نقدم هنا بروتوكول الجيل التالي تسلسل لتسلسل الرنا الريباسي 16S التي تمكن من تحديد وتوصيف المجتمعات الميكروبية داخل الناقلة. هذا الأسلوب ينطوي على استخراج الحمض النووي والتضخيم والمتوازية من عينات عن طريق PCR، تسلسل تدفق الخلايا، والمعلوماتية الحيوية لمطابقة البيانات تسلسل المعلومات النشوء والتطور.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
توصيف ميكروبيومي التجزئة بالتسلسل Amplicon الرنا الريباسي 16S الجيل المقبل
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في العقود الأخيرة، ظهرت من جديد الأمراض المحمولة بالنواقل والتوسع في معدلات، تسبب قدرا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم المفزعة. لا توجد لقاحات فعالة ومتاحة على نطاق واسع لغالبية هذه الأمراض، مما يستلزم وضع استراتيجيات التخفيف من آثار المرض الرواية. وتحقيقا لهذه الغاية، يشمل واعدة لمكافحة الأمراض استهداف ميكروبيومي ناقل، مجتمع الميكروبات التي تسكن في ناقلات. ميكروبيومي ناقلات يلعب دوراً محوريا في ديناميات الكائنات الممرضة، والتلاعب ميكروبيومي أدت إلى انتقال ناقلات انخفاض وفرة أو الممرض لحفنة من الأمراض المحمولة بالنواقل. بيد أن ترجمة هذه النتائج إلى تطبيقات التحكم المرض يتطلب فهم شامل لمكافحة ناقلات الإيكولوجيا الميكروبية، محدودة تاريخيا بتكنولوجيا غير كافية في هذا المجال. قد مكن ظهور نهج الجيل التالي تسلسل تسلسل المتوازية العالية والسريعة للمجتمعات الميكروبية المختلفة. استهداف الجين الرنا الريباسي 16S المحافظة جداً سهلت الأوصاف للميكروبات موجودة داخل ناقلات تحت اختلاف الظروف الإيكولوجية والتجريبية. هذا الأسلوب ينطوي على تضخيم الجينات الرنا الريباسي 16S، المتوازية نموذج عن طريق PCR، تحميل عينات على خلية تدفق للتسلسل، ونهج المعلوماتية الحيوية لمطابقة تسلسل البيانات مع معلومات النشوء والتطور. عادة ما يمكن الأنواع أو تحديد مستوى جنس لعدد كبير من replicates من خلال هذا النهج، وبالتالي الالتفاف حول التحديات للكشف عن انخفاض والقرار الناتج من استزراع التقليدية، والفحص المجهري، أو تلطيخ نسيجية تقنيات. ولذلك، هذا الأسلوب مناسبة تماما لوصف ناقلات الجراثيم تحت ظروف متنوعة ولكن حاليا لا يمكن تقديم معلومات عن وظيفة الميكروبية، موقع داخل ناقل، أو استجابة للعلاج بالمضادات الحيوية. عموما، تسلسل الجيل القادم 16S تقنية قوية لفهم أفضل للهوية ودور ناقلات الجراثيم في ديناميات المرض.
المقدمة
أن عودة ظهور وانتشار الأمراض المحمولة بالنواقل في العقود الأخيرة تشكل تهديدا خطيرا لصحة الإنسان والحياة البرية العالمية. ولا توجد لقاحات فعالة لغالبية هذه الأمراض، وتعيق جهود مكافحة الطبيعة البيولوجية المعقدة ناقلات والتفاعلات ناقل المضيف. فهم دور التفاعلات الميكروبية داخل ناقل في انتقال العوامل الممرضة يمكن أن تسمح لوضع استراتيجيات جديدة والتحايل على هذه التحديات. على وجه الخصوص، التفاعلات بين المرتبطة بمكافحة ناقلات الجراثيم كومينسالس، وسيمبيونتس، ومسببات الأمراض، يشار إلى ميكروبيومي، قد آثار هامة على انتقال العوامل الممرضة. الآن أدلة دامغة تؤيد هذا الزعم، مع أمثلة مما يدل على ارتباط بين ناقلات ميكروبيومي والكفاءة لأمراض من قبيل الملاريا وفيروس زكى، ومرض لايم
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-ضع علامة جمع وتعقيم سطحي
- جمع تعلق القراد عن طريق سحب قطعة من قماش أبيض2 م 1 على موئل المرتبطة بالتجزئة، إزالة القراد إلى الأنواع المضيفة، أو تربية القراد في مختبر15،16. استخدام الملقط غرامة للتلاعب بالقراد وتخزينها في-80 درجة مئوية.
- مكان القراد في أنابيب PCR الفردية وإزالة الملوثات السطحية التي فورتيكسينج لمدة 15 ثانية تباعا مع 500 ميكروليتر من بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2) والايثانول 70% ddH2o.
- ضع القراد في أنبوب بكر جديدة وتمكينها من أيردري.
- في هذا الأنبوب، ميكانيكيا تعطيل الأنسجة القراد بسحق القراد بقذائف الهاون والمدقة (ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ما مجموعة 42 القراد من البيض منفصلة ثلاثة براثن والتعرض البيئي فترتين، 0 و 2 أسابيع في التربة، وجهزت للتسلسل ميكروبيومي. كل مجموعة العلاج، تعتبر مرة واحدة مخلب والتعرض، الواردة في 6-8 تكرار عينات القراد. تم تحميلها على التسلسل الجيل المقبل هذه المقتطفات القراد المجهزة وأسفرت عن 12,885,713 يقرأ إقران نهاية تمرير عامل التصفية. المدرجة في هذا المدى كانت عناصر سلبية 3 من الخطوة الاستخراج، مما أسفر عن مجموعة من 211,214 على ما يلي (المدرجة في العدد السابق). كذلك مقاييس جودة التشغيل جنبا إلى جنب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الجيل التالي تسلسل الرنا الريباسي 16S أصبح نهجاً موحدا لتحديد العوامل الجرثومية ومكنت الدراسة كيف ميكروبيوميس ناقلات الأمراض تؤثر على انتقال العوامل الممرضة. تفاصيل البروتوكول المبينة هنا استخدام هذا الأسلوب للتحقيق في الجمعية المجتمع الميكروبي في باسيفيكوس أولاً، نوع ناقل لمرض لايم؛ ومع ذلك، يمكن تطبيقها على دراسة أنواع القراد أو أنواع ناقلات الأمراض المفصلية الأخرى بسهولة.
في الواقع، تسلسل الرنا الريباسي 16S لتحليل ميكروبيومي قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة ميكروبيوميس لناقلات الأمر.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
هذا العمل كان تدعمها "المؤسسة الوطنية للعلوم" منحا إلى أ. س. (ديب #1427772، 1745411، 1750037).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| العنصر | كتالوج شركة المواد / المعدات | # | |
| 1 | DNeasy Blood & مجموعة المناديل | Qiagen | 69504 |
| 2 | كيوبيت 4 مقياس الفلور | ThermoFisher Scientific | Q3326 |
| 3 | NanoDrop 8000 مقياس الطيف الضوئي | ThermoFisher Scientific | ND-8000-GL |
| 4 | 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems | KK2501 |
| 5 | AMPure XP Beads | Agen Court | A63880 |
| 6 | رف مغناطيسي | ThermoFisher Scientific | MR02 |
| 6 | TE عازلة | Teknova | T0223 |
| 7 | Nextera Index Kit | Illumina | FC-121-1011 |
| 8 | KAPA Library Quantitative Kit | Roche | KK4824 |
| 9 | MiSeq System | Illumina | SY-410-1003 |
| 10 | MiSeq Reagent Kit v3 & nbsp ؛ | Illumina | MS-102-3001 |
| 11 | 10 ملي Tris-HCl مع 0.1٪ Tween 20 | Teknova | T7724 |
المراجع
- Dong, Y., Manfredini, F., Dimopoulos, G. Implication of the mosquito midgut microbiota in the defense against malaria parasites. Public Library of Science Pathogens. 5 (5), (2009).
- Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
