نهج في المختبر للعلاج الضوئي

العلاج الضوئي (التوقيت الصيفي الباسفيكي) هو إجراء طبي ينطوي على الحضانة محسس ضيائي مناشئ التطبيقية (PS) تليها فوتواكتيفيشن الضوء مرئياً للحث استموات الخلايا. الدواء الاتحادية (FDA) قد وافقت التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج تقران سافع (حزب العدالة والتنمية)، وتوصي المبادئ التوجيهية السريرية التوقيت الصيفي الباسفيكي لعلاج بعض سرطانات الجلد غير الميلانوما وحب الشباب الشائع:^1،2. وتشمل الاستخدامات غير الجلدية الناشئة للتوقيت الصيفي الباسفيكي علاج سرطان الجهاز الهضمي والبروستاتا، وأمراض النساء³. التوقيت الصيفي الباسفيكي طريقة علاجية مفيدة كما أنها منخفضة التكلفة وغير الغازية، ومرتبطة بالحد الأدنى من الآثار الضائرة و تندب².

في الخطوة الأولى من التوقيت الصيفي الباسفيكي، يطبق PS ويسمح لهم بتجميع إينتراسيلولارلي². في الولايات المتحدة، حمض الموضعية 5-aminolevulinic (5-علاء) يستخدم عادة لعلاج إس. أثناء الاحتضان يتم تحويل المرحلة، 5-علاء إلى بروتوبورفيرين التاسع (PP-تاسعا) عبر الممر الحيوي الهيم في الخلايا المدمجة³. وانخفضت خلايا السرطان وسرطان ما قبل النشاط فيروتشيلاتاسي، والذي يحول بروتوبورفيرين التاسع (PP-التاسع)، إلى المنتج النهائي، الهيم. نتيجة لذلك تتراكم خلايا السرطان PP-تاسعا، مقارنة بالخلايا العادية^4،5. يسمح هذا التراكم من PP-تاسعا في السرطان وخلايا ما قبل السرطان بالنسبة للأنسجة المحيطة للتوقيت الصيفي الباسفيكي يكون نهجاً مستهدفة مع الحد الأدنى من الأحداث الضائرة. تشعيع الضوء يؤدي إلى توليد الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية عندما يقبل الأكسجين الإلكترونات متحمس من PP إلى التاسع. وقد PP-تاسعا امتصاص ذروة في طيف الأشعة فوق البنفسجية مع قمم أصغر في جميع أنحاء طيف الضوء المرئي، بما في ذلك الضوء الأزرق والأحمر². تشكيل روس قد تؤدي في نهاية المطاف إلى الخلية المبرمج واضطراب الغشاء والضرر المتقدرية، التحوير المناعي، وانتشار keratinocyte والكولاجين دوران^6،7،،من^{89 , 10}.

التوقيت الصيفي الباسفيكي في السبعينات وهو طريقة علاجية متطورة³. البروتوكول وافقت إدارة الأغذية والعقاقير لعلاج المحور وتوصي الجلد 5-علاء الحضانة ح 14 – 18، ولكن يشيع استخدامها في الممارسة السريرية²إينكوبيشنز ح 1 إلى 2. في المختبر، وقد أظهرنا أن أقصر مدة 15 دقيقة 5-علاء إينكوبيشنز قد يزيد تنتجها الخلايا الليفية الخلية المبرمج مقارنة بالخلايا الليفية غير المعالجة^11،12. بالإضافة إلى ذلك، تجري دراسة رواية تشلورين و phthalocyanine PSs نانوحبيبات المستندة إلى تحسين فعالية التوقيت الصيفي الباسفيكي³. وهنا، نقدم أسلوباً في المختبر لدراسة التوقيت الصيفي الباسفيكي في الخلايا الحرشفية ملتصقة الخلايا. في هذا البروتوكول، وهي المحتضنة الخلايا SCC-13 مع 0، 0.5، 1.0، 2 مم 5-علاء 30 دقيقة وفوتواكتيفاتيد مع الضوء الأزرق نانومتر 417 1000 s. قياس النتيجة الأولية هو المبرمج ونخر، مقيسة أنيكسين-V و 7-أمينواكتينوميسين د (7-عاد) التدفق الخلوي. هذا العلاج يهدف إلى محاكاة التوقيت الصيفي الباسفيكي، ويمكن تعديل لدراسة استخدام التوقيت الصيفي الباسفيكي مع أخرى خطوط الخلايا أو الضيائية، ودرجات حرارة الحضانة أو الأطوال الموجية فوتواكتيفيشن. إعداد مجموعات مراقبة إضافية قد تكون ضرورية، بما في ذلك فلوروفوري أونستاينيد، واحد ملون، عناصر سلبية وإيجابية للتدفق الخلوي. استعراض شامل لنظرية، والبروتوكولات، والتصميم التجريبي، والنابضة للمبرمج/نخر التدفق الخلوي يمكن الاطلاع على أماكن أخرى¹³.

1-إعداد الخلايا

1. لوحة 20,000 الخلايا في 2 مل من الثقافة المتوسطة في كل من لوحة 6-جيدا باستخدام تقنية تعقيم في السلامة الأحيائية مجلس الوزراء جيدا.
2. وضع لوحات 6-جيدا في حاضنة هوميديفيد (37 درجة مئوية، 5% CO₂) عن 24 ساعة للسماح للخلايا على التمسك بلوحات.

2-إعداد محسس ضيائي لعلاج خلايا

1. إعداد الحلول 5-علاء 0.5 و 1 و 2 مم في المتوسط الثقافة. إذا كان الجنين المصل البقري (FBS) عنصر من عناصر الثقافة المتوسطة، إعداد وعلاج الخلايا مع 5-علاء في حل الثقافة المتوسطة مع 0.1% FBS إينكوبيشنز. ^{11 , 12} وفي هذه الحالة، الخلايا SCC-13 لا تتطلب FBS، حيث تمت إضافة 5-علاء مباشرة لتستكمل مع البقري النخامية وعامل نمو البشرة keratinocyte المتوسط خالية من المصل.
2. نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 2 مل على الأقل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
3. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل حلول 5-علاء 0 أو 0.5 أو 1 أو 2 ملم في لوحات منفصلة أو الآبار.
4. احتضان الخلايا مع 0، 0.5، 1، أو 2 مم 5-علاء على 36 إلى 37 درجة مئوية تدفئة كتلة للحد الأدنى 30 حماية الخلايا من التعرض للضوء أثناء الحضانة باستخدام رقائق الألومنيوم.
5. نضح حلول 5-علاء 0، 0.5، 1، 2 مم وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
6. نضح برنامج تلفزيوني وإضافة 2 مل من الثقافة المتوسطة تشعيع الضوء الأزرق.

3-الأزرق المعالجة الضوئية الخفيفة

1. قبل المعالجة الخلايا، قم بتشغيل الجهاز الضوء الأزرق (مثلاً، أدى، فلوري، أو ضوء الهالوجين) وتشغيل لدورة واحدة (1,000 s) لالاحماء الجهاز. يجب أن يكون الجهاز الضوء الأزرق الطول موجي ناتج من 417 +/-5 نانومتر. السماح للجهاز بتشغيل لدورة واحدة قبل العلاج يضمن أن الطول الموجي الضوء الأزرق والإشعاع تكون متسقة طوال مرحلة فوتواكتيفيشن.
2. استخدام فوتومتريه لقياس الإشعاع على سطح الخلية. ينبغي أن يكون الإشعاع الضوء الأزرق على سطح الخلية 10 ميغاواط/سم². المسافة بين الضوء والخلايا قد تحتاج إلى تعديل لتحقيق الإشعاع 10 ميغاواط/سم² تبعاً لكثافة مصدر الضوء.
3. ضع مجموعات معاملة علاء 0، 0.5، 1، 2 مم على سطح أسود تحت مصدر الضوء الأزرق. تشعيع الخلايا مع الضوء الأزرق ل 1000 s (16 دقيقة و 40 ثانية) فلوينس إجمالي 10 J/سم². وعقب فوتواكتيفيشن الضوء الأزرق، الخلايا جاهزة للتحليل.

4-جمع وتلطيخ

1. إعداد المخزن المؤقت التدفق طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).
2. نضح المتوسطة الثقافة وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
3. أضف 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا وتسمح للخلايا لفصل لحوالي 3 إلى 5 دقائق. وقد درست الخلايا تحت المجهر للتأكد من خلايا مفرزة.
4. أضف 1 مل من الثقافة المتوسطة (أو برنامج تلفزيوني) مع 10% مصل البقر الجنين لإلغاء تنشيط التربسين.
5. جمع تعليق خلية في أنابيب تدفق المسمى 5 مل.
6. تدور أنبوب تدفق 5 مل في أجهزة الطرد مركزي في 201 x ز لأدنى 5 حل Aspirate دون إزالة خلية بيليه.
7. إضافة 200 ميليلتر من تدفق المخزن المؤقت مع جسم أنيكسين-V مترافق (1 ميليلتر الخامس annexin كل ميليلتر 39 من تدفق المخزن المؤقت) لكل عينة.
8. ريسوسبيند الخلايا، ووضع في الحاضنة (37 درجة مئوية، 5% CO₂) لمدة 20 دقيقة للسماح للربط أننيكسين-V.
9. إضافة 3 ميليلتر من 7-عاد لكل عينة. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

5-تدفق سيتوميتريك التحليل

1. اتبع إرشادات الشركة المصنعة سيتوميتير تدفق للإعداد (انظر الجدول للمواد).
2. جمع وتحليل عينات مع التدفق الخلوي. ¹³
3. تنفيذ مقارنة إحصائية للعلاج ومجموعات المراقبة باستخدام تحليل التباين (ANOVA)¹⁴. مقارنة الوسائل المجموعات المعاملة إلى الوسط لعنصر التحكم مع اختبار دونيت لتحليل الوظائف المخصصة .

بعد SCC-13 الخلايا المحتضنة لمدة 30 دقيقة مع 0، 0.5، 1، 2 مم 5-علاء والمشع مع 1000 s زرقاء خفيفة، كانت هناك زيادة الجرعة في الخلية المبرمج. كان إجمالي المبرمج (يعني ± الخطأ المعياري للوسط) ± 3.94 0.34، ± 7.90 0.52، 23.86 ± 0.52 و ± 38.33 1.81 بعد 30 دقيقة من الحضانة مع 0، 0.5، 1، 2 مم 5-علاء، على التوالي، و 1000 ثانية من الأزرق الضوء (الشكل 1). أننا بالمقارنة مع متوسط النسبة المئوية للخلية apoptotic بين 0، 0.5، 1، 2 مم 5-علاء المحتضنة المجموعات استخدام ANOVA. وكان الخلايا تعامل مع 1 و 2 مم 5-علاء زيادة كبيرة في الخلية المبرمج مقارنة بالخلايا المعالجة 5-علاء 0 ملم. ويبين الشكل 2 ألف تدفق الممثل سيتوميتريك النابضة للأمام مبعثر (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) للخلايا SCC-13 المحتضنة مع 0، 0.5، 1، 5 ملم 2-ألاباما ويرفق النابضة دائرة السكان خلية SCC-13. لهذه التجربة، وجمعت الأحداث 7500 وبوابة السكان خلية SCC-13 القبض على 90 في المائة على الأقل من الأحداث. ويبين الشكل 2B قطعة 7-عاد ممثل على المحور السيني والخامس أنيكسين على المحور ص. سكان الخلية هي بوابة إلى أربعة أجزاء (Q1 إلى Q4) تمييز الخلايا أبوبتوتيك. Q1 (ارتفاع أننيكسين-v، وانخفاض 7-عاد) تمثل الخلايا تمر بالمبرمج مبكرا. Q2 (ارتفاع أننيكسين-v، وارتفاع 7-عاد) تمثل الخلايا تمر أواخر المبرمج أو نخر. Q3 (منخفض أننيكسين-v، وارتفاع 7-عاد) تمثل الخلايا تمر نخر. Q4 (منخفض أننيكسين-v، وانخفاض 7-عاد) تمثل الخلايا لا يخضع المبرمج أو نخر. وأضاف نحن في حساب النسبة المئوية للخلايا تمر بالمبرمج، النسبة المئوية للخلايا في Q1 و Q2. عدم تناسق في طول فترة حضانة المرض 5-علاء أو درجة حرارة الحضانة جرعة الإشعاع فوتواكتيفيشن قد يغير فعالية التوقيت الصيفي الباسفيكي. يوضح الشكل 3 مؤامرة سيتوميتريك تدفق أننيكسين-V و 7-عاد ممثل عندما تختلف درجة حرارة الحضانة (أي 27 أو 36 أو 42 درجة مئوية). كانت هناك زيادة درجة حرارة تعتمد في المبرمج.

رقم 1: زيادة الجرعة تعتمد على المبرمج بعد الثلاثين دقيقة الحضانة من 5-ألاباما 5-علاء المحتضنة في 36 درجة مئوية لمدة ثلاثين دقيقة تليها 1,000 s الضوء الأزرق في الخلايا SCC-13. أشرطة تمثل متوسط النسبة المئوية أنيكسين-V الخلايا إيجابية في كل مجموعة عنصر التحكم والعلاج. وأجريت تجارب في ثلاث نسخ التقنية. دلالة إحصائية يحدده ANOVA، مع ف < 0.05 النطاق المرمز إليه بواسطة علامة نجمة (*). تمثل أشرطة الخطأ ± يعني الخطأ المعياري للوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: مؤامرات الممثل التدفق الخلوي- (أ) ممثل الأمام التبعثر مقابل الجانب مبعثر الخلوي مؤامرات في وحدات التعسفي (الاتحاد الأفريقي) للعاشر-وص المحور المحور للخلايا المحتضنة 5-علاء 0، 0.5، 1، 2 مم. لهذه التجربة، وجمعت الأحداث 7500 وبوابة السكان خلية SCC-13 القبض على 90% أحداث. (ب) أنيكسين-V الممثل مقابل 7-عاد التدفق الخلوي المؤامرات في الاتحاد الأفريقي للعاشر-وص المحور المحور للخلايا المحتضنة 5-علاء 0، 0.5، 1، 2 مم. Q1: المبكر apoptotic الخلايا، Q2: الراحل apoptotic/نخرية الخلايا، Q3: نخرية الخلايا، و Q4: خلايا قابلة للحياة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: حضانة 5-علاء في درجات حرارة مختلفة قد يغير فعالية التوقيت الصيفي الباسفيكي. Annexin V الممثل مقابل 7-عاد التدفق الخلوي المؤامرات في الاتحاد الأفريقي للعاشر-وص المحور المحور للخلايا SCC-13 المحتضنة مع 0.5 مم 5-علاء في 27 و 36 و 42 درجة مئوية. Q1: المبكر apoptotic الخلايا، Q2: الراحل apoptotic/نخرية الخلايا، Q3: نخرية الخلايا، و Q4: خلايا قابلة للحياة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

وقدمت "الصيدلة" DUSA/الشمس 5-علاء والجهاز الخفيفة بلو-U. هذه المخطوطة وأيده المتبقية الدكتور جاجديو التمويل. المحتويات لا تمثل وجهات نظر حكومة الولايات المتحدة أو إدارة شؤون قدامى المحاربين في الولايات المتحدة.