غالباً ما تتم دراسة قنوات أيون ميتشانوسينسيتيفي من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع تسجيل التصحيح-المشبك. مع ذلك، يمكن النتائج المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون تبعاً للبروتوكول التجريبي، والخاطئة. هنا، نحن نقدم طرق لمنع وتصحيح مثل هذه الأخطاء مع أساس نظري.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك التصحيح مفتوحة: تدفق الآثار في السيطرة على قنوات أيون بالسوائل
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تدفق السائل هو حافز بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية، مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية إلى قوة تدفق السائل/الإمالة ليست مفهومة تماما، قد تساهم السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة خطيرة. ولذلك، درست حساسية قوة تدفق السائل/القص قنوات أيون استخدام تقنية المشبك التصحيح. ومع ذلك، اعتماداً على البروتوكول التجريبي، والنتائج وتفسير البيانات يمكن الخاطئة. وهنا نقدم الأدلة التجريبية والنظرية للأخطاء المتعلقة بتدفق السوائل، وتوفير أساليب لتقدير ومنع وتصحيح هذه الأخطاء. التغييرات في مفرق المحتملة بين القطب مرجع Ag/AgCl وسوائل الاستحمام قيست مع ماصة مفتوحة مليئة 3 م بوكل. يمكن تدفق السائل ثم تحول mV تقاطع السائل/المعادن المحتملة إلى حوالي 7. على العكس من ذلك، عن طريق قياس الجهد التحول الناجم عن تدفق السوائل، قمنا بتقدير تركيز أيون في طبقة الحدود أونستيريد. في حالة ثابتة، يمكن أن تصل إلى تركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي أو أيون قناة المدخل على سطح غشاء الخلية منخفضة حوالي 30% من أن في حالة تدفق. وضع [اغروس] 3 م بوكل جسر بين مسرى السائل ومرجع الاستحمام قد حالت هذه المشكلة من مفرق التحول المحتملة. ومع ذلك، يمكن أن لا ثابتة تأثير الطبقة أونستيريد متجاورة على سطح غشاء الخلية بهذه الطريقة. هنا، نحن نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيرريد مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة، مؤكدا على أهمية استخدام ملح على [اغروس]-جسر أثناء دراسة تنظيم السوائل الناجم عن تدفق التيارات أيون. ولذلك، هذا النهج المبتكر، الذي يأخذ في الاعتبار الحقيقي تركيزات الأيونات في طبقة الحدود أونستيريد، قد توفر نظرة مفيدة على التصميم التجريبي وتفسير البيانات المتصلة بتنظيم السوائل القص إجهاد قنوات أيون .
المقدمة
تدفق السائل هو جديلة بيئية هامة التي تتحكم في العديد من العمليات الفسيولوجية والباثولوجيه مثل السوائل الناجم عن تدفق توسع الأوعية والقص السائل تعتمد على قوة الأوعية الدموية يعيد البناء والتنمية1،2، 3،،من45. على الرغم من أن الآليات الجزيئية للاستجابات البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل ليست مفهومة تماما، هو يعتقد أن السوائل تنظيم تدفق بوساطة أيون قناة النابضة قد تسهم حاسمة في الاستجابات الناجمة عن تدفق السوائل5 , 6 , 7 , 8. على سبيل المثال، تنشيط مقوم إلى الداخل بطانية Kir2.1 و Ca2 +-تنشيط ك+ (2.3 كالمرجع المصدق، KCNN3) القنوات بعد قد اقترح Ca2 + تدفق بتدفق السوائل للمساهمة في السوائل توسع الأوعية الناجمة عن تدفق6،،من78. لذلك، العديد من القنوات الأيونية، قنوات خاصة تنشيط ميكانيكيا أو-تحول دون، وقد درست من حيث تدفق السائل/القص قوة حساسية مع التصحيح-المشبك تقنية6،،من910 , 11-ومع ذلك، تبعاً للبروتوكول التجريبية التي يتم إجراؤها أثناء تسجيل التصحيح المشبك، النتائج وتفسير البيانات المتعلقة بأنظمة تدفق السائل من قنوات أيون يمكن أن تكون الخاطئة10،11.
مصدر واحد من التحف التي يسببها تدفق السائل في تسجيل التصحيح-المشبك من مفترق الطرق المحتملة بين السوائل حمام و القطب مرجع Ag/AgCl11. ويعتقد عموما أن تقاطع السائل/المعادن المحتملة بين سائل الاستحمام والقطب Ag/AgCl ثابت كما أن تركيز Cl– من سائل الاستحمام تظل ثابتة، النظر في الاستجابة الكيميائية بين الحل الاستحمام وقطب Ag/AgCl لتكون:
Ag + Cl–↔ AgCl + إلكترون (e–) (المعادلة 1)
ومع ذلك، في حالة حيث رد فعل الكهروكيميائية عموما بين حل الاستحمام والقطب مرجع Ag/AgCl (المعادلة 1) ينطلق من اليسار إلى اليمين، تركيز Cl– من سائل الاستحمام المتاخمة لحج/AgCl مرجع قطب كهربائي (طبقة الحدود أونستيريد12،13،،من1415) قد تكون أقل بكثير من ذلك في الجزء الأكبر من الاستحمام الحل، ما لم تضمن ما يكفي النقل كونفيكشونال. استخدام قطب Ag/AgCl القديمة أو غير المثالية مع عدم كفاية كلورة Ag قد يزيد هذا خطر. ويمكن استبعاد هذه الأداة المتعلقة بتدفق السوائل في مسرى الإشارة، في الواقع، بمجرد وضع جسر [اغروس]-الملح تقليدية بين سائل الاستحمام ومرجع القطب، قطعة أثرية مبنية على التعديلات في Cl الحقيقي– تركيز المتاخمة ل القطب Ag/AgCl11. البروتوكول الواردة في هذه الدراسة، توضح هذه المقالة كيفية منع التغييرات المحتملة المتصلة بتدفق مفرق وقياس تركيزات أيون الحقيقية في طبقة الحدود أونستيريد.
بعد وضع [اغروس] بوكل جسر بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl، هناك عامل حاسم آخر ينبغي النظر فيه: قطب Ag/AgCl فقط كالمرجع أعمال مثل قطب Cl– ، قنوات أيون أيضا يمكن أن تعمل مثل قطب الأيوني انتقائي. تنشأ حالة طبقة الحدود أونستيريد بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl أثناء حركة الأيونات بين الحلول خارج الخلية وداخل الخلية عن طريق قنوات أيون الغشاء. وهذا يعني أنه ينبغي توخي الحذر عند تفسير اللائحة لايون القنوات بتدفق السائل. كما نوقش في أعمالنا السابقة دراسة11، حركة الأيونات من خلال حل موجود تدرج الكهروكيميائية التي يمكن أن تحدث عن طريق ثلاث آليات متميزة: نشر، والهجرة، والحمل الحراري، حيث يتم نشر الحركة الناجمة عن الانحدار تركيز، الهجرة هي حركة يقودها التدرج الكهربائية، والحمل الحراري هو الحركة من خلال تدفق السائل. بين هذه الآليات النقل الثلاثة، يساهم الوضع الحراري معظمها إلى حركة أيونات11 (000 1 > مرة أكبر من نشرها أو الهجرة ضمن إعدادات التصحيح-المشبك المعتاد). وهذا يشكل الأساس النظري للسبب في مفرق المحتملة بين سائل الاستحمام وقطب مرجعي Ag/AgCl يمكن جداً تحت ظروف ثابتة وتدفق السوائل المختلفة11.
حسب الفرضية المقترحة أعلاه، يمكن الاستدلال بعض الآثار مسهل لتدفق السوائل على قناة أيون الحالية من إعادة الحمل الحراري بتركيزات أيون الحقيقي المتاخمة لمدخل القناة على سطح غشاء (طبقة الحدود أونستيريد) 10. في هذه الحالة، الآثار الناجمة عن تدفق السائل على أيون قناة التيارات نشأت من أحداث الكهروكيميائية، ليس من تنظيم أيون قناة النابضة ببساطة. واقترح باري والزملاء12،13،،من1415 استناداً إلى اعتبارات نظرية صارمة والأدلة التجريبية، والمعروف أيضا طبقة أونستيريد سابقا فكرة مماثلة أو تأثير عدد النقل. إذا كان بعض القنوات أيون كافية قد تنشأ الموصلية قناة واحدة وطويلة بما يكفي فتح الوقت لتوفير معدلات النقل كافية من خلال القنوات (أسرع معدل نقل في الغشاء من سطح غشاء أونستيريد،) تأثير طبقة الحدود . وهكذا، يمكن أن يسهم النقل الحراري-تعتمد على التسهيلات التي يسببها تدفق السائل في نهاية المطاف لايون الحالية10،،من1213،،من1415.
في هذه الدراسة، ونشدد على أهمية استخدام أجار أو [اغروس] الملح-جسر أثناء دراسة تنظيم التيارات أيون الناجم عن تدفق السائل. كما نقدم طريقة لقياس تركيزات أيون الحقيقية في أونستيريد الطبقة الحدودية المتاخمة لقنوات أيون Ag/AgCl القطب والغشاء مرجع. وعلاوة على ذلك، تفسير نظري للتحوير السوائل الناجم عن تدفق التيارات قناة أيون (أي فرضية الحراري أو تأثير طبقة أونستيريد النقل رقم) يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تصميم وتفسير الدراسات في القص القوة-تنظيم قنوات أيون. وفقا لتأثير طبقة الحدود أونستيريد رقم النقل، ونتوقع أن أيون قناة التيارات من خلال جميع أنواع غشاء أيون قنوات يمكن أن تيسره تدفق السوائل، مستقلة عن الحساسية البيولوجية لقوة القص تدفق السوائل، ولكن فقط إذا قنوات أيون لها كافية قناة واحدة الموصلية وفتح-منذ وقت طويل. قد تزيد من أعلى الكثافات الحالية قناة أيون تأثير طبقة الحدود أونستيريد على سطح غشاء الخلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها جامعة كونكوك المؤسسية.
1-[اغروس] الملح الجسور بين حل حمام وقطب مرجعي Ag/AgCl
ملاحظة: [اغروس] 3 م بوكل تنتج الملح الجسور كما سبق وصف12 مع وجود اختلافات طفيفة.
- تشكيل الجسور
- ثني الأنابيب الشعرية الزجاج النار شكل U-شكل حسب الاقتضاء. القطر الداخلي الشعيرات الدموية ينبغي أن تكون كبيرة بما يكفي لخفض المقاومة سلسلة عند تسجيل التيارات أيون الكبيرة. أنابيب بقطر داخلي من 2-5 مم عادة مقبولة.
- إعداد حل بوكل م 3 [اغروس]
- تحضير 100 مل من محلول بوكل م 3 (أيضا مقبول م 1 أو 2 م).
- وزن 3 غرام من [اغروس].
- يحل [اغروس] في 100 مل بوكل (أي، [اغروس] 3%) على لوحة الساخن بين 90 و 100 درجة مئوية.
- تحميل الجسور مع 3 م بوكل [اغروس]
- لتحميل سهلة، تزج الجسور الزجاج على شكل U في حل بوكل [اغروس].
ملاحظة: من السهل حفر الجسور الزجاج إذا كان الحل [اغروس]-بوكل يرد في حاوية ضحلة وواسعة النطاق. - الاحتفاظ بها بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة (RT) على [اغروس] لتعيين وتتصلب.
- بعناية إلى حفر الجسور الزجاج [اغروس]-بوكل-تحميل من مجموعة/تصلب [اغروس]-الملح.
- لتحميل سهلة، تزج الجسور الزجاج على شكل U في حل بوكل [اغروس].
- تخزين الجسور
- إعداد ما يكفي من وحدة التخزين (أي 500 مل) الحل بوكل م 3 في زجاجة على مستوى العنق.
- تخزين استعداد الجسور [اغروس]-الملح في الزجاجة في ثلاجة.
2-تطبيق قوة القص تدفق السائل إلى خلايا في غرفة لقط التصحيح
ملاحظة: يظهر من الرسم تخطيطي للتصحيح-المشبك طريقة إعداد تجريبية في الشكل 1.
- مكان حاوية محملة بالاستحمام الحل (ينبغي قياس حجم وارتفاع الفعل) أعلاه قاعة التصحيح-المشبك.
- تعبئة قاعة التصحيح-المشبك بالحل الاستحمام بالمص الأنبوب.
- لوقف تدفق السوائل، مقطع الأنبوب في الجانب الحاوية عرقلة تدفق السائل، ثم مقطع الأنبوب إلى جانب شفط لوقف الشفط في نفس الوقت. وهذا الشرط تحكم "ثابتة".
- لتطبيق قوة القص تدفق السوائل، فتح أنابيب كلا الجانبين الحاوية والشفط في نفس الوقت.
- قبل أو بعد تطبيق قوة القص تدفق السائل إلى الخلية، قياس معدل التدفق في مل/دقيقة.
- حساب معدل التدفق بقياس الانخفاض في حجم السوائل على مدى فترة زمنية معينة.
- من معدل التدفق المقاسة والهندسة (هيكل) غرفة الاستحمام، ينبغي تقدير قوة القص المطبق على الخلية بتدفق السوائل (انظر القسم المناقشة).
- وبدلاً من ذلك، التحكم في معدل تدفق (بالنسبة للخطوات 2، 3-2.6)، استخدام مضخة التروية. في هذه الحالة، ينبغي الحرص على ضمان ثابت بدلاً من تدفق نابض.
3-قياس التغيرات في إمكانات مفرق المعدن السائل بتدفق السوائل بين حل حمام وقطب مرجعي Ag/AgCl (الشكل 3A)
- استخدام Ag/AgCl قطب كهربائي أو بيليه، الذي يتوفر من المنتجات الجاهزة، دون الجسر الملح [اغروس].
- إعداد الملحية ملح فيزيولوجية طبيعية لقاعة الاستحمام (مثلاً، 143 مم كلوريد الصوديوم، 5.4 مم بوكل، 0.33 ملم نة2ص. ب4، 5 ملم حبيس، 0.5 مم مجكل2و 1.8 مم كاكل2، 11 مم د-الجلوكوز؛ الرقم الهيدروجيني تعديلها إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم).
- ضع ماصة تصحيح تتضمن حلاً بوكل م 3 في قاعة للتقليل من مفرق التحول المحتملة بين ماصة وحلول الاستحمام.
- إصلاح مكبر للصوت المشبك الجهد لوضع المشبك الحالي ("أنا = 0" أو "نسخة").
- بعد إبطال إمكانية إزاحة الأولية، لقياس التغيرات في الجهد الناجم عن معدلات تدفق مختلف.
- للتحقق من أن التغييرات في الجهد إمكانيات تقاطع السائل/المعادن، إعادة النظر في تأثير تدفق السائل على مفرق إمكانات استخدام الجسر [اغروس]-الملح بين حل حمام والقطب Ag/AgCl.
4-التجريبية تقدير تركيز حقيقي Cl– في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب Ag/AgCl تحت ظروف ثابتة (الشكل 3B)
- من نتائج الخطوة 3، رسم العلاقات معدل تدفق إمكانات مفرق وتقدير القيمة الأعلى (تشبع) من تقاطع التحول المحتملة في معدل تدفق الموائع والحاشية.
- إعداد الحلول بتركيزات مختلفة من Cl (أي، 50 و 99، 147، 195، و 288 مم من كلوريد الصوديوم).
- عن طريق تغيير Cl– تركيز في سائل الاستحمام، رسم العلاقة مفرق المحتملة-[Cl–]. ملاحظة أن معدل السوائل يجب أن تكون ثابتة وعالية بما فيه الكفاية (> 30 مل/دقيقة) لمنع انخفاض تركيز Cl– لأن القطب مرجع Ag/AgCl المجاورة.
- من منحنيات العلاقة اثنين، تقدير التغيرات في تركيز Cl– من مفرق قياس التحول المحتملة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وسجلت الخلية كلها تعتمد على الجهد Ca L من نوع2 + قناة (فدككل) التيارات في myocytes الشرياني المساريقي العلوي الفئران انزيماتيكالي مشتتة، كما هو موضح سابقا11. وقد دياليزيد myocytes الشرياني مع حل ماصة Cs غنية تحت التكوين مثقوبة النيستاتين مع الحل divalent الاستحمام خالية من الأيونات الموجبة لتيسير تدفق الحالية من خلال11،فدككل16. موجز ديبولاريزينج الجهد سلالم أو خطوات الجهد، ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وفي هذه الدراسة، أثبتنا طريقة لقياس تركيز Cl– الحقيقية في طبقة أونستيريد المتاخمة للقطب مرجع Ag/AgCl بتحديد تقاطع السائل المعدنية المحتملة مع ماصة المشبك تصحيح مفتوحة مليئة بوكل عالية التركيز. يمكن أن يؤدي التغيير في تركيز Cl– في طبقة الحدود تحولاً إمكانات تقاطع عند التبديل من ثابت إلى ظروف التدفق السائل. ببساطة باستخدام [اغروس] بوكل جسر بين القطب مرجعية وسوائل الاستحمام يمكن منع الأخطاء المتعلقة بتركيز Cl– أو القطع الأثرية أثناء تسجيل التصحيح-المشبك.
بالإضافة ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا البحث كان يدعمها "العلم بحوث البرامج الأساسية" (2015R1C1A1A02036887 وجبهة الخلاص الوطني-2016R1A2B4014795) من خلال "مؤسسة البحوث الوطنية كوريا" تموله وزارة العلوم، تكنولوجيا المعلومات والاتصالات "برنامج مركز بحوث رائدة" (2011-0027921)، "تخطيط المستقبل"، ومنحة من كوريا الصحة التكنولوجيا والتطوير د المشروع من خلال معهد التنمية الصناعة (خيدي) كوريا الصحة، تموله وزارة الصحة والرعاية الاجتماعية، جمهورية كوريا (HI15C1540).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| RC-11 غرفة الحمام المفتوحة | وارنر ، الولايات المتحدة الأمريكية | W4 64-0307 | |
| Ag / AgCl قطب بيليه | World Precision Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكية | EP1 | |
| Agarose | Sigma-aldrich ، الولايات المتحدة الأمريكية | A9793 | |
| مضخم الجهد | المشبك HEKA ، ألمانيا | EPC8 | |
| مضخم الجهد المشبك | الأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكية | Axopatch 200B | |
| مضخة سائلة | KNF Flodos ، سويسرا | FEM08 |
المراجع
- Gerhold, K. A., Schwartz, M. A. Ion Channels in Endothelial Responses to Fluid Shear Stress. Physiology (Bethesda). 31 (5), 359-369 (2016).
- Garcia-Roldan, J. L., Bevan, J. A. Flow-induced constriction and dilation of cerebral resistance arteries. Circulation Research. 66, 1445-1448 (1990).
- Langille, B. L., O’Donnell, F. Reductions in arterial diameter produced by chronic decreases in blood flow are endothelium-dependent. Science. 231, 405-407 (1986).
- Pohl, U., et al. Crucial role of endothelium in the vasodilator response to increased flow in vivo. Hypertension. 8, 37-44 (1986).
- Ranade, S. S., et al. a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 10347-10352 (2014).
- Hoger, J. H., et al. Shear stress regulates the endothelial Kir2.1 ion channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (11), 7780-7785 (2002).
- Mendoza, S. A., et al. TRPV4-mediated endothelial Ca2+ influx and vasodilation in response to shear stress. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298, H466-H476 (2010).
- Brahler, S., et al. Genetic deficit of SK3 and IK1 channels disrupts the endothelium-derived hyperpolarizing factor vasodilator pathway and causes hypertension. Circulation. 119, 2323-2332 (2009).
- Lee, S., et al. Fluid pressure modulates L-type Ca2+ channel via enhancement of Ca2+-induced Ca2+ release in rat ventricular myocytes. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 294, C966-C976 (2008).
- Kim, J. G., et al. Fluid flow facilitates inward rectifier K+ current by convectively restoring [K+] at the cell membrane surface. Scientific Report. 6, 39585(2016).
- Park, S. W., et al. Effects of fluid flow on voltage-dependent calcium channels in rat vascular myocytes: fluid flow as a shear stress and a source of artifacts during patch-clamp studies. Biochemical and Biophysical Research Communications. 358 (4), 1021-1027 (2007).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. I. Theory. Biophysical Journal. 9 (5), 700-728 (1969).
- Barry, P. H., Hope, A. B. Electroosmosis in membranes: effects of unstirred layers and transport numbers. II. Experimental. Biophysical Journal. 9 (5), 729-757 (1969).
- Barry, P. H. Derivation of unstirred-layer transport number equations from the Nernst-Planck flux equations. Biophysical Journal. 74 (6), 2903-2905 (1998).
- Barry, P. H., Diamond, J. M. Effects of unstirred layers on membrane phenomena. Physiological Reviews. 64 (3), 763-872 (1984).
- Park, S. W., et al. Caveolar remodeling is a critical mechanotransduction mechanism of the stretch-induced L-type Ca2+ channel activation in vascular myocytes. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 469 (5-6), 829-842 (2017).
- A procedure for the formation of agar salt bridges. , Warner Instrument Corporation. Available from: https://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/agar_bridges.pdf (2018).
- Cunningham, K. S., Gotlieb, A. I. The role of shear stress in the pathogenesis of atherosclerosis. Laboratory Investigation. 85 (1), 9-23 (2005).
- Resnick, N., et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Progress in Biophysics & Molecular Biology. 81 (3), 177-199 (2003).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
