باستخدام مقص، قطع الجلد العلوي من الرأس إلى أسفل خط الوسط لفضح الجمجمة. قم بإزالة أي عضلة الرقبة الزائدة على الجزء الخلفي من الجمجمة، وفي الجلسة الافتتاحية للحبل الشوكي، قطع طريق الجمجمة من الخلف إلى الأمام.
      1. اجذب جانبي الجمجمة مفتوحة لكشف الدماغ، وثم إزالة الدماغ بعناية مع الملقط حتى لا تتعرض للضرر. إزالة المصابيح شمي بشفرة حلاقة وقص الدماغ في نصف أسفل خط الوسط. استخدام الملقط، تشريح هيميبرين في المناطق ذات الاهتمام (أي، في قرن آمون والقشرة).
    4. ضع جميع قطع تشريح الدماغ في رقائق الألومنيوم في الثلج الجاف. بعد أن جمدت تماما الأنسجة، أنه نقل إلى قنينة بلاستيكية 20 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    5. الطرد المركزي الدم الجذع كله في 300 x ز 10 دقيقة إزالة المادة طافية (البلازما) وتحويلها إلى أنابيب الطرد المركزي الجديدة قبل تخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. إعداد نموذج
    1. البلازما: جمعت من الحيوانات المعالجة
      1. ذوبان الجليد على أنبوب المجمدة مع البلازما (راجع الخطوة 2، 1 لجمع الأنسجة) على الجليد الرطب.
      2. في أنبوب الطرد مركزي جديد، تخفف العينة بالماء عالي النقاوة (1:2 كينورينيني، 01:10 كينا). إلى 100 ميكروليتر من عينة مخففة، إضافة 25 ميكروليتر من حمض بيرتشلوريك 6%.
        تنبيه: اتبع كل توصية الاحتياطات أثناء التعامل مع حمض بيرتشلوريك.
      3. دوامة جميع العينات، ثم الطرد المركزي لهم في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق. عند الانتهاء من إزالة 100 ميكروليتر من المادة طافية (من كل أنبوبة) ووضعها في أنبوب صغير 0.25 مل ميكروسينتريفوجي كينورينيني أو التصميم كينا.
    2. الدماغ: جمعت من الحيوانات المعالجة
      1. وضع أنابيب مع عينات الدماغ المجمدة (راجع الخطوة 2، 1 لجمع الأنسجة) على الثلج الجاف. فردي وزن كل عينة الدماغ على توازن تحليلية دقيقة. إعادته إلى الأنبوب ووضعه مرة أخرى على الثلج الجاف.
      2. بعد قد تم وزن جميع العينات، تنتقل هذه الأنابيب في الجليد الرطب. تمييع كل عينة 01:10 w/v مع الماء عالي النقاوة وتجانسه لهم باستخدام سونيكاتور (20 كيلوهرتز ل 5 – 10 ق، ميكروتيب قطرها 1/8 بوصة). على سبيل المثال، من أجل 100 مغ أنسجة المخ، إضافة 900 ميكروليتر من الماء عالي النقاوة.
      3. الكوة ميكروليتر 100 كل تضعف عينة إلى أنبوب جديد وأسيديفي أنه مع 25 ميكروليتر من حمض بيرتشلوريك 25%. دوامة، ثم الطرد المركزي في س 12,000 ز لمدة 10 دقائق.
      4. بعد الطرد المركزي، إزالة 100 ميكروليتر من المادة طافية ووضعه في أنابيب صغيرة 0.25 مل ميكروسينتريفوجي لتحديد كينا.
  3. [هبلك] إنشاء وتشغيل
    1. تحضير خلات الصوديوم 50 مم المرحلة المتنقلة. حل ز 6.81 من ثلاثي اسيتات الصوديوم في 1 لتر الماء عالي النقاوة. ضبط درجة الحموضة إلى 6.2 باستخدام حمض الخليك الجليدية والفراغ ثم تصفية في تنظيف الأواني الزجاجية. نقل المرحلة المتنقلة خلات الصوديوم باستخدام زجاجة زجاجية 1 لتر نظيفة.
    2. تحضير خلات الزنك 500 ملم. حل 54.88 ز خلات الزنك في 500 مل الماء عالي النقاوة، ثم تصفية الفراغ. أنه نقل إلى زجاجة زجاجية نظيفة 500 مل. ملء زجاجة 1 لتر ماء عالي النقاوة وزجاجة 500 مل مع الاسيتو الانيتريل الصف [هبلك].
    3. ضع الأنابيب المدخول من الجهاز [هبلك] على حدة في مرحلة المتنقلة والماء عالي النقاوة والاسيتو الانيتريل 100%. مضخة الحل خلات الزنك بشكل منفصل عن طريق مضخة تمعجية أن يجمع مع العمود بعد انتهاء المرحلة المتنقلة، وقبل derivatization.
    4. استخدام لوحة التحكم على الجهاز، برنامج تشغيله الاسيتو الانيتريل 5% و 95% من الماء عالي النقاوة في 0.5 مل/دقيقة تسمح بتشغيل ل 20-30 دقيقة لتحقيق الضغط مستقر وخط الأساس.
    5. عند إنشاء خط أساس مستقر، قم بتغيير تكوين الحل إلى الاسيتو الانيتريل 5% و 95% خلات الصوديوم المرحلة المتنقلة. حجته لمدة 30 دقيقة.
    6. قم بتشغيل المصباح في الكاشف ومضان والسماح لها بالدفء.
    7. وفي الوقت نفسه، أيضا تشغيل المضخة بعد العمود إلى معدل تدفق 0.1 مل/دقيقة تسمح لها بالوصول إلى ضغط ثابت من حوالي 500 رطل بعد حوالي 20 دقيقة.
    8. إعداد المعايير.
      1. كينا، تبدأ بحل أسهم 1 مم، وتخفف من إعداد 5 التركيزات القياسية (أي، 10 نانومتر، 5 نانومتر، 2.5 نانومتر، 1 نانومتر، و 500 م).
        ملاحظة: هذا سوف ينتج منحنى قياسية تتراوح بين 200 فموليس فموليس 10 الواحدة 20 ميكروليتر الحقن.
      2. كينورينيني، تبدأ بحل أسهم 1 مم، وتخفف من إعداد 5 التركيزات القياسية (أي، 10 ميكرومترات، 5 ميكرومترات، 2.5 ميكرومتر، 1 ميكرومتر، و 500 nM).
        ملاحظة: هذا سوف ينتج منحنى قياسية تتراوح بين 200 بموليس بموليس 10 الواحدة 20 ميكروليتر الحقن.
    9. قم بإعداد برنامج النظام [هبلك] للتحكم المعلمات تسلسل عينة والسماح أوتوينجيكتيونس لعينات متعددة.
      1. عندما تكون على الشاشة "تشغيل نموذج"، انقر فوق "ملف"، واسحب لأسفل إلى "إنشاء نموذج مجموعة جديدة". عند فتح إطار جديد، حدد "فارغ". منفردة قائمة بجميع المعايير (راجع الخطوة 2.3.8) أو عينات في النظام ينبغي أن يتم تشغيلها.
      2. في العمود "دالة"، تعيين المعايير والعينات. وينبغي أن جزيئي المعايير في بداية ونهاية التسلسل. ضخ المياه من بين كل 5 عينات.
      3. تعيين وقت التشغيل لكل عينة إلى 15 دقيقة حقن 20 ميكروليتر من العينة من المعايير وإعداد البلازما أو حقن 30 ميكروليتر من العينة من إعداد هوموجيناتي الدماغ.
      4. تعيين أطوال موجية الإثارة والانبعاثات (اعتماداً على المجمع يجري تقييمها) كينورينيني للإثارة: 365 نانومتر، والانبعاثات: 480 نانومتر، والاحتفاظ بالوقت: دقيقة ~ 6، كينا للإثارة: 344 نيوتن متر، والانبعاثات: 398 شمال البحر الأبيض المتوسط، والاحتفاظ بالوقت: ~ 11 دقيقة.
      5. مرة واحدة وقد تم تعيين كافة معلمات وقد اكويليبراتيد الجهاز، تشغيل التسلسل.
      6. لتحديد حجم البيانات، انتقل إلى الشاشة "استعراض المشروع". ضمن علامة التبويب "مجموعات عينة"، انقر نقراً مزدوجاً فوق النموذج تعيين كمياً. من قائمة جميع الحقن، تسليط الضوء على جميع المعايير، وانقر بالزر الأيمن. في النافذة الجديدة، اختر "عملية"، ثم استخدم القائمة المنسدلة لتحديد "معايرة وكوانتيتاتي" بجوار "كيف":.
      7. تسليط الضوء على جميع المعايير مرة أخرى، انقر بالزر الأيمن واختر "استعراض". عند فتح تشروماتوجرامس، استخدم الأزرار الموجودة على طول الجزء العلوي إلى "دمج" وثم "معايرة" كل معيار؛ هذا سوف تلقائياً إنشاء المنحنى المعياري.
      8. أرجع إلى علامة التبويب "مجموعات عينة" وانقر نقراً مزدوجاً فوق مجموعة العينات. وبعد ذلك، تسلط الضوء على جميع المعايير. تكرار العملية المذكورة أعلاه، ولكن بدلاً من ذلك، تحديد "كوانتيتاتي" من القائمة المنسدلة. تسليط الضوء على جميع العينات مرة أخرى، ثم انقر بالزر الأيمن واختر "استعراض". عند فتح تشروماتوجرامس، استخدم الأزرار الموجودة على طول الجزء العلوي إلى "دمج" وثم "كوانتيتاتي" كل عينة.
        ملاحظة: هذا سيتم إخراج تركيز كل عينة استناداً إلى المنحنى القياسي الذي تم إنشاؤه مسبقاً.

3-نموذج الأبطال السلبي

ملاحظة: تم تصميم هذه التجارب السلوكية استناداً إلى استنتاجاتنا البيوكيميائية مع التحدي كينورينيني الحاد. لتحقيق أقصى زيادة في الدماغ كينا، تدار كينورينيني (100 مغ/كغ) في ZT 0، ح 2 قبل الدورة التدريبية في نموذج الأبطال السلبي لاختبار هيبوكامبال بوساطة التعلم، الذي وقع في ZT 2. الجهاز يتألف من 2 متساوية الحجم مقصورات (21.3 سم ارتفاع، سم 20.3 سم واسعة، و 15.9 العميق) مفصولة بباب مقصلة والواردة ضمن مربع عازلة للصوت. المقصورات اثنين من جهاز اختبار تسمى "ضوء الجانب" و "الجانب المظلم". جدران جانبية خفيفة واضحة، وأثناء المحاكمات، وضوء سوف بدوره على أن تضيء أخرى هذه المقصورة. وتغطي جدران حجرة مظلمة تماما للحفاظ على حالة تعتيم.

  1. يوم 1: التدريب الابتدائية
    1. قبل اختبار وتنظيف الجهاز مع الإيثانول 70%.
    2. جلب الحيوانات إلى غرفة الاختبار.
    3. بلطف ضع الحيوانات التجريبية في ضوء الجانب الجهاز وإغلاق ومزلاج باب الجهاز ومربع عازلة للصوت.
    4. باستخدام البرمجيات المرتبطة بها، تبدأ المحاكمة. من الشاشة الرئيسية، اختر "ملف" ثم "دورة مفتوحة" من القائمة المنسدلة. في نافذة جديدة، تأكد من تحديد الإجراء الصحيح، والأجهزة، وانقر فوق "إغلاق". كخطوة تالية، حدد "تكوين" ومن ثم "الإشارات". في النافذة الجديدة، حدد الجهاز الصحيح ثم انقر فوق "القضية".
      ملاحظة: سيتم بدء البرنامج ضوء لتشغيل في الجانب خفيفة على الجهاز وفتح الباب مقصلة بين المقصورات اثنين. وسوف يشرع جهاز ضبط وقت.
    5. عندما يدخل الحيوان تماما الجانب المظلم من الجهاز ومقصلة الباب سيتم إغلاق، وحدوث صدمة قدم التي لا مفر منها (0.56 mA 1 s) سيتم تسليمها.
    6. سجل الوقت الذي انقضى قبل إدخال الحيوان في حجرة مظلمة.
    7. بعد تلقي هذا الحيوان الصدمة، تسمح 30 ثانية وقت الانتعاش قبل إزالة الحيوان من الجهاز.
    8. ضع الجزء الخلفي الحيوان في قفصة المنزل.
    9. قبل بدء المحاكمة بالحيوان القادم، يمسح أجهزة نظيفة مع منشفة رطبة والتخلص من أي الكريات البراز.
    10. بعد أن تم تدريب جميع الحيوانات، إعادتها إلى مرفق الحيوان.
  2. يوم 2: اختبار المحاكمة
    1. جلب الحيوانات مرة أخرى إلى غرفة الاختبار 24 ساعة بعد المحاكمة التدريب. تبدأ المحاكمة اختبار للحيوان أولاً قبل وضعه في الجانب خفيفة على الجهاز وإغلاق وغلق الباب ومربع عازلة للصوت.
    2. بدء محاكمة الاختبار باستخدام الأوامر البرمجيات نفسها كما اليوم السابق؛ سيتم تشغيل الضوء في الجانب خفيفة على الجهاز وسيتم فتح الباب مقصلة بين المقصورات اثنين. وسوف يشرع جهاز ضبط وقت.
    3. عندما يدخل الحيوان في حجرة مظلمة، سيتم إغلاق باب المقصلة. سجل الوقت المنقضي.
      ملاحظة: سيتم إنهاء المحاكمة عن طريق البرنامج بعد مدة أقصاها 300 s إذا كان الحيوان لا يزال على الجانب الضوء جهاز الاختبار.
    4. ضع ظهر الحيوان في قفص المنزل بهم وتنظيف الجهاز (كما هو موضح في الخطوة 3.1.9) قبل بدء المحاكمة بالحيوان القادم.

4. النوم في التحليل

  1. جراحة زرع جهاز إرسال لاسلكي EEG/EMG
    ملاحظة: ينبغي تعقيم أجهزة الإرسال القياس البعدي وإعدادها قبل الجراحة.
    1. باستخدام شفرة حلاقة، إزالة طول صغيرة من طلاء البلاستيك لتكشف عن الأسلاك ويؤدي بلطف. وضع أجهزة الإرسال في أنبوب 50 مل مخروطية مليئة تعقيم الحل [مثلاً، وافيسيدي (2.65 ٪ glutaraldehyde)].
      1. ترك أجهزة الإرسال في الحل تطهير لمالا يقل عن 12 ح. ثم، قبل الجراحة، نقل الحل إلى حاوية نفايات. شطف الإرسال مع المالحة العقيمة.
    2. في يوم الجراحة، وزن الحيوان قبل وضعه في دائرة لتخدير. حمل isoflurane 3 – 5% مع 100% O2.
    3. بناء تخدير ناجح، إزالة الحيوان ويحلق بعناية، باستخدام حلاقة الكهربائية، الجزء العلوي من الرأس والرقبة، وكذلك قطعة صغيرة من الشعر على الجزء الخلفي من الجسم، ويترك قليلاً فقط، وأدناه في القفص الصدري.
    4. إدارة والايبوبروفين (5 مغ/كغ) تحت الجلد للمسكنات بعد العملية الجراحية.
    5. ضع وسادة تدفئة المياه الدافئة التي تسيطر عليها حرارياً تعيين عند 37 درجة مئوية تحت الحيوان للحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان أثناء الجراحة.
    6. في إطار ستيريوتاكسيك، ووضع الحيوان على مخروط الآنف الحفاظ على شرط مخدر ووضع أشرطة الإذن لتحقيق الاستقرار في الرأس. تعقيم الجلد حلق بالتناوب مسحات إيثانول تدين فرك و 70%. تطبيق مرهم أوبثالاميك للعيون لتليين لهم.
    7. للتأكد من التخدير الكافي قبل الشق الأول، استخدم اختبار تو-قرصه.
    8. استخدام مشرط معقم، جعل شق من خلف العينين وصولاً إلى الجزء الخلفي الرقبة. ينبغي أن تتعرض الجمجمة والعضلات الظهرية عنق الرحم.
    9. إذا لزم الأمر للكشف عن الجمجمة، استخدم القطن ذات الرؤوس قضيب تطبيق لإزالة أي أغشية. يمكن استخدام المشابك الصغيرة-لدغ عقد الجلد بعيداً عن الجمجمة. قم بتحديد موقع ووضع علامة على موضع بريجما. حفر ثقوب لدغ 2 وإدراج مسامير معدنية الأمامي 2.0 مم/+ 1.5 مم الجانبي و 7.0 ملم الخلفي/1.5 مم الأفقي بالنسبة بريجما. الثورات 2 كاملة تضييق الخناق. تغطي الجمجمة المكشوفة بقطعة من الشاش.
    10. باستخدام مقص الجراحية المعقمة، جعل شق في تجويف الجسم، أسفل الأضلاع.
    11. في صفحة العمليات الجراحية، تأكد من تسجيل الرقم التسلسلي لجهاز الإرسال يتم زرعها.
    12. قم بإدراج جهاز الإرسال العقيمة داخل تجويف الجسم. العملاء المتوقعون الأسلاك ينبغي أن يظل خارج الجسم.
    13. استخدام خيوط قابلة للامتصاص لغرزة الجدار العضلات، ضمان أن كافة العملاء المتوقعين مجتمعون لنهاية واحدة للشق.
    14. إزالة الشاش من رأسه ورفع الجلد فقط دون الشق. تشغيل زوج من هيموستاتس العقيمة منذ فترة طويلة تحت الجلد من شق رأسه إلى الشق في الجانب. إبقاء الضغط على الجلد لتقليل أي ضرر.
      1. بمجرد هيموستاتس مرئية قرب شق الجسم، مقطع أي الغشاء الذي قد تغطي لهم المقص الجراحي وانتزاع يؤدي الإرسال أربعة مع هيموستاتس. رسم ببطء إلى هيموستاتس، حيث أن الأسلاك تقع تحت الجلد، والتي سبقت في الجمجمة.
    15. المعين الذي يؤدي 2 سوف تكون متصلاً بالجمجمة. استخدام الملقط، فهم نهاية سلك يد واحدة وأسفل نهاية غمد البلاستيك مع الآخر. سحب على السلك حتى يمكن فقط إجراء الحلقات الفردية.
    16. أحكام التفاف الأسلاك المكشوفة حول واحدة من مسامير معدنية العاشر 3 – 4. بمجرد تأمين، تشديد المسمار الحيلولة دون كشف الأسلاك وقصاصات إيقاف أي سلك إضافي. كرر هذه العملية مع الرصاص الثانية والمسمار.
    17. اسحب كلا يؤدي التخطيط الدماغي من تجويف الجسم حيث كانوا يجلسون دافئ ضد الجمجمة.
    18. استخدام الأسمنت الأسنان لتغطية المسامير ويؤدي القشرية، وخلق غطاء الجمجمة المكشوفة. تأكد من أنه لا يوجد أسمنت الأسنان العصي للجلد أو العضلات وأن يتم إنشاء لا حواف حادة. تسمح للإسمنت الأسنان الجافة.
      ملاحظة: ينبغي أن تكون صغيرة بما يكفي أن يمكن خياطة الجلد على أعلى الغطاء.
    19. ليقود فريق الإدارة البيئية، فهم نهاية الأسلاك وغمد البلاستيك كما هو موضح في الخطوة 4.1.15. تمدد الأسلاك حتى فرد الحلقات بوضوح ملحوظ.
    20. تشغيل إبرة ز 22 تحت عضلة الرقبة إلى الجانب الأيمن ل 2 – 3 مم قبل السماح له بالظهور. استخدام خيوط نونابسوربابل، ضع خياطة واحدة، فضفاضة حول الإبرة المضمنة.
    21. سلك مؤشر ترابط فريق الإدارة البيئية في الإبرة وسحب سلك الإبرة، السماح لفريق الإدارة البيئية إلى مؤشر ترابط تحت العضلات. تشديد الخياطة التأكد من الأسلاك لا يزال قائما ومقطع الأسلاك الإضافية التي قد تنشأ من العضلات.
    22. كرر الخطوات 4.1.20 و 4.1.21 لقيادة فريق الإدارة البيئية الثانية، حوالي 1 ملم إلى أسفل من زمام المبادرة الأولى.
    23. اسحب كلا يؤدي فريق الإدارة البيئية من تجويف الجسم حيث كانوا يجلسون دافئ ضد العضلات.
    24. استخدام غرز نونابسوربابل لإغلاق شق الرأس والرقبة. شد جميع الأسلاك الزائدة تحت جلد الجسم واستخدام مقاطع الجرح لإغلاق شق الجسم.
    25. تطبيق مرهم الليدوكايين على كلا الموقعين شق لمساعدة الحيوان مع الألم بعد العمل الجراحي.
    26. إرجاع الحيوان إلى قفصة المنزل، السماح للقفص الجلوس على منصة التدفئة حتى الحيوان وتعافي من التخدير.
      ملاحظة: ينبغي أن تسترد الحيوان لمدة 7 – 10 أيام قبل بداية التسجيلات.
  2. تسجيل EEG/EMG
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، نحن إدارة المياه المالحة أو كينورينيني في ZT 0 وتسجيلها ثم أنماط النوم-التنبيه للحيوان ح 24.
    1. إكمال جميع التسجيلات النوم في غرفة معينة حيث لا تتم مقاطعة الحيوانات خلال مدة التسجيل.
    2. ضع القفص منزل الحيوان (مع جهاز الإرسال EEG/EMG مزروع) في وحدة استقبال. قم بتشغيل جهاز الإرسال مزروع جراحيا باستخدام مغناطيس.
      ملاحظة: يجب أن تظهر ضوء على وحدة المتلقي عند تنشيط جهاز الإرسال.
    3. إعداد تسجيل البيانات التخطيط الدماغي/فريق الإدارة البيئية باستخدام البرنامج المقترن.
      1. حدد "التجربة"، ثم "إنشاء" من القائمة المنسدلة. اسم التجربة، ومن ثم حفظه. وبعد ذلك، حدد "الأجهزة" ومن ثم "تحرير تكوين MX2".
      2. في نافذة جديدة، قم بتحديد جميع أجهزة الإرسال المستخدمة في التجربة وتشير إلى يقترن فيها لوحة تلقي كل. عندما تكون جاهزاً، بدء التسجيل عن طريق الضغط على '' "استمرار جميع ابدأ" ''.
    4. في إنهاء التجارب، حدد '' "استمرار جميع وقف" '' في البرمجيات المرتبطة بها وإيقاف تشغيل أجهزة الإرسال باستخدام المغناطيس.
    5. Euthanize الحيوانات CO2 خنقاً متبوعاً بثقب القلب ب. إزالة جهاز الإرسال بعناية قبل إعادة فتح شق على طول الجزء العلوي من الرأس بالمقص الجراحي وقطع يؤدي خالية من الأسنان العضلات الأسمنت والرقبة.
    6. بعد ذلك، فتح تجويف الجسم وتحديد موقع جهاز الإرسال وإزالته ببطء من الجسم.
  3. تحليل EEG/EMG
    1. استخدام البرمجيات المرتبطة بتحليل البيانات النوم-اليقظة. افتح البرنامج وحدد "إضافة موقع جديد". في نافذة جديدة، قم بتحديد البيانات المراد استيرادها إلى البرنامج التهديف.
      ملاحظة: هذا سوف إنشاء ملف جديد داخل البرنامج التي تحتوي على كل من الطول الموجي الخام التي تم جمعها من خلال التجربة.
    2. يدوياً نقاط الدول اليقظة لتجارب المرجوة. بعد التسجيل، تحليل المعلمات مثل المدة الإجمالية وعدد نوبات نوبة متوسط مدة مختلف الدول اليقظة [حركة العين السريعة (REM) وغير REM نريم-أعقاب].
      ملاحظة: يمكن أن يقوم على تسجيل كامل التحليل أو تقصير لوقت محدد النقاط المثيرة للاهتمام. هنا، أجرى التحليل لفترة التسجيل بين ZT 0 إلى ZT 2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من صحة استخدام حقن كينورينيني داخل كوسيلة للارتقاء بالدماغ كينا، أجرى تحليل الأنسجة [هبلك]. المنحنيات القياسية (الشكل 1) وشيدت باستخدام البرمجيات المرتبطة بها، وسمح للتحديد الكمي لعينات الأنسجة. تشروماتوجرامس ممثل كينورينيني وكينا ترد في الشكل 2. كينورينيني لوحظ في وقت احتفاظ 6 دقيقة، وكينا وكان وقت استبقاء من 11 دقيقة. لمراقبة ديناميات عملية كيمبرلي، كانت تدار 100 مغ/كغ كينورينيني في هذا البروتوكول، وتم جمع الأنسجة مباشرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لتقييم موثوق كينا في الدماغ بعد إقامة كينورينيني طرفية، من المهم لجمع وتفسير التجارب البيوكيميائية والوظيفية. نقدم هنا، بروتوكول تفصيلية تسمح للمستخدمين الجدد وضع أساليب فعالة لقياس كينورينيني البلازما والمخ كينا فئران. قياس كينورينيني في البلازما وأكدت حقن دقيقة وقياس المستقلب كينا يؤكد التوليف حيثياته في الدماغ. وهناك العديد من المزايا للأسلوب [هبلك] فلوروميتريك الموصوفة، مقتبس من شيباتا18، ديريفاتيزي كينا حضور Zn2 +، بما في ذلك القدرة على دقة الكشف عن المبالغ الذاتية كينا في...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

بتمويل هذه الدراسة في جزء من "المعاهد الوطنية للصحة" (R01 NS102209) ومنحة من "صندوق فوربس كلير هاء".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
فئران ويستار مختبراتتشارلز ريفرذكر بالغ ، 250-350 جم
كبريتات L-kynurenineSai Advantium
ReproSil-Pur C18 العمود (4 مم × 150 مم)Dr. Maisch GmbH
EZ ClipsStoelting Co.59022
مسامير مواد التركيبالبلاستيك One00-96 X 1/16
خيوط غير قابلة للامتصاصMedRep Express699BCP خيوط نايلون سوداء أحادية اللون الطبية ، 4-0 ، P-3 ، 18 بوصة ، صندوق من 12
خيوط قابلة للامتصاصEthiconJ310H4-0 المغلفة Vicryl Violet 1X27 '' SH-1
شركة الأسمنت للأسنانStoelting Co.51458
مثقابStoelting Co.5145510.45 مم
<قوي > الاسم < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / strong > التعليقات < / strong >
< strong > نظام HPLC التحالف < / strong >
وحدة الفصلWaters176269503
2475 كاشف التألقالمياه186247500
مدير كاشف ما بعد العمودWaters725000556
Lenovo كمبيوترWaters668000249
تمكين البرامجWaters176706100
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>صندوق تجنب سلبي للفئران< / قوي>
مقصورة مخففة للصوت MDF طويل القامةMedAssociatesENV-018MDالداخلية: 22 بوصة (عرض) × 22 بوصة (ارتفاع) × 16 بوصة (عمق) غرفة
صندوق مكوك معدل القناة المركزيةMedAssociatesENV-010MC
أرضية شبكة من الفولاذ المقاوم للصدأ للفئرانMedAssociatesENV-010MB-GF
باب المقصلة الأوتوماتيكيMedAssociatesENV-010B-S
أرضية شبكة المكوك سريع الفصل لضوءتحفيز MedAssociatesENV-010MB-QD
، عدسة بيضاء مقاس 1 بوصة ، مثبتة على لوحة معياريةMedAssociatesENV-221M
وحدة Sonalert مع التحكم في مستوى الصوت لغرفة الفئرانMedAssociatesENV-223AM
SmartCtrl 8 إدخال / 16 حزمة إخراجMedAssociatesDIG-716P2
8 قنوات التحكم بالأشعة تحت الحمراء لصناديق المكوكMedAssociatesENV-253C
مصدر الأشعة تحت الحمراء وشرائط صفيف dectectorMedAssociatesENV-256
خزانة واجهة منضدية ، 120 فولت 60 هرتزMedAssociatesSG-6080C
وحدة تحفيز كرهية تيار مستمر مزدوجة المدىMedAssociatesENV-410B
وحدة تشويش إذاعي أرضية شبكية صلبةMedAssociatesENV-412
وحدة التحكم في الصدمات المزدوجة A / BMedAssociatesENV-415
2 '3 دبوس تمديد موليكس صغيرMedAssociatesSG-216A-2
10 'كابل إخراج الصدمات ، DB-9 M / FMedAssociatesSG-219G-10
كابل التحكم في الصدمات المكوكية 15 '، 6MedAssociatesSG-219SA
خزانة منضدية صغيرة ومصدر طاقة ، 120 فولت 60 هرتزحزمة واجهة MedAssociatesSG-6080D
PCIحزمة أدوات تجنب صندوق المكوك MedAssociates
SOF-700RA-7
Name< / strong>< قوي>الشركة< / قوي><قوي> رقم الكتالوج< / strong>تعليقات< / strong>
معدات مراقبة النوم والاستيقاظ< / قوي>
Ponehmah SoftwareData Sciences International (DSI)PNP-P3P-610
MX2 8 واجهة اكتساب المصدرالدولية لعلوم البيانات (DSI)PNM-P3P-MX204
كمبيوتر Dell ، Optiplex 7020 ، Windows 7 ، 64 بتData Sciences International (DSI)271-0112-013
شاشة كمبيوتر Dell مقاس 19 بوصةData Sciences International (DSI)271-0113-001
أجهزة استقبال للأقفاص البلاستيكية ، 8xData Sciences International (DSI)272-6001-001
Cisco RV130 VPN routerData Sciences International (DSI)RV130
مصفوفة 2.0الدولية لعلوم البيانات (DSI)271-0119-001
تبديل البيانات الدولية (DSI)SG200-08P
برنامج Neuroscoreالدولية لعلوم البيانات (DSI)271-0171-CFG
جهاز إرسال قناتين حيويتين محتملتين ، نموذج TL11M2-F40-EETالدولية لعلوم البيانات (DSI)270-0134-001
E2695 حزام شبكة

المراجع

  1. Leklem, J. E. Quantitative aspects of tryptophan metabolism in humans and other species: a review. The American Journal of Clinical Nutrition. 24 (6), 659-672 (1971).
  2. Pocivavsek, A., Notarangelo, F. M., Wu, H. Q., Bruno, J. P., Schwarcz, R. Astrocytes as Pharmacological Targets in the Treatment of Schizophrenia: Focus on Kynurenic Acid. Modeling the Psychophathological Dimensions of Schizophrenia - From Molecules to Behavior. Pletnikov, M. V., Waddington, J. L. , Elsevier, Academic Press. London, San Diego, Waltham, Oxford. 423-443 (2016).
  3. Hilmas, C., et al. The brain metabolite kynurenic acid inhibits alpha7 nicotinic receptor activity and increases non-alpha7 nicotinic receptor expression: physiopathological implications. Journal of Neuroscience. 21 (19), 7463-7473 (2001).
  4. Perkins, M. N., Stone, T. W. An iontophoretic investigation of the actions of convulsant kynurenines and their interaction with the endogenous excitant quinolinic acid. Brain Research. 247 (1), 184-187 (1982).
  5. DiNatale, B. C., et al. Kynurenic acid is a potent endogenous aryl hydrocarbon receptor ligand that synergistically induces interleukin-6 in the presence of inflammatory signaling. Toxicological Sciences. 115 (1), 89-97 (2010).
  6. Wang, J., et al. Kynurenic acid as a ligand for orphan G protein-coupled receptor GPR35. The Journal of Biological Chemistry. 281 (31), 22021-22028 (2006).
  7. Alexander, K. S., Wu, H. Q., Schwarcz, R., Bruno, J. P. Acute elevations of brain kynurenic acid impair cognitive flexibility: normalization by the alpha7 positive modulator galantamine. Psychopharmacology (Berlin). 220 (3), 627-637 (2012).
  8. Chess, A. C., Landers, A. M., Bucci, D. J. L-kynurenine treatment alters contextual fear conditioning and context discrimination but not cue-specific fear conditioning. Behavioural Brain Research. 201 (2), 325-331 (2009).
  9. Chess, A. C., Simoni, M. K., Alling, T. E., Bucci, D. J. Elevations of endogenous kynurenic acid produce spatial working memory deficits. Schizophrenia Bulletin. 33 (3), 797-804 (2007).
  10. Pocivavsek, A., et al. Fluctuations in endogenous kynurenic acid control hippocampal glutamate and memory. Neuropsychopharmacology. 36 (11), 2357-2367 (2011).
  11. Pocivavsek, A., Baratta, A. M., Mong, J. A., Viechweg, S. S. Acute Kynurenine Challenge Disrupts Sleep-Wake Architecture and Impairs Contextual Memory in Adult Rats. Sleep. 40 (11), (2017).
  12. Halassa, M. M., et al. Astrocytic modulation of sleep homeostasis and cognitive consequences of sleep loss. Neuron. 61 (2), 213-219 (2009).
  13. Erhardt, S., et al. Kynurenic acid levels are elevated in the cerebrospinal fluid of patients with schizophrenia. Neuroscience Letters. 313 (1-2), 96-98 (2001).
  14. Linderholm, K. R., et al. Increased levels of kynurenine and kynurenic acid in the CSF of patients with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 38 (3), 426-432 (2012).
  15. Sathyasaikumar, K. V., et al. Impaired kynurenine pathway metabolism in the prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 37 (6), 1147-1156 (2011).
  16. Schwarcz, R., et al. Increased cortical kynurenate content in schizophrenia. Biological Psychiatry. 50 (7), 521-530 (2001).
  17. Pocivavsek, A., Rowland, L. M. Basic Neuroscience Illuminates Causal Relationship Between Sleep and Memory: Translating to Schizophrenia. Schizophrenia Bulletin. 44 (1), 7-14 (2018).
  18. Shibata, K. Fluorimetric micro-determination of kynurenic acid, an endogenous blocker of neurotoxicity, by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography. 430 (2), 376-380 (1988).
  19. Buzsaki, G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. Journal of Sleep Research. 7, 17-23 (1998).
  20. Graves, L. A., Heller, E. A., Pack, A. I., Abel, T. Sleep deprivation selectively impairs memory consolidation for contextual fear conditioning. Learning & Memory. 10 (3), 168-176 (2003).
  21. Yamashita, M., Yamamoto, T. Tryptophan circuit in fatigue: From blood to brain and cognition. Brain Research. 1675, 116-126 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

KYNA HPLC
قياس لوني سائل عالي الأداء كينورينيني وحمض كينورينيك: الكيمياء الحيوية المتعلقة بالإدراك والنوم في الفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.