مقالة منهجية

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

5.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58163

⸱

ديسمبر 16, 2018

 ,  ,  ,  , 
1The School of Agricultural and Veterinary Studies (FCAV), Jaboticabal, São Paulo State University (UNESP), 2CRRF, Université de Montréal, 3FZEA, University of São Paulo, 4FMVZ, University of São Paulo

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن تصف طريقة للعزل والتوسع، وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية.

الملخص

وقد تزايد الاهتمام بالخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على مدى العقد الماضي بسبب سهولة العزل والتوسع، والثقافة. في الآونة الأخيرة، أظهرت الدراسات قدرة التمييز على نطاق واسع التي تمتلك هذه الخلايا. المبيض يمثل مرشح واعدة للعلاجات المستندة إلى خلية يرجع ذلك إلى حقيقة أن غنية في MSCs، وأنه كثيرا ما يتم تجاهلها بعد العمليات الجراحية أوفاريكتومي كالنفايات البيولوجية. توضح هذه المقالة الإجراءات للعزلة، التوسع، والتفريق بين MSCs المستمدة من المبيض الكلاب البوليسية، دون الحاجة إلى فرز الخلايا التقنيات. ويمثل هذا البروتوكول أداة هامة للطب التجديدي بسبب انطباق واسع النطاق لهذه الخلايا اختلاف الغاية في التجارب السريرية والأغراض العلاجية.

المقدمة

عدد الدراسات المنشورة التي تركز على الخلايا الجذعية قد زاد زيادة كبيرة على مدى العقد الماضي، مجهود بحثي قد تم تغذيها الهدف الجماعي لاكتشاف علاجات الطب التجديدي قوية. الخلايا الجذعية لديها علامات تعريف الأساسي هما: التجديد الذاتي والتمايز. الخلايا الجذعية الوسيطة هي المسؤولة عن دوران الأنسجة العادية وقدرة أكثر تقييداً من التمايز عند مقارنة بالخلايا الجذعية الجنينية1. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت العديد من الدراسات مجموعة واسعة من التفريق بين MSCs، وموضوع قيد المناقشة عما إذا كانت هناك اختلافات بين الخلايا الجذعية الجنينية والكبار في كل2.

ظهارة سطح أوفاريوم هو غير ملتزم بها طبقة من الخلايا، أقل نسبيا المتباينة، التي تعبر عن كل علامات الظهارية والوسيطة3، الاحتفاظ بالقدرة على التفريق في أنواع مختلفة من الخلايا في الاستجابة إلى 4من الإشارات البيئية. الموقع الدقيق للخلايا الجذعية في المبيض ليست معروفة جيدا؛ ومع ذلك، اقترح أن المتكفل بيبوتينتيال في الباجينا الغلالة تثير الخلايا الجرثومية5. الدراسات المناعية يكون الافتراض بأن هذه الخلايا اللحمية من أصل6 أو يقع في أو الدانية إلى سطح المبيض7. أن الخلايا الجذعية الوسيطة التعبير عن مستقبلات العديدة التي تلعب دوراً هاما في الخلية الالتصاق8، تجربة صمم لاختبار فرضية أن تحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الانضمام السريع أن عزل أن خلايا وضوح تشاراكتيريزابل كالوسيطة في الطبيعة. في الآونة الأخيرة، ذكرت مجموعتنا اشتقاق MSCs من أنسجة المبيض استناداً إلى قدرتها على الانضمام إلى سطح البلاستيك طبق الثقافة في ح 3 الأول للثقافة، من أجل الحصول على عدد سكان المنقي للخلايا العارضة التصاق السريع9. وهنا يصف لنا الطريقة المتقدمة لعزل الخلايا الجذعية الوسيطة من أنسجة المبيض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وأجريت هذه التجربة مع المبايض أربعة كلاب أنثى مهجنة تبرعت بعد الجراحة الاختيارية في برنامج تعقيم الكلاب البوليسية. وأقر هذا تجربة "لجنة الأخلاقيات" في استخدام الحيوانات في أونيسب-فكاف (البروتوكول رقم 026991/13).

1-إعداد التجريبية

  1. إعداد أو شراء 500 مل من مخزنة الفوسفات المالحة العقيمة دولبيكو (دببس) دون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
  2. إعداد كولاجيناز أنا الأسهم الحل عن طريق خلط 40 ميكروغرام للانزيم في 1 مل دببس. التصفية باستخدام عامل تصفية حقنه 0.2 ميكرون، وتخزين مختبرين 2 مل في-20 درجة مئوية.
  3. تعد وسائل الإعلام ثقافة من المتوسطة (دميم) الجلوكوز تعديل النسر دولبيكو منخفضة مع المصل الجنيني 10% و 1% من المضادات الحيوية.
  4. جمع مواد معقمة: الأطباق المقص والملقط، قارورة زراعة الأنسجة، وأنابيب ماصات 10 مل و 5 مل.
  5. استخدام معدات المختبرات ثقافة الخلية القياسية: سلامة بيولوجية مجلس الوزراء (BSC)، حاضنة ثقافة خلية المحددة في 5% CO2 و 38 درجة مئوية، ومن أجهزة الطرد مركزي.
  6. تنظيف بكالوريوس العلوم: مع الأيدي القفاز، وتعقيم مع 70% EtOH، باستخدام مصابيح الأشعة فوق البنفسجية.

2-عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

  1. بعد الجراحة، وإبقاء المبيض في برنامج تلفزيوني على الجليد في أنبوب مخروطي، حتى وصولها إلى المختبر.
  2. شغل اثنان من أطباق بيتري 100 ملم مع 10 مل من برنامج تلفزيوني.
  3. إزالة المبايض من الأنبوب ونقلها إلى طبق بتري الأول مع برنامج تلفزيوني. غسلها بخلط الحركات.
  4. بلطف استرداد المبيض ووضعه في طبق آخر. مع ملاقط معقمة ومقص، فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة جداً، حوالي 1 ملم في الحجم.
  5. نقل أنسجة المبيض إلى 35 مم طبق بيتري وإضافة 2 مل كولاجيناز. فرم الأنسجة أكثر قليلاً.
  6. ضع طبق بيتري في الحاضنة عند 38 درجة مئوية ح 3 وهزه بلطف طبق بيتري مع حركات دائرية كل 20 دقيقة.
  7. بعد ح 3، إزالة طبق بيتري من الحاضنة.
  8. نقل محتويات الطبق إلى أنبوب 15 مل. إضافة 5 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  9. برفق عكس الأنبوب قبل الطرد المركزي. الطرد المركزي الأنبوب في ز 2100 x للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  10. نقل بيليه إلى زجاجة T25. ضع الزجاجة في الحاضنة مع 5% CO2 في 38 درجة مئوية ح 3.
    ملاحظة: أهم جزء من الإجراءات لتغيير وسائل الإعلام بعد ح 3 من الحضانة.
  11. قم بإزالة الزجاجة من الحاضنة ووسائط الإعلام مع الأنسجة المتبقية. إضافة 3 مل من توسع جديدة وسائل الإعلام إلى الزجاجة.
  12. تغيير وسائل الإعلام كل 48 ساعة ومراقبة الزجاجة لالتقاء الخلوية.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة الخطوات الرئيسية لهذا الإجراء في الشكل 1.

3-توسيع نطاق خلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

  1. مرور الخلية
    1. عندما تصل الخلايا إلى التقاء، قم بإزالة الوسائط من الزجاجة.
    2. تغسل الزجاجة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني. قم بإزالة برنامج تلفزيوني.
    3. إضافة 1.5 مل التربسين ووضع الزجاجة في الحاضنة عند 38 درجة مئوية للحد الأدنى 3 اضغط برفق زجاجة لمساعدة الخلايا لفصل.
      ملاحظة: الخلايا ينبغي التوصل إلى التقاء ما يقرب من 5-7 د بعد الطلاء الأولى.
    4. أضف 3 مل من التوسع في وسائل الإعلام ونقل المحتويات إلى أنبوب مخروطي.
    5. الطرد المركزي الأنبوب في 2100 س ز للحد الأدنى 7 إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
    6. مجانسة محتويات الأنبوبة برفق.
    7. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من العينة لأداء الخلية العد ووضع الأنبوب مع الخلايا في الحاضنة.
    8. المكان 10 ميليلتر من هذا المزيج إلى هيموسيتوميتير.
  2. عد الخلايا
    1. استخدام 10 X الهدف المجهر والتركيز على خطوط الشبكة هيموسيتوميتير.
    2. عد الخلايا الموجودة في المربعات الصغيرة الخمس (الشكل 2).
    3. مضاعفة عدد الأصوات التي تم فرزها حسب 50,000 لتقدير عدد الخلايا في المليلتر.

4-التفريق بين الخلايا الجذعية الوسيطة من المبيض

ملاحظة: أجريت فحوصات التفريق وفقا للمبادئ التوجيهية المحددة في تلة et al. 9.

  1. البذور 1.0 × 104 خلايا كل جيدا، في ثلاث نسخ، استخدام طبق ثقافة 4-جيدا.
  2. أضف 1 مل من التوسع في وسائل الإعلام.
  3. تحرض الطبق مع حركات دائرية بلطف.
  4. بعد 24 ساعة، استبدال الوسائط الثقافة مع وسائط الإعلام التمايز المرغوب فيه.
  5. أوستيوجينيك، أديبوجينيك، والتفريق بين تشوندروجينيك، احتضان الخلايا مع وسائط الإعلام التعريفي لمد 30، مع استبدال الوسائط واستخدمت كل مجموعات محددة التمايز دال 3 لكل من هذه الاختبارات.
  6. للتفريق بين النسب العصبية، احتضان الخلايا د 10 في وسائط الإعلام التعريفي، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم الجلوكوز منخفضة حمض فالبرويك مم 2، 1 ميكرومتر الهيدروكورتيزون، 10 فورسكولين ميكرومتر، كلوريد البوتاسيوم 5 مم، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين و hydroxyanisole بوتيل 200 ميكرومتر.
  7. للسلائف الأنسجة، واحتضان لمد 5 في وسائل الإعلام الأنسجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة كاشف.
  8. للتفريق بين نسب الخلايا البدائية، احتضان الخلايا في وسائط الإعلام التعريفي لمد 14، مع استبدال الوسائط كل 3 د. الوسائط المستخدمة هنا الواردة دميم، 10% FBS، بيروفات صوديوم 1 مم، 10 نانوغرام/مل ليف، الأحماض الأمينية غير الأساسية 1 مم، 2 مم L-الجلوتامين، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، مم 0.1 بيتا-ميركابتوثانول، 60 ميكرومتر بوتريسسيني، 20 ميكروغرام/مل ترانسفيرين، 10 نانوغرام/مل الماوس البشرة النمو عامل، 1 نانوغرام/مليلتر البشرية عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية، 40 نانوغرام/مليلتر الإنسان الدبقية الخلية المستمدة من خط نيوروتروفيك عامل، والبنسلين 15 مغ/لتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عزل الخلايا الجذعية الوسيطة من الكلاب المبيض:

ويرد الإجراء عزلة MSC المبيض في الشكل 1. بعد الجراحة، وتنميق الأنسجة، والهضم كولاجيناز، وتغيير الإعلام ح 3 بعد بداية الثقافة، كان عدد سكانها MSC المفترضة مع خصائص البلاستيك اللاصق السريع معزولة بنجاح من أنسجة المبيض الكلاب. الخلايا المقطوع سرعة التقيد بسطح البلاستيك طبق الثقافة ونمت لتصبح ثقافة أحادي الطبقة شكلياً متجانس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وهنا نحن نقدم الأدلة أن MSCs يمكن أن تكون معزولة من أنسجة المبيض الكلاب البوليسية، التي تعتبر النفايات البيولوجية بعد أوفاريكتومي. يرجع ذلك إلى حقيقة أن العديد من أنواع الخلايا ويمكن الاطلاع في المبيض، اقترحنا بروتوكول لتحديد MSCs على أساس على الانضمام السريع للبلاستيك، والتي نجحت بتحديد الخلايا التي نمت في أحادي الطبقة مع مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل.

التقرير الأول لاشتقاق MSCs من نخاع العظام يستند إلى قدرة التصاق البلاستيك MSCs خلال 48 ساعة الأولى من11من الثق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

الكتاب يعترف البرنامج تعقيم الكلاب في أونيسب-فكاف يرجى توفير المبايض. وأيد هذا العمل منح من FAPESP (عملية رقم 2013-14293-0) والرؤوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DPBS Thermo Fisher14190144
Collagenase IThermo Fisher17100017
قارورة الأنسجةCorningCLS3056
DMEM منخفض الجلوكوزThermo Fisher11054020
FBSThermo Fisher12484-010
TrypLE ExpressThermo Fisher12604021
StemPro طقم تمايز تكوين الشحمThermo FisherA1007001
StemPro مجموعة تمايز الغضروفThermo FisherA1007101
StemPro مجموعة تمايز تكوين العظمThermo FisherA1007201
STEMdiff مجموعة الأديم الباطنStemCell5110
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher15070063
CD45AbD SerotecMCA 2035S
CD34AbD SerotecMCA 2411GA
CD90AbD SerotecMCA 1036G
CD44AbD SerotecMCA 1041
NestinMiliporeMAB353
& beta & -Tubulin   ;ميليبورMAB1637
DDX4InvitrogenPA5 -23378
IgG- FITCABD SerotecSTAR80F
IgG- FITCABD SerotecSTAR120F
النهائية

المراجع

  1. Gazit, Z., Pelled, G., Sheyn, D., Kimelman, N., Gazit, D. Mesenchymal stem cells. Handbook of Stem Cells (2nd Edition). Atala, A., Lanza, R. , Academic Press. 513-527 (2013).
  2. Zipori, D. The nature of stem cells: state rather than entity. Nature Reviews Genetics. 5 (11), 873-878 (2004).
  3. Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocrine Reviews. 22 (2), 255-288 (2001).
  4. Ahmed, N., Thompson, E. W., Quinn, M. A. Epithelial-mesenchymal interconversions in normal ovarian surface epithelium and ovarian carcinomas: an exception to the norm. Journal of Cellular Physiology. 213 (3), 581-588 (2007).
  5. Bukovsky, A., Svetlikova, M., Caudle, M. R. Oogenesis in cultures derived from adult human ovaries. Reproductive Biology and Endocrinology. 3 (1), 17(2005).
  6. Gong, S. P., et al. Embryonic stem cell-like cells established by culture of adult ovarian cells in mice. Fertility and Sterility. 93 (8), 2594-2601 (2010).
  7. Johnson, J., Canning, J., Kaneko, T., Pru, J. K., Tilly, J. L. Germline stem cells and follicular renewal in the postnatal mammalian ovary. Nature. 428 (6979), 145(2004).
  8. Deans, R. J., Moseley, A. B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses. Experimental Hematology. 28 (8), 875-884 (2000).
  9. Trinda Hill, A. B. T., Therrien, J., Garcia, J. M., Smith, L. C. Mesenchymal-like stem cells in canine ovary show high differentiation potential. Cell Proliferation. 50 (6), 12391(2017).
  10. Dominici, M. L. B. K., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 4315-4317 (2006).
  11. Friedenstein, A. J., Piatetzky-Shapiro, I. I., Petrakova, K. V. Osteogenesis in transplants of bone marrow cells. Development. 16 (3), 381-390 (1966).
  12. Kuznetsov, S. A., et al. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo. Journal of Bone and Mineral Research. 12 (9), 1335-1347 (1997).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة