مقالة منهجية

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

DOI:

10.3791/58173

⸱

سبتمبر 14, 2018

 ,  , 
1Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 2Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لاختبار الآثار المثبطة لعوامل دوائية على phospholipase C (PLC) في مناطق مختلفة من الدماغ نحل العسل، نقدم مقايسة بيوكيميائية لقياس النشاط التشريعي في تلك المناطق. هذا التحليل يمكن أن تكون مفيدة لمقارنة النشاط التشريعي بين الأنسجة، وكذلك بين النحل العارضة سلوكيات مختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحل العسل كائن نموذج لتقييم السلوكيات المعقدة وأعلى وظيفة المخ، مثل التعلم والذاكرة، وتقسيم العمل. الجسم الفطر (MB) مركز الدماغ أعلى واقترح أن تكون الركيزة العصبية من سلوكيات نحل العسل المعقدة. على الرغم من أن دراسات سابقة حددت الجينات والبروتينات التي يتم التعبير عنها متفاوتاً في MBs ومناطق أخرى في الدماغ، أنشطة البروتينات في كل منطقة لا بعد فهم فهما كاملا. للكشف عن وظائف هذه البروتينات في الدماغ، تحليل دوائية نهجاً عمليا، ولكن هو الضرورة الأولى لتأكيد أن التلاعب دوائية يغير الواقع نشاط البروتين في هذه المناطق في الدماغ.

ونحن سبق تحديد تعبير أعلى من الجينات ترميز phospholipase C (المجلس التشريعي) في MBs من مناطق أخرى من الدماغ، وتقييم عقاقيري إشراك المجلس التشريعي في سلوك نحل العسل. في هذه الدراسة، ونحن المتحلل اختبار العميلين دوائية وأكدت أنها انخفضت النشاط التشريعي في MBs ومناطق أخرى في الدماغ. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لكيفية الكشف عن النشاط التشريعي في نحل العسل هوموجيناتي الدماغ. في هذا النظام المقايسة، هي رد فعل homogenates المستمدة من مناطق الدماغ المختلفة مع الركازة فلوروجينيك اصطناعية، والأسفار الناتجة عن نشاط المجلس التشريعي هو كمياً ومقارنة بين مناطق الدماغ. كما يصف لنا تقييمنا لتأثيرات بعض العقاقير المثبطة في نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام نفس النظام. على الرغم من أن هذا النظام من المرجح المتأثرين بغيرها من المركبات الفلورية الذاتية و/أو امتصاص المكونات المقايسة والأنسجة، بقياس نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام هذا النظام أكثر أماناً وأسهل من استخدام هذا التحليل التقليدي، الذي يتطلب ركائز راديولابيليد. إجراء بسيط والتلاعبات تسمح لنا بدراسة النشاط التشريعي في العقول والأنسجة الأخرى للمشاركة في مختلف المهام الاجتماعية نحل العسل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحل العسل (Apis mellifera L.) الأوروبية الحشرات eusocial، والنحل الإناث تظهر الطبقة الاجتماعية تعتمد على الاستنساخ والعمر-تعتمد على تقسيم العمل. على سبيل المثال، تغذية الأفراد الأصغر سنا في الطبقة العقيمة للنحل يشار إليها 'العمال'، broods بينما الأكبر سنا الأعلاف الرحيق وحبوب اللقاح خارج الخلية1. التعلم والذاكرة القدرة ذات أهمية حاسمة في حياة نحل العسل، لأنه يجب أن مرارا وتكرارا الانتقال ذهابا وإيابا بين مصادر الغذاء والعش باحثات وثم الاتصال بمواقع مصادر غذائية جيدة لما نيستماتيس من خلال الرقص الاتصالات1. أظهرت الدراسات السابقة أن ميغابايت، مركزا أعلى للدماغ في الحشرات، متورطة في القدرة على التعلم والذاكرة لنحل العسل2،،من34. وقد حددت الأثران عن الجينات والبروتينات في مختلف مناطق الدماغ لنحل العسل5،6،،من78،9،10 ،11، مما يوحي بأنها ترتبط بوظائف فريدة من نوعها لكل منطقة الدماغ. رغم تثبيط دوائية أو تنشيط بروتين الاهتمام نهجاً جيدا المستخدمة للكشف عن وظيفة البروتين في نحل العسل السلوك12،،من1314، أنه لا يعرف ما إذا كانت جميع الأدوية أن الآثار الفنية في مناطق مختلفة من الدماغ نحل العسل. وستعزز التحقق المهام لهذه العقاقير الاستنتاجات في الدراسات السلوكية الصيدلة.

هنا، علينا أن نركز على المجلس التشريعي الفلسطيني، واحد من الإنزيمات المتورطين في الماوس الإدراك15،16،،من1718. المجلس التشريعي الفلسطيني يطلق الكالسيوم مما يشير إلى جانب المهينة فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) إلى اينوزيتول 1,4,5-تريسفوسفاتي (IP3) ودياسيلجليسيرول (همرشولد)19،،من2021. الملكية الفكرية3 يفتح IP3 مستقبلات في هيولى (ER)، مما يؤدي إلى الإفراج عن أيونات الكالسيوم لائحة. صدر الكالسيوم ينشط كيناز البروتين الكالسيوم/كالمودولين-تعتمد على الثاني (كامكي) مع كالمودولين والبروتين كيناز ج (PKC) حضور همرشولد. وتشارك كلا مؤنزم البروتين في التعلم والذاكرة22،23، اتساقا مع إشراك المجلس التشريعي في هذه العملية. وتصنف الشركات المحدودة العامة إلى الأنواع الفرعية، بما في ذلك PLCβ، PLCγ، و PLCε، استناداً إلى تلك الهياكل20. يتم تنشيط كل نوع فرعي المجلس التشريعي الفلسطيني في سياق مختلف20، والأثران يتم التعبير عن الجينات ترميز تلك المخططات في أنسجة مختلفة. أظهرنا سابقا أن نحل العسل MBs التعبير عن الجينات ترميز أنواع فرعية PLCβ و PLCε عند مستويات أعلى من مناطق الدماغ المتبقية24، وأن عموم-المجلس التشريعي الفلسطيني هما مثبطات (كبريتات اديلفوسيني والنيوميسين [النيوميسين]) انخفاض نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني في مختلف مناطق الدماغ، وفي الواقع، تؤثر على القدرة على التعلم والذاكرة ل نحل العسل24.

تقليديا، تم قياس النشاط الأنزيمي للمجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام راديولابيليد النقطة225، الأمر الذي يتطلب توفير التدريب المناسب والمعدات والمرافق. ركيزة فلوروجينيك اصطناعية للمجلس التشريعي الفلسطيني في الآونة الأخيرة أنشئت26، مما يجعل من السهل تقييم النشاط التشريعي في المختبر القياسية. نقدم هنا، بروتوكول مفصلة للكشف عن النشاط التشريعي في مناطق مختلفة من الدماغ لنحل العسل باستخدام الركيزة فلوروجينيك واختبار الآثار المثبطة اديلفوسيني والنيوميسين على المجلس التشريعي الفلسطيني في وقت لاحق في هذه الأنسجة. لأنه يتطلب البروتوكول التلاعب الأساسية فقط، قد يكون المطبقة على الدراسات المتعلقة بالنشاط التشريعي في أنسجة أخرى أو مناطق الدماغ في النحل المخصصة للمهام الاجتماعية المختلفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الاستيلاء على مساحات العلف نحل العسل

  1. شراء مستعمرات نحل العسل من موزع محلي.
  2. باستخدام شبكة الحشرات، صيد النحل محصده التي تعود إلى الخلية مع أكياس حبوب اللقاح على أرجلها الخلفيتين. نقل النحل إلى أنبوب 50 مل مخروطية بلاستيك قياسية وكاب الأنبوب (الشكل 1). وضع الأنبوب على الجليد تخدير النحل.
    ملاحظة: ارتداء السترات المعينة لتربية النحل لتجنب لسعات النحل. يمكن أيضا أن النحل التمريض المجمعة تبعاً للتجربة. لالتقاط النحل ممرضة ومراقبة سلوك النحلة على مشط الشمع والقبض على ممرضة النحل، الذي كزة رؤوسهم في خلايا الحضنة لتغذية اليرقات، الجناح أو الصدر باستخدام الملقط. ثم ضع النحل في أنبوب بلاستيكي 50 مل وكاب الأنبوب ووضعه على الجليد كما هو مذكور في الخطوة 1.2.
  3. التقاط باحثات 12 عشوائياً.
    ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول النحل اثنين كل الكثير، أسفر عن ستة الكثير. النحل متعددة يمكن أن تكون اشتعلت في أنبوب واحد، وعدد النحل في أنبوب واحد ليس مهما، كما يتم الجمع بين النحل في كل الكثير في وقت لاحق (راجع الخطوة رقم 3.1.1). تبقى باردة أنبوب في فصل الصيف، كما يضر بدرجة حرارة عالية في الأنبوب النحل.

2-تشريح الدماغ نحل العسل

  1. في المختبر، وضع أنبوب 50 مل على الجليد لمالا يقل عن 30 دقيقة6 تخدير النحل.
  2. لإعداد مرحلة تشريح، أمثال قطعة من الشمع الأسنان في النصف (حجم الناتج حوالي 3.5 x 7.5 سم) ودفعها إلى طبق بلاستيك (60 × 15 ملم).
    ملاحظة: الشمع مطوية يحمل إيمانا راسخا دبابيس الحشرات.
  3. تحت مجهر، فصل رأس النحلة من الهيئة بملاقط وإصلاحه في الشمع طب الأسنان عن طريق إدراج دبابيس الحشرات الموجودة في قاعدة كل هوائي لعقد الأمامي للرأس في وضع تصاعدي (الشكل 2أ).
    ملاحظة: يغسل الملقط قبل الاستخدام، استخدام الإيثانول أو الماء المعقم.
  4. صب ما يكفي من المحلول الملحي (0.13 مول/لتر كلوريد الصوديوم و 5 mmol/لتر بوكل و 1 ملمول/لتر كاكل2-2 ح2س) على الرأس لتغطية ذلك. بيرس الرأس مرة أخرى بالدبابيس إذا رأسه يعوم في الحل. استخدام المحلول الملحي الجليد، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: ومع ذلك، يعمل هذا البروتوكول بدون المحلول الملحي الباردة.
  5. إزالة الهوائيات استخدام الملقط (الشكل 2ب).
  6. جعل قطع أفقي قرب أسس الهوائيات، وطوليا على الحدود من العيون المركبة، واستخدام مشرط. ثم قم قص أفقية في الجزء العلوي من الرأس. إزالة أهاب لفتح نافذة على الدماغ (الشكل 2-ج).
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يغسل مشرط مع الإيثانول أو تعقيم المياه قبل الاستخدام.
  7. إزالة ريتيناي من أوسيلي وتراتشياي على السطح الأمامي للدماغ، واستخدام الملقط (الشكل 2د).
  8. توسيع قص الشريط الحدودي من عيون مجمع دورسالي وبطنيا، استخدام المبضع (الشكل 2ه). بعد ذلك، إزالة النسيج الضام بين بشرة العينين مركب وريتين بإدراج ملاقط مباشرة تحت بشرة العين (الشكل 2و).
  9. تجاهل بشرة العينين مركب. اختيار نصائح الظهرية من ريتين العينين مركب مع ملاقط والانتقال الملاقط في اتجاه البطني تقشر بعناية ريتين (الشكل 2ز).
  10. بعناية إزالة تركي المتبقية على السطح الأمامي للدماغ، واستخدام الملقط (الشكل 2ح).
  11. قص النسيج الضام بين الدماغ والمناطق المحيطة الأنسجة، واستخدام الملقط، وتشريح الدماغ من الكبسولة الرأس (الشكل 2ح).
  12. تقشر تركي على السطح الخلفي للدماغ، واستخدام الملقط (الشكل 2أنا).
  13. استخدام مشرط، قطع الاتصال بين MBs ومناطق أخرى في المخ بجوار الفصوص الرأسية، التي جزء من MBs (الشكل 2ياء).
  14. مكان MBs تشريح وتبقى أنسجة المخ في أنابيب 1.5 مل وسرعة تجميد لهم مع الثلج الجاف أو النتروجين السائل (الشكل 2ك). تخزين الأنسجة المجمدة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: مقبض نيتروجين سائل مع قفازات المعينة والتهوية لتجنب حرق الباردة والخنق. ثلج جاف يجب أيضا التعامل بعناية مع القفازات. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. تشريح والتخزين في المخ ينبغي أن تكون الأنسجة يقوم النحل واحد في وقت واحد لتجنب تدهور البروتين.

3-إعداد هوموجيناتيس الدماغ

  1. إضافة 10 ميليلتر لتجانس العازلة يتألف من 50 mmol/لتر حبيس-كوه (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 70 ميللي مول/لتر بوكل، و 1.0 مليمول/لتر كاكل2 إلى تجميد أنسجة الدماغ ومجانسة الأنسجة في أنبوب 1.5 مل بالضغط يدوياً مع مدقة بلاستيك. السكتة الدماغية الأنسجة على الأقل 200 x.
    ملاحظة: إجراء ألاعيب الوارد وصفها في المادة 3 على الجليد. استخدام مدقة تركيب الحق في أنبوب لتحطيم الأنسجة بما فيه الكفاية، التي تطفو بسهولة في المخزن المؤقت للتجانس.
    1. نقل الحل النسيج المتجانس للأنسجة التالية في الكثير ومجانسة الأنسجة بنفس الطريقة.
      ملاحظة: يتم الجمع بين النحل في كل الكثير في هذه الخطوة. هذا البروتوكول يستخدم الكثير ستة.
  2. إضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت التجانس.
  3. الطرد المركزي عينة النسيج المتجانس لمدة 10 دقيقة في ما يقرب من 900 × ز27 و 4 درجات مئوية.
  4. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة والطرد المركزي مرة أخرى لمدة 20 دقيقة في حوالي الساعة 9,500 س ز27 و 4 درجات مئوية.
  5. ضع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة. تخزين هوموجيناتي في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
  6. تحديد تركيز البروتين باستخدام المقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك.
    1. تمييع 2.5 ميليلتر من هوموجيناتي مع 17.5 ميليلتر من الماء المعقم (وبالتالي إضعاف هوموجيناتي ثمانية إضعاف) واستخدام جميع هوموجيناتي المخفف.
      ملاحظة: هوموجيناتي أخذ العينات باستخدام ميكروبيبيتي يجب إجراء بعناية بسبب لها لزوجة عالية.
    2. إجراء المقايسة اتفاق التعاون الأساسي باستخدام 0، 0.1، 0.2، 0.4، 1.0 و 2.0 مغ/مل من ألبومين المصل البقري (BSA) في 20 ميليلتر كمعايير.
      ملاحظة: تغيير حجم المقايسة اتفاق التعاون الأساسي حسب الاقتضاء، استناداً إلى حجم هوموجيناتي وعينات قياسية. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-المجلس التشريعي الفلسطيني رد فعل في المخ هوموجيناتيس

  1. إعداد الحل الأسهم من ذوي الخوذات البيضاء-15 الركيزة فلوروجينيك26 المذابة في الماء المعقم في 50 µmol/L وتخزينها في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: تشمل الحلول التي تحتوي على الركازة مع إحباط لمنع يتلاشى.
  2. إعداد بريميكستوري رد فعل في وحدة التخزين المطلوبة لتحقيق التكوين التالي في 10 ميليلتر من رد فعل خليط: 50 mmol/لتر حبيس-كوه (الرقم الهيدروجيني 7.2)، 70 ميللي مول/لتر بوكل، 1.0 مليمول/لتر كاكل2، ديثيوثريتول mmol/لتر 2.0، 50 مغ/لتر جيش صرب البوسنة، وذوي الخوذات البيضاء µmol/L 12.5-15.
  3. تمييع هوموجيناتي مع المخزن المؤقت للتجانس، إذا لزم الأمر.
  4. مزيج بريميكستوري رد الفعل وهوموجيناتي التي تحتوي على 1.3 ميكروغرام من البروتينات في أنبوب بوليميريز سلسلة من ردود فعل (PCR) لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر من خليط رد فعل.
    1. إعداد نوعين من الخلائط التحكم للتحليل الإحصائي: وضعت في هوموجيناتي ولكن لا ذوي الخوذات البيضاء-15 إلى مزيج (خليط التحكم 1)، و العكس بالعكس (خليط التحكم 2).
      ملاحظة: إعداد الخلائط رد فعل والخلائط السيطرة على الجليد لمنع تدهور البروتين ورد فعل من المجلس التشريعي الفلسطيني. مراقبة المزائج 1 و 2 تستخدم للكشف عن الأسفار من هوموجيناتي والركيزة مجاناً، على التوالي.
  5. مسح الأنبوب واحتضان أنه في cycler حرارية لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية.
  6. وقف رد الفعل بإضافة 2 ميليلتر من 25 مكررا جليكول mmol/لتر (β-أمينوثيليثير)-ن، ن، ن '، ن'--حمض tetraacetic.
    ملاحظة: المبالغ المناسبة من البروتين وأوقات رد الفعل تختلف بين التجارب. وهكذا، لتحسين حالة رد الفعل، قد يكون من الضروري تكرار الإجراءات المذكورة في الخطوات 4.1-5.3 في التجارب الأولية عن طريق تغيير الوقت المبلغ وحضانة البروتين حتى يزيد الأسفار خطيا. للإشارة، عند استخدام هوموجيناتي المستمدة من مناطق الدماغ الأخرى، رد فعل وعادة ما يعمل خطيا مع 1.3 ميكروغرام أو أقل من البروتينات خلال 30 دقيقة، ولكن الخطي يتناقص مع على الأقل 2.7 ميكروغرام من البروتينات أو فترة حضانة من 90 دقيقة أو لو نجير.

5-كشف Fluorescence الناتجة عن نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني

  1. الطرد المركزي خليط التفاعل والمخاليط التحكم لمدة 5 دقائق في حوالي 310 × ز28 ونقل 10 ميليلتر من المادة طافية على آبار مختلفة على ميكروسكوبية 384-جيدا المطبقة للكشف عن الأسفار.
    ملاحظة: لمنع من تلوث بالغبار ويتلاشى، تغطي اللوحة بإحباط.
  2. مسح الميكروسكوبية استخدام الطرد مركزي الميكروسكوبية.
  3. تعيين اللوحة في قارئ ميكروسكوبية والكشف عن الأسفار مع ثلاث نسخ تقنية.
    ملاحظة: هي موجات الإثارة والانبعاثات 344 نيوتن متر و 530 نانومتر، على التوالي. إذا كان ذلك ممكناً (تبعاً للقارئ الميكروسكوبية)، مزيج المزائج عينة ل 5 ق قبل الكشف عن كل. يمكن إيقاف البروتوكول هنا.

6-اختبار العمل المثبطة لعوامل دوائية

  1. إعداد حلول الأسهم اديلفوسيني والنيوميسين بتركيزات مناسبة وتخزينها حتى الاستخدام: اديلفوسيني 5.0 مليمول/لتر ودرجة مئوية؛ النيوميسين على 550 مليمول/لتر و 4 درجة مئوية.
  2. عند إعداد بريميكستوري رد فعل كما هو موضح في الخطوة 4، 2.، إضافة مثبطات بريميكستوري تحقيق تركيزات النهائية الملائمة: اديلفوسيني، 1.0 مليمول/لتر؛ النيوميسين، 0.55 mmol/l.
  3. إضافة هوموجيناتي للخلائط التحكم بريميكستوري والمناسبة رد فعل كما في الخطوة 4، 4.
    1. إعداد ثلاثة أنواع من الخلائط السيطرة: وضع في هوموجيناتي والمانع، ولكن ليس الركيزة في مراقبة الخليط 1؛ إضافة الركيزة والمانع ولكن ليس هوموجيناتي في مراقبة خليط 2؛ وموضع مراقبة الخليط 3 المانع، ولكن لا هوموجيناتي أو الركازة.
  4. القيام برد فعل المجلس التشريعي الفلسطيني والكشف عن الأسفار كما هو موضح في الخطوات 4.5 5.3.

7-إحصائية تحليل

  1. للكشف عن نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني باستخدام مخاليط الوارد وصفها في القسم 4، حساب الأسفار المتأتية من التفاعل بين المجلس التشريعي الفلسطيني والركيزة عن طريق طرح الأسفار تنبعث من هوموجيناتي أو من الركازة مجاناً كما يلي.

    فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي) = فلوريدا (رد فعل ميكس)--{فلوريدا (ctrl 1) + فلوريدا (ctrl 2)}
    ​
    ملاحظة: فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي) وفلوريدا (رد فعل ميكس) وفلوريدا (ctrl 1) وفلوريدا (ctrl 2) تدل على حسن النية الأسفار المتأتية من نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني، واكتشاف الأسفار في خليط رد فعل، والخلائط التحكم 1 و 2، على التوالي.
    1. بعد قياس fluorescence في الخلائط كما هو موضح في الخطوات 4، 1-5-3، حساب فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي) وفقا للمعادلة في الخطوة 7، 1، ومن ثم يعني فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي) من ثلاث نسخ التقنية لكل هوموجيناتي.
    2. استخدام Fl يعني (نشاط المجلس التشريعي) من ثلاث نسخ التقنية التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1.1، حساب مرة أخرى في فلوريدا يعني (نشاط المجلس التشريعي) من replicates البيولوجية MBs ومناطق أخرى في الدماغ ومقارنة القيم بين أنسجة الدماغ.
  2. للنظر في نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني وجود مثبطات استخدام مخاليط الموضحة في القسم 6، حساب الأسفار المتأتية من التفاعل بين هوموجيناتي والركيزة، ومثبط على النحو التالي.

    فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي مع مثبط) = فلوريدا (رد فعل ميكس)--{فلوريدا (ctrl 1) + فلوريدا (ctrl 2)} + فلوريدا (ctrl 3)

    ملاحظة: هنا، فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي مع مثبط) هو fluorescence حسن النية الناتجة عن نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني حضور المانع. فلوريدا (رد فعل ميكس) وفلوريدا (ctrl 1) وفلوريدا (ctrl 2) وفلوريدا (ctrl 3) هي إشارات الأسفار الكشف عنها في رد فعل الخليط، خليط التحكم 1، التحكم في الخليط 2 ومراقبة الخليط 3، على التوالي.
    1. بعد قياس fluorescence في الخلائط كما هو موضح في الخطوات 6، 1-6-4، حساب فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي مع مثبط) وفقا للمعادلة في الخطوة 7، 2. ثم الحصول على Fl يعني (نشاط المجلس التشريعي مع المانع) من ثلاث نسخ التقنية لكل هوموجيناتي.
    2. باستخدام متوسط القيمة المحسوبة في الخطوة 7.2.1، حساب في فلوريدا يعني (نشاط المجلس التشريعي مع المانع) من replicates البيولوجية المستمدة من كل أنسجة المخ. مقارنة في فلوريدا (نشاط المجلس التشريعي مع المانع) وفلوريدا (نشاط المجلس التشريعي) التي تم الحصول عليها في الخطوة 7.1.2 في كل أنسجة المخ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركيزات البروتين في الدماغ هوموجيناتيس:
نحن على استعداد هوموجيناتيس باستخدام محصده النحل. وترد في الشكل 3تركيزات البروتين المحسوبة في هوموجيناتيس الأصلي. كانت تركيزات البروتين التقريبي في هوموجيناتي الأصلي كما يلي: 1.5 ملغ/مل في MBs و 2.3 ملغ/مل في مناطق أخرى من الدماغ. كنا النحل اثنين كل الكثير والكثير ستة حللت.

الكشف عن نشاط المجلس التشريعي الفلسطيني في هوموجيناتيس الدم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة الكيمياء الحيوية لنشاط البروتين مهم عميقا لفهم الإشارات الجزيئية في الدماغ، ونظرا لأن نشاط إنزيم تتأثر جزيئات مختلفة، مثل ركائز ومثبطات، وتغيير، ومن ثم، جنبا إلى جنب مع سلوك الحيوانات (مثلالتعلم والذاكرة)5. أفيد في دراسات نحل العسل، والأنزيمات مثل أمبير سيكليك-تعتمد على البروتين كيناز ألف cyclic GMP المعتمدة على البروتين كيناز، PKC، كامكي فوسفوريلاتيد و adenylate cyclase خلطات يمكن التعبير عنها في مختلف مناطق الدماغ على أساس إيمونوهيستوتشيميستري5،<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعديل الشكل 4 باء - 4 د من سوينامي et al. 24 بالإذن من "فتح علم الأحياء". الكتاب ممتنون للناشر للحصول على إذن. وأيد هذا العمل "برنامج العلوم الحدود البشرية" (RGY0077/2016) ميازاكي ريو وشوتا سوينامي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة فحص البروتين بيرس BCAThermoFisher Scientific23227مجموعة الكاشف لقياس تركيز البروتين
بيرس مصل الأبومين الأبقار الأمبولات القياسية 2 مجم / ملThermoFisher Scientific23209العينات القياسية المستخدمة في فحص BCA
شمع البارافينGC13B1X00155000141شمع الأسنان المستخدم كمرحلة تشريح
دبوس الحشراتShigaرقم 0الفولاذ المقاوم للصدأ ، رأس صلب
PLCglowKXT BioKCH-0001ركيزة فلورية من PLC
384 بئر صفيحةدقيقة Corning4511لوحة منخفضة الحجم ومستديرة القاع باللون الأسود
قارئ الجوزاء EMالأجهزة الجزيئية
EdelfosineSanta Cruz Biotechnologysc-201021عموم PLC
كبريتات نيومايسينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSC-3573عموم PLC مثبط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Winston, M. L. The Biology of the Honey Bee. , Harvard University Press. Cambridge, MA. (1991).
  2. Szyszka, P., Galkin, A., Menzel, R. Associative and non-associative plasticity in Kenyon cells of the honeybee mushroom body. Frontiers in Systems Neuroscience. 2, 3(2008).
  3. Müßig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. The Journal of Neuroscience. 30 (23), 7817-7825 (2010).
  4. Devaud, J. -M., et al. Neural substrate for higher-order learning in an insect: mushroom bodies are necessary for configural discriminations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), E5854-E5862 (2015).
  5. Grünbaum, L., Müller, U. Induction of a specific olfactory memory leads to a long-lasting activation of protein kinase C in the antennal lobe of the honeybee. The Journal of Neuroscience. 18 (11), 4384-4392 (1998).
  6. Kamikouchi, A., Takeuchi, H., Sawata, M., Natori, S., Kubo, T. Concentrated expression of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C in the mushroom bodies of the brain of the honeybee Apis mellifera L. The Journal of Comparative Neurology. 417 (4), 501-510 (2000).
  7. Sen Sarma, M., Rodriguez-Zas, S. L., Hong, F., Zhong, S., Robinson, G. E. Transcriptomic profiling of central nervous system regions in three species of honey bee during dance communication behavior. PLoS ONE. 4 (7), e6408(2009).
  8. Kaneko, K., et al. In situ hybridization analysis of the expression of futsch, tau, and MESK2 homologues in the brain of the European honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 5 (2), e9213(2010).
  9. Kaneko, K., et al. Novel middle-type Kenyon cells in the honeybee brain revealed by area-preferential gene expression analysis. PLoS ONE. 8 (8), e71732(2013).
  10. Pasch, E., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII is differentially localized in synaptic regions of kenyon cells within the mushroom bodies of the honeybee brain. The Journal of Comparative Neurology. 519 (18), 3700-3712 (2011).
  11. Suenami, S., et al. Analysis of the differentiation of Kenyon cell subtypes using three mushroom body-preferential genes during metamorphosis in the honeybee (Apis mellifera L.). PLoS ONE. 11 (6), e0157841(2016).
  12. Farooqui, T., Robinson, K., Vaessin, H., Smith, B. H. Modulation of early olfactory processing by an octopaminergic reinforcement pathway in the honeybee. The Journal of Neuroscience. 23 (12), 5370-5380 (2003).
  13. Matsumoto, Y., et al. Cyclic nucleotide-gated channels, calmodulin, adenylyl cyclase, and calcium/calmodulin-dependent protein kinase II are required for late, but not early, long-term memory formation in the honeybee. Learning & Memory. 21 (5), 272-286 (2014).
  14. Scholl, C., Kübert, N., Muenz, T. S., Rössler, W. CaMKII knockdown affects both early and late phases of olfactory long-term memory in the honeybee. Journal of Experimental Biology. 218, 3788-3796 (2015).
  15. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase C β4 mutant mice. European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  16. Koh, H. -Y., Kim, D., Lee, J., Lee, S., Shin, H. -S. Deficits in social behavior and sensorimotor gating in mice lacking phospholipase Cβ1. Genes, Brain and Behavior. 7 (1), 120-128 (2008).
  17. Quan, W. -X., et al. Characteristics of behaviors and prepulse inhibition in phospholipase Cε-/- mice. Neurology,Psychiatry and Brain Research. 18 (4), 169-174 (2012).
  18. Rioult-Pedotti, M. -S., Pekanovic, A., Atiemo, C. O., Marshall, J., Luft, A. R. Dopamine promotes motor cortex plasticity and motor skill learning via PLC activation. PLoS ONE. 10 (5), e0124986(2015).
  19. Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium signaling in neurons: molecular mechanisms and cellular consequences. Science. 268 (5208), 239-247 (1995).
  20. Smrcka, A. V., Brown, J. H., Holz, G. G. Role of phospholipase Cε in physiological phosphoinositide signaling networks. Cellular Signalling. 24 (6), 1333-1343 (2012).
  21. Dusaban, S. S., Brown, J. H. PLCε mediated sustained signaling pathways. Advances in Biological Regulation. 57, 17-23 (2015).
  22. Elgersma, Y., Sweatt, J. D., Giese, K. P. Mouse genetic approaches to investigating calcium/calmodulin-dependent protein kinase II function in plasticity and cognition. The Journal of Neuroscience. 24 (39), 8410-8415 (2004).
  23. Giese, K. P., Mizuno, K. The roles of protein kinases in learning and memory. Learning & Memory. 20 (10), 540-552 (2013).
  24. Suenami, S., Iino, S., Kubo, T. Pharmacologic inhibition of phospholipase C in the brain attenuates early memory formation in the honeybee (Apis mellifera L.). Biology Open. 7 (1), pii: bio028191 (2018).
  25. Zhu, L., McKay, R. R., Shortridge, R. D. Tissue-specific expression of phospholipase C encoded by the norpA gene of Drosophila melanogaster. The Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15994-16001 (1993).
  26. Huang, W., Hicks, S. N., Sondek, J., Zhang, Q. A fluorogenic, small molecule reporter for mammalian phospholipase C isozymes. ACS Chemical Biology. 6 (3), 223-228 (2011).
  27. Yoshioka, T., Inoue, H., Hotta, Y. Absence of phosphatidylinositol phosphodiesterase in the head of a Drosophila visual mutant, norpA (no receptor potential A). The Journal of Biochemistry. 97 (4), 1251-1254 (1985).
  28. Janjanam, J., Chandaka, G. K., Kotla, S., Rao, G. N. PLCβ3 mediates cortactin interaction with WAVE2 in MCP1-induced actin polymerization and cell migration. Molecular Biology of the Cell. 26 (25), 4589-4606 (2015).
  29. Fiala, A., Müller, U., Menzel, R. Reversible downregulation of protein kinase A during olfactory learning using antisense technique impairs long-term memory formation in the honeybee, Apis mellifera. The Journal of Neuroscience. 19 (22), 10125-10134 (1999).
  30. Thamm, M., Scheiner, R. PKG in honey bees: spatial expression, Amfor gene expression, sucrose responsiveness, and division of labor. The Journal of Comparative Neurology. 522 (8), 1786-1799 (2014).
  31. Balfanz, S., et al. Functional characterization of transmembrane adenylyl cyclases from the honeybee brain. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (6), 435-445 (2012).
  32. Lopez, I., Mak, E. C., Ding, J., Hamm, H. E., Lomasney, J. W. A novel bifunctional phospholipase C that is regulated by Gα12 and stimulates the Ras/mitogen-activated protein kinase pathway. The Journal of Biological Chemistry. 276 (4), 2758-2765 (2001).
  33. Huang, W., et al. A membrane-associated, fluorogenic reporter for mammalian phospholipase C isozymes. The Journal of Biological Chemistry. 293 (5), 1728-1735 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PLC

مقالات ذات صلة