استخدام زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم لتقييم أصل متلازمة ميلوديسبلاستيك

ميلوديسبلاستيك المتلازمات (حركة الديمقراطيين الاشتراكيين) تمثل مجموعة متنوعة من اضطرابات الدم الاستنساخ تميزت هيماتوبويسيس غير فعالة، وأدلة مورفولوجك من خلل التنسج، وميل للتحول إلى سرطان الدم النقوي الحاد (AML)^{1،2 ،،}من³⁴. هيماتوبويسيس غير فعالة يعترف اعتقال نضج في نخاع العظام، والنتائج في سيتوبينياس الدم المحيطي على الرغم من نخاع العظم هايبرسيلولار^1،3. قدرت حالات الإصابة بحركة الديمقراطيين الاشتراكيين طرق مختلفة ك 2-12 حالة لكل 000 100 شخص سنوياً في الولايات المتحدة، وحدوث حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يزيد مع التقدم في العمر، مما يجعل هذا شرطا هاما لفهم نظراً لشيخوخة السكان في الولايات المتحدة^{3، 5}. على الرغم من أن معظم الحالات من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين لا مسببات واضحة، وبعض الحالات من حركة الديمقراطيين الاشتراكيين يعتقد أن يكون بسبب التعرض لعوامل سمية جينية معروفة، بما في ذلك المذيبات مثل البنزين، والسرطان العلاج الكيميائي⁶.

حركة الديمقراطيين الاشتراكيين المرضى عادة اكتسبت الطفرات في خلايا حركة الديمقراطيين الاشتراكيين⁷. على الرغم من النادر نسبيا، وقد اكتسبت عددا من المرضى حركة الديمقراطيين الاشتراكيين المولدة الصبغية المتوازنة التي تشمل الجينات مثل NUP98، EVI1، RUNX1 و MLL (http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman). لدينا مختبر مصلحة طويلة الأمد في كروموسوم المولدة، التي تنطوي على الجينات NUP98⁸. الفئران المعدلة وراثيا أن صريح التحوير NUP98-HOXD13 (NHD13) وينظم المروج Vav1 ومحسن عناصر عرض كافة الميزات الرئيسية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين، بما في ذلك سيتوبينياس الدم المحيطي، وأدلة مورفولوجك الانزياح، والتحول إلى مكافحة غسل الأموال⁹ .

على الرغم من أن حركة الديمقراطيين الاشتراكيين قد تم الاعتراف بما يزيد على 60 سنة¹⁰، وتعتبر أن اضطراب خلايا الجذعية الاستنساخ، الجهود الرامية إلى انجرافت الخلايا البشرية حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في الفئران العوز كانت ناجحة إلى حد كبير، لأن خلايا حركة الديمقراطيين الاشتراكيين انجرافت سيئة^{11، 12،،}من¹³¹⁴ والفئران لا تتطور الأمراض السريرية. في محاولة لتحديد الخلايا المكونة للدم التي يمكن أن تنقل حركة الديمقراطيين الاشتراكيين، تحولت إلى نموذج NHD13، وأظهرت أننا يمكن أن انجرافت حركة الديمقراطيين الاشتراكيين ككيان مرض التي أظهرت كافة الميزات الأساسية لحركة الديمقراطيين الاشتراكيين البشرية، بما في ذلك سيتوبينياس الدم المحيطي، الانزياح، و التحول إلى مكافحة غسل الأموال¹⁵. وفي هذا التقرير، نقدم التفاصيل التقنية لهذه التجارب، فضلا عن نهج لزيادة يجزئ الجذعية المكونة للدم والخلايا السليفة (هسبك)، في محاولة لتحديد الخلايا الشروع في حركة الديمقراطيين الاشتراكيين.

الحيوان الإجراءات الموضحة في هذه المقالة قد أقرها المعهد الوطني للسرطان في بيثيسدا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وتتوافق مع السياسات الواردة ضمن "السياسة خدمة الصحة العامة" في رعاية إنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية، قانون الرفق بالحيوان، ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1-إعداد الخلية

1. نخاع العظام الحصاد الأنوية الخلية (بمنك)
   1. استخدام المواد المعقمة فقط. تعقيم أدوات قابلة لإعادة الاستخدام باستخدام اﻷوتوكﻻف بخار. شراء الإبر والمحاقن، والبلاستيك وير في حاويات معقمة تستخدم مرة واحدة. أداء جميع التلاعبات الحيوان وخلية في "الثاني الفئة"، نوع A2 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
   2. إعداد بمنكس في مل 14 جولة الأنبوبة السفلي التي تحتوي على 3 مل HF2 (هانك لموازنة الحل الملح وتستكمل مع 2% مصل بقرى الجنين).
   3. Euthanize C57Bl6 المانحة الفئران (إيجابية بالنسبة CD45 اليل CD45.2)، السن عادة من 2-6 أشهر، باستخدام دائرة₂ CO.
   4. تعقيم الذبيحة الماوس بالرش الإيثانول 70% على الجسم بأكمله مع زجاجة رذاذ. قشر الجلد من الساقين، ومن الحوض وصولاً إلى الكاحل.
   5. إزالة فيمورى وتايبي من الذبيحة باستخدام مقص معقم (مستقيم، شارب/شارب، و 11.5 سم) والملقط (جرايفى، مسنن، عرض تلميح 0.8 ملم). تقليم عضلات المرفق واضح.
   6. قص نهايات الدانية والبعيدة من الساق مع المقص. عقد الساق مع الملقط، إدراج 27-قياس 3 مل حقنه تحتوي على 2.5 مل HF2 في تجويف نخاع الدانية في نهاية القاصي من الساق (الكاحل). مسح خلايا النخاع العظمى من الساق باستخدام ضغط لطيف في مل 14 جولة الأنبوبة السفلي.
      1. كرر الساق الأخرى.
   7. قص نهايات عظم الفخذ الدانية والبعيدة مع المقص. مسح تجويف نخاع عظم الفخذ بإدخال إبرة قياس 20 المرفقة إلى 3 مل حقنه تحتوي على 2.5 مل HF2 في النهاية البعيدة تجويف نخاع عظم الفخذ وتطبيق ضغط لطيف للمحاقن.
      1. كرر لعظم الفخذ الأخرى، جمع جميع نخاع العظام من كلا تايبي وفيمورى في مل 14 نفس الجولة أسفل الأنبوبة.
   8. تفريق كتلة نخاع من يسفط صعودا وهبوطاً عدة مرات مع نفس الإبرة 20-قياس المرفقة للمحاقن مل 3.
2. تلطيخ جسم من بمنك
   1. الكونت بمنك. إضافة 20 ميليلتر من حل حامض الخليك 3% إلى 20 ميليلتر من تعليق بمنك التي تم إنشاؤها في الخطوة 1.1.8. بعد ذلك، عد استخدام هيموسيتوميتير ومجهر مقلوب.
   2. بيليه بمنك بالطرد المركزي لطيف في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه مع HF2 استخدام ميليلتر 90 الواحدة 10⁷ خلايا وإضافة 10 ميليلتر من بيوتينيلاتيد المضادة نسب جسم كوكتيل إلى تعليق خلية.
   3. وبعد حضانة لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية، غسل الخلايا الملون مع 3 مل من المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
   4. ريسوسبيند بمنك مع 100 ميليلتر من HF2 الواحدة 10⁷ الخلايا. إضافة 2 ميليلتر من اللوفيكوسيانين (APC) مترافق البيوتين المضادة الأجسام المضادة إلى تعليق خلية، تليها الحضانة عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   5. أشطف بمنك الملون مع 3 مل من برنامج تلفزيوني وريسوسبيند بمنك مع HF2 تكملة مع 0.2 ميكروغرام/مل من يوديد propidium (PI) للتدفق الخلوي الخلية الفرز.
3. التدفق الخلوي الخلية الفرز من بمنك
   1. معايرة التدفق الخلوي الخلايا فارز. تحسين جميع أنابيب ضوئي (بمتس) ومبعثر والفلورية المعلمات باستخدام خلايا أونستينيد ويقع ضمن نطاق كل كاشف الخطي.
   2. إعداد أونستينيد، ملطخة بي، والمسمى APC النسب خلايا كوكتيل بالتوازي من الخطوة 1، 2. تحليل لتعويض الطيفية.
   3. تميز الخلايا يبنوا طريق النابضة متتابعة ح منتدى التعاون الأمني مقابل SSC-ح، 640-التعاون بين بلدان الجنوب-أ مقابل 640-التعاون بين بلدان الجنوب-ح و 640-التعاون بين بلدان الجنوب-S مقابل 640-التعاون بين بلدان الجنوب-دبليو
   4. استبعاد الخلايا غلق باستخدام PI متحمس في 561 نانومتر والانبعاثات التي يتم جمعها مع مرشح تمرير نطاق 614/20. تثير النسب APC تسمية الخلايا في 640 نانومتر وجمع الانبعاثات مع مرشح تمرير نطاق 671/30.
   5. تسجيل قيم الأسفار كارتفاع الجهد وجمع الأحداث 100,000 على الأقل في قائمة ملفات البيانات وضع تصور السكان يجب أن يتم فرزه.
   6. حساب التعويض الطيفية بعد الحصول على ثلاث عينات من الخلايا 10,000 لما يلي: غير مسمى الخلايا و PI المسماة الخلايا كوكتيل النسب المضادة الأجسام المضادة مترافق مع APC المسماة الخلايا.
   7. تعيين المناطق الثلاث لفرز النسب السلبية (LN)، النسب الإيجابية (ليرة لبنانية) مع شدة الأسفار خافت (LP1)، والسكان ليرة لبنانية مع الأسفار مشرق (LP2) في أنابيب 5 مل تحتوي على 0.5 مل من 10% FBS وسائل الإعلام.
   8. فرز الخلايا باستخدام قطره واحدة المغلف وتنقية وضع الإيقاف قبل الاكتمال.
   9. إجراء تحليل نوع وظيفة مع خلايا مجموع 1,000 على كل عينة تم فرزها التأكد من النقاء والسلامة لفرز الخلايا.
   10. جمع الخلايا تم فرزها باستخدام الطرد المركزي في 450 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وريسوسبيند بيليه الخلية مع 0.5 مل HF2.
   11. تأكيد الخلية فرز رقم هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق. ضبط عدد الخلايا مع HF2 لزرع الأعضاء.
       ملاحظة: طيف واسع من السكان بمنك يمكن أن تكون معزولة لزرع الأعضاء باستخدام مجموعات إضافية من الأجسام المضادة مترافق fluorochrome في خطوة 1.2.2 أعلاه.

2-إعداد الفئران المتلقي وزرع الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسكت)

1. إعداد المتلقين زرع
   1. الحفاظ على الطب البيطري وتربية رعاية كونجينيك الفئران المستفيدة (B6-LY5.1/Cr، CD45.1) في منشأة محددة ممرض حيوانية (منتدى جنوب المحيط الهادئ) مجاناً.
   2. لتطهير الاتقائية لمسار الجهاز الهضمي، توفير المياه المعقمة التي تحتوي على 100 مغ/لتر من مادة سيبروفلوكساسين للمستلمين لمدة 7 أيام قبل التشعيع الجرعة المميتة (9 غراي)، وصيانة لمدة 14 يوما بعد التشعيع.
   3. توفير تشعيع جرعة مميتة (9 غراي) من مصدر خدمات العملاء على النحو التالي. استخدام عامل تشغيل خدمات العملاء المدربين ومصدق. تعيين الصك المصدر Cs لتسليم تشعيع جاما الجسم الكلي كجي في الدقيقة 70. ضع 10 الفئران في حامل خصيصا وإدراج الحامل في قاعة إيرادياتور. تسليم 9 تشعيع الجسم الكلي غراي في 13 دقيقة وتعود الفئران إلى اقفاصها.
2. زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم
   1. مزيج نوع البرية (WT) بمنك من ماوس مستلم كونجينيك (B6-LY5.1/Cr، CD45.1) بجرعة خلية من خلايا 2 × 10⁵ كل الماوس مع 2 إلى 5 × 10⁴ خلايا اختبار المنقي بمنك أعد مع التدفق الخلوي الفرز كما هو موضح في 1-3 أعلاه. مزيج من الخلايا في نفس المحاقن.
      ملاحظة: بمنك WT توفر لها تأثير إشعاع تدخر للماوس المتلقية والسماح لبقاء الماوس المستلم إذا كان اختبار الخلايا لا تدعم هيماتوبويسيس. بمنك WT المستخدمة في هذا النوع من تجربة التعبير عن اليل CD45.1، وهكذا يمكن أن تميز من اختبار الخلايا باستخدام الأجسام المضادة التي تميز بين CD45.1 و CD45.2. الخلايا WT BM يشار إلى "مساعد الخلايا" أو "تجنيب الإشعاع الخلايا" أو "الخلايا المنافس".
   2. ضبط حجم الخليط خلية إلى 200 ميليلتر كل مستلم يستخدم HF2 العقيمة لتسهيل الحقن.
   3. زرع الخلائط خلية إلى الفئران المستفيدة دكت المشع عبر الذيل عن طريق الحقن الوريدي حقن الوريد باستخدام المحاقن 1 مل وابرة قياس 28، ضمن ح 24 التشعيع. ضع ذيل الماوس تحت مصباح حرارة، الحرارة يؤدي إلى تمدد الوريد الذيل.
      ملاحظة: Euthanize جميع الفئران المستفيدة في نهاية الدراسة وتقييم تطور المرض من نيكروبسي، وعلم الأنسجة، والتدفق الخلوي.

3-انجرافتمينت التحليل استخدام "التدفق الخلوي"

1. تقييم engraftment الخلية المانحة، جمع الدم المحيطي (PB) من الفئران المستفيدة في الأسبوع السادس والأسبوع الثاني عشر والأسبوع السادس عشر بعد زرع الأعضاء.
2. الحارة المستلمين الموجودين في القفص مع مصباح الحرارة لحوالي 1 دقيقة ووضع الماوس في ريسترينير.
3. قطع الوريد الذيل مع مشرط (بليد 10، التعامل مع مشرط #3) وجمع 100 ميليلتر من الجريدة الرسمية كل مستلم يستخدم أنبوب ميكروكابيلاري المحتوية على يدتا تخثر الدم.
4. تقسيم الجريدة الرسمية التي تم جمعها إلى مختبرين تساوي اثنين بوضع 50 ميليلتر في أنبوب ميكروسينتريفوجي عقيمة. استخدام أحد قاسمة للألى تعداد الدم الكامل (CBC) (أداء لب الأنسجة NCI) واستخدام قاسمة الثانية لتلطيخ جسم التدفق الخلوي.
5. للكشف عن انجرافتمينت المانحة بالتدفق الخلوي، خلايا الدم الحمراء (RBC) عن طريق إضافة 1 مل من المخزن المؤقت تحلل ربك ناقص التوتر (8.29 غرام/لتر من NH₄Cl، 1 غرام/لتر من كهكو₃، 0.037 غ/لتر من Na₂يدتا، الرقم الهيدروجيني 7.2) إلى 50 ميليلتر من الجريدة الرسمية التي تم جمعها. دوامة العينة لخلط واحتضان 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
6. الطرد المركزي PB ليسيد في 4,600 س ز 1.5 دقيقة نضح المادة طافية بعناية وتجاهل.
7. جزئيا عرقلة بيليه الخلية بلطف التنصت أو "التحريك" الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة مل 1.3 من برنامج تلفزيوني في بيليه الموجود في أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في س 4,600 ز للحد الأدنى 1.5 بعناية أسبيراتي وتجاهل المادة طافية.
8. تعطيل بيليه الخلية عن طريق التنصت أو التحريك، وإضافة 200 ميليلتر من HF2 تستكمل بمصل فأر 5% إلى بيليه الخلية.
9. إضافة CD45.2 مكافحة جسم (1 ميليلتر) مترافق مع اللوفيكوسيانين (APC) إلى تعليق خلية. تبني في 4 درجات مئوية على الأقل 30 دقيقة، وإيجاز دوامة الخليط.
10. بعد تلطيخ، تغسل الخلايا مرتين كما هو موضح أعلاه، وريسوسبيند مع 400 ميليلتر من HF2 تكملة مع 1 ميكروغرام/مل من PI.
11. الكشف عن انجرافتمينت سيتوميتير تدفق 4-لون باستخدام. الحصول على معلومات إضافية حول أنواع الخلايا في الدم المحيطي بإضافة أجسام مضادة إضافية للكشف عن أنواع الخلايا المحددة، مثل الخلايا الليمفاوية B أو T.
12. تسجيل بيانات engraftment التسلسلي باستخدام ورقة انتشار للسماح لمزيد من التحليل للبيانات.

نحن تظهر الأرقام التمثيلية لنتائج تجارب عدة. ويبين الشكل 1 الخلوي تدفق ممثل فرز التجربة. خلال التمايز المكونة للدم العادي، الخلايا أصبحت ملتزمة بنسب المكونة للدم محددة، أنهم الحصول على النسب وتحديد علامات خلية السطحية وتفقد القدرة على التجديد الذاتي. ولذلك، في البرية من نوع الفئران، تنحصر الخلايا الجذعية الذاتي تجديد بمنك النسب السلبية. في هذه التجربة، ونحن فرز بمنك من نخاع العظم NHD13 في النسب النسب السلبية، وانخفاض إيجابية، وارتفاع نسب إيجابية الخلايا. هذه فرز ثم تم زرع الخلايا إلى المستلمين بالوزن لتحديد القدرات الذاتي تجديد.

ويبين الشكل 2 النتائج من تجربة منفصلة، في النسب التي الخلايا السلبية أو تم زرع خلايا لم يتم فرزها من المانحين NHD13 مع حركة الديمقراطيين الاشتراكيين في دكت المشع WT المستلمين. وأعرب الخلايا المانحة NHD13 علامة سطح الخلية CD45.2، بينما الخلايا منافس WT (راجع المقطع 2.2.1 أعلاه) أعرب عن علامة سطح الخلية CD45.1. ويبين الشكل 3 تحليل engraftment المسلسل لم يتم فرزها NHD13 بمنك، أو بمنك NHD13 النسب السلبية. بعد أسبوعين تقريبا من 16، أووتكومبيتي الخلايا NHD13 الخلايا WT، كما يتضح من زيادة نسبة CD45.2 + الخلايا في الدم المحيطي. ويبين الشكل 4 مثالاً للتحول ليوكيميك من ماوس زرع الخلايا NHD13 حركة الديمقراطيين الاشتراكيين.

رقم 1: التدفق الخلوي فرز استراتيجية بمنك ملطخة بجسم النسب كوكتيل. يمثل كل مربع مستطيل على الأرض دوت السكان الخلية فرز هسكت لتقييم وظيفة الخلية. R4, النسب السلبية؛ R5، انخفاض نسب إيجابية؛ R6، إيجابية النسب العالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: ملامح الممثل نظام مراقبة الأصول الميدانية للانزيم انجرافتمينت استخدام جسم CD45.2 مكافحة محددة المانحة. تم زرع المستلم بمنك مع بمنك NHD13 (CD45.2 +) 1 × 106 والمستلم لنبم مع 5 × 104 NHD13 النسب السلبية BM الخلايا (CD45.2 +). في كل حالة من الحالات، استخدمت 2 × 105 WT بمنك (CD45.1 +) كخلايا المنافس. الأرقام في مربعات العلوي والسفلي تمثل CD45.2 الإيجابية (مشتقة من المانحين NHD13) و CD45.2 السلبية (المستمدة من الخلايا منافس WT)، على التوالي، في ما بعد زرع 6 في الأسبوع والأسبوع 24. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: حركية Engraftment المستلمين الفردية بعد زرع الأعضاء- يظهر كل سطر في الرسم البياني فحوصات انجرافتمينت المسلسل الماوس المستلمين الفردية. تم زرع المستفيدين بمنك مع 1 × 106 خلايا من بمنك كله NHD13، وتم زرع المستفيدين لنبم مع 5 × 104 من NHD13 النسب السلبية BM بعد الفرز. ويشير NHD إلى الجهات المانحة NHD13. بي أم، بمنك الفئران المستفيدة؛ لنبم، النسب السلبية BM المتلقية؛ ببمك، خلايا الدم الطرفية مونونوكليتيد. وفي جميع الحالات، أووتكومبيتي الخلايا المانحة NHD13 تدريجيا الخلايا WT. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: تلطيخ أيار-Grünwald Giemsa (مج) من نخاع العظم (بي أم) من المتلقي حركة الديمقراطيين الاشتراكيين التي أحرزت تقدما في مجال مكافحة غسل الأموال- لاحظ وجود العديد من الانفجارات وأشكال غير ناضجة. تشير الأسهم إلى الانفجارات، ورؤوس أسهم تشير إلى أشكال غير ناضجة. 400 الأصلي X. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ليس لدينا شيء الكشف عنها.