وهنا يقدم بروتوكول لاستخدام الموجودة مسبقاً بنيات الحذف كاسيت مقاومة المضادات الحيوية كأساس لتحقيق طفرات الحذف في سلالات كولاي الأخرى. يمكن تعبئة هذه الطفرات الحذف وإدراجها في محور المقابلة من سلالة المستلم باستخدام توصيل عاثية P1.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنتاج الجينات الحذف في الإشريكيّة القولونية بتوصيل P1 مع أشرطة الكاسيت المهربة مقاومة المضادات الحيوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نهج أول دراسة مهمة الجينات غير معروف في البكتيريا خلق المغلوب هذا الجين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول قوية وسريعة لنقل طفرات الجينات الحذف من سلالة الإشريكيّة القولونية واحد إلى آخر باستخدام توصيل المعمم مع عاثية P1. يتطلب هذا الأسلوب أن الطفرة تكون انتقائية (مثلاً، استناداً إلى اضطرابات الجينات باستخدام غرز كاسيت المضادات الحيوية). مثل هذه الأشرطة المضادات الحيوية يمكن تعبئتها من سلالة مانحة وأدخلت سلالة المستفيدة من تهم بسرعة وتوليد متحولة حذف جينات بسهولة. يمكن تصميم كاسيت المضادات الحيوية تشمل فلبس التعرف على المواقع التي تسمح بختان الإناث الكاسيت ريكومبيناسي الخاصة بالموقع لإنتاج المغلوب نظيفة مع تسلسل ندبة ~ 100-قاعدة-زوج-منذ فترة طويلة في الجينوم. إظهار البروتوكول بانقطاع الجين تاما الترميز عاملاً الجمعية المعنية في نشوء حيوي أوتوترانسبورتير، واختبار تأثير هذا المغلوب على نشوء حيوي ووظيفة هما أوتوترانسبورتير تريميريك أدهيسينس. على الرغم من حذف الجينات بتوصيل P1 قصوره، بسهولة وسرعة تنفيذه جعلها بديلاً جذاباً لأساليب أخرى لحذف الجينات.
المقدمة
نهج أول مشترك لدراسة وظيفة الجين هو أداء الطفرات المغلوب ومراعاة النمط الظاهري الناتج عن ذلك. وهذا يسمى أيضا علم الوراثة العكسي. بكتيريا كولاي كانت العمود الفقري للبيولوجيا الجزيئية للسنوات السبعين الأخيرة، أو حتى، بسبب السهولة في استزراع وبه الانقياد للتلاعب بالجينات1. وقد وضعت عدة أساليب لإنتاج الجينات الحذف في كولاي، بما في ذلك علامة تبادل الطفرات2،3 ، وفي الآونة الأخيرة، ريكومبينيرينج باستخدام λ الأحمر أو ET راك نظم4،5 , 6.
في نظام مستخدمة على ن....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-سلالات والبلازميدات
-
السلالات البكتيرية
- استخدام سلالات BW25113 كولاي 5، JW4179 (BW25113 tamA::kan)7، BL21(DE3)20و BL21ΔABCF21. انظر الجدول للمواد للحصول على مزيد من المعلومات.
-
باكتيريوفاجيس
- استخدام بالعاثية P1فير لتوصيل عامة. تخزين في بالعاثية أسهم سائلة مع بضع قطرات من كلوروفورم (راجع الخطوة 2، 2). للحصول على مزيد من المعلومات، راجع الجدول للمواد.
-
البلازميدات
- استخدام البلازم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
جيل من تاما المغلوب من BL21ΔABCF:
وقد استخدمت سابقا الاستراتيجية المبينة أعلاه لإنتاج سلالة مشتقة من BL21(DE3)، سلالة مختبر قياسية المستخدمة لإنتاج البروتين، وهو الأمثل لإنتاج البروتين الغشاء الخارجي ودعا BL21ΔABCF21. ويفتقر إلى أربعة جينات الترميز للبروتينات الغشاء الخارجي وفيرة هذه السلالة، وبالتالي فهي قادرة على إنتاج البروتينات الغشاء الخارجي المعرب عنها أكثر هيتيرولوجوسلي من سلالة البرية من نوع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
توصيل P1 طريقة سريعة وقوية وموثوق بها لتوليد الجينات الحذف في كولاي. وهذا يتجلى هنا ترانسدوسينج متحولة حذف تاما من سلالة مانحة كيو إلى مستلم المستمدة من BL21. المراحل الرئيسية في عملية توصيل يتم إنتاج ترانسدوسينج ليستي، توصيل نفسها، وختان كاسيت المقاومة أساسه، والتحقق من المغلوب ببكر. في المجموع، العملية تستغرق حوالي أسبوع واحد ويتطلب لا طرق البيولوجيا الجزيئية التي ستستخدم، وبصرف النظر عن PCR النهائي للتحقق. وهكذا، توصيل P1 يمكن أن تتنافس في أنفقت الجهد والوقت مع λ جزئ أحمر وهو أسرع بكثير من الطفرات تب.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
تم الحصول على سلالات مجموعة كيو من المشروع بيوريسورسي الوطني (رجال، اليابان): كولاي. ونحن نشكر "ديرك لينكه" (قسم العلوم البيولوجية، جامعة أوسلو) على دعمه المستمر. تم تمويل هذا العمل من قبل مجلس البحوث منحة النرويج الشباب الباحث 249793 (لجاك ليو جيم).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوية >سلالات < / قوية > | |||
| < م > بكتريا قولونية < / م > BW25113 | NIG | ME6092 | سلالة من النوع البري من مجموعة Keio |
| < م > الإشريكية القولونية < م > BL21 (DE3) Merck | 69450-3 | سلالة التعبير | |
| < > الإشريكية القولونية < م > BL21DABCF | Addgene | 102270 | مشتق من BL21 (DE3) |
| < em> الإشريكية القولونية < م > JW4179 | NIG | JW4179-KC | tamA < em > حذف متحولة |
| P1 vir< / em> | NIG | HR16 | عام العاثية |
| <القوية > البلازميدات < / قوية > | |||
| pCP20 | CGSC | 14177 | مشروط البلازميد مع FLP |
| pASK-IBA2 | IBA GmbH | 2-1301-000 | ناقل التعبير |
| pEibD10 | N / A | N / A | لإنتاج EibD ؛ البلازميد متاح عند الطلب |
| pET22b + | Merck | 69744-3 | ناقل التعبير |
| pIBA2-YadA | N / A | N / A | لإنتاج YadA ؛ البلازميد متاح عند الطلب |
| < قوي > مواد كيميائية < / قوي > | |||
| حمض | الخليكThermoFisher | 33209 | |
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Ampicillin | Applichem | A0839 | |
| Anhydrotetracycline | Abcam | ab145350 | |
| الجسم المضاد للكولاجين من النوع الأول COL-1 | Sigma | C2456 | |
| الكولاجين البقري من النوع الأول | Sigma | C9791 | |
| كلوريد الكالسيوم | ميرك | 102382 | |
| الكلوروفورم | ميرك | 102445 | |
| فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم | VWR | 28029 | |
| صبغة الحمض النووي | Thermo | S33102 | |
| علامة الحجم الجزيئي للحمض | النووي نيو إنجلاند BioLabs | N3232S | |
| DNase I | Sigma | DN25 | |
| مزيج dNTP | نيو إنجلاند Biolabs | N0447 | |
| ECL HRP الركيزة | Advansta | K-12045 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycerol | VWR | 24388 | |
| الماعز المضاد للفأر IgG-HRP | سانتا كروز | sc-2005 | |
| الماعز المضاد للأرانب IgG-HRP | Agrisera | AS10668 | |
| HEPES | VWR | 30487 | |
| الأيزوبروبيل ثيوجالاكتوسيد | VWR | 43714 | |
| Kanamycin | Applichem | A1493 | |
| Lysozyme | Applichem | A4972 | |
| كلوريد المغنيسيوم | VWR | 25108 | |
| كلوريد المنغنيز | سيجما | 221279 | |
| N< / em>- لورويل ساركوزين | سيجما | L9150 | |
| مسحوق الحليب الخالي من الدسم | سيجما | 70166 | |
| كلوريد الصوديوم | VWR | 27808 | |
| tamA< em> التمهيدي الأمامي | Invitrogen | N / A | Sequence 5'-GAAAAAAGG ATATTCAGGAGAAAATGTG-3' |
| tamA< em> التمهيدي العكسي | Invitrogen | N / A | تسلسل 5'-TCATAATT CTGGCCCCAGACC-3'Taq |
| DNA polymerase | New England Biolabs | M0267 | |
| سترات ثلاثي الصوديوم | Merck | 106448 | |
| Tryptone | VWR | 84610 | |
| Tween20 | Sigma | P1379 | |
| مستخلص الخميرة | Merck | 103753 | |
| Equipment | |||
| الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز | Hoefer | SUB13 | |
| مضرب حبة | Thermo | FP120A-115 | |
| CCD كاميرا | Kodak | 4000R | |
| كوفيت التثقيب الكهربائي | Bio-Rad | 165-2089 | |
| وحدة التثقيب الكهربائي | Bio-Rad | 1652100 | |
| جل تصوير | Nippon Genetics | GP-03LED | |
| حاضنة شاكر | Infors HT | Minitron | |
| Incubator | VWR | 390-0482 | |
| الطرد المركزي | الدقيقة Eppendorf | 5415D | |
| فرن الميكروويف | CM1099A | ||
| PCR آلة | Biometra | Tpersonal | |
| PCR | Axygen | PCR-0208-CP-C | |
| مقياس الأس الهيدروجيني | Hanna Instruments | HI2211-01 | |
| غشاء PVDF | ThermoFisher | 88518 | |
| SDS-PAG غرفة الرحلان الكهربائي | ThermoFisher | A25977 | |
| جهاز طرد مركزي منضدي | Beckman Coulter | B06322 | |
| خلاط دوامة | الصناعات العلمية | SI-0236 | |
| حمام مائي | GFL | D3006 | |
| وحدة نقل رطبة | Hoefer | TE22 |
المراجع
- Blount, Z. D. The unexhausted potential of E. coli. eLife. 4, e05826(2015).
- Hamilton, C. M., Aldea, M., Washburn, B. K., Babitzke, P., Kushner, S. R. New method for generating deletions and gene replacements in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 171 (9), 4617-46....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
