Method Article

أديبو--واضحة: منديل مسح طريقة لتصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الدهنية

DOI:

10.3791/58271

⸱

July 28th, 2018

 ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Metabolism, The Rockefeller University, 2Laboratory of Brain Development and Repair, The Rockefeller University, 3Laboratory of Molecular Genetics, The Rockefeller University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سبب المحتوى الدهني المرتفع، قد تم الطعن في الأنسجة الدهنية تصور استخدام الأساليب التقليدية في غذائها. أديبو--واضح هو منديل مسح تقنية تسمح العلامات قوية وعالية الدقة التصوير الفلورسنت الحجمي للأنسجة الدهنية. هنا، نحن تصف الأساليب لإعداد نموذج المعالجة المسبقة وتلطيخ والمقاصة، والمتصاعدة للتصوير.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأنسجة الدهنية يلعب دوراً مركزياً في التوازن الطاقة وثيرموريجوليشن. وهو يتألف من أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية والليفية، والأوعية الدموية والعصب الإسقاطات. على الرغم من أن قد جرى تحديد السيطرة الجزيئية لتحديد نوع الخلية وكيف تتفاعل هذه الخلايا يزداد، فهم أكثر شمولاً لهذه الخلايا الدهنية-المقيم يمكن أن يتحقق بتصور التوزيع والهندسة المعمارية في جميع أنحاء النسيج كله. نهج إيمونوهيستوتشيميستري والفلوره الحالية لتحليل الأنسجة الدهنية تعتمد على مقاطع رقيقة جزءا لا يتجزأ من البارافين. ومع ذلك، التقاط المقاطع رقيقة سوى جزء صغير من النسيج؛ كنتيجة لذلك، يمكن أن يكون متحيزا الاستنتاجات التي توصل إليها بما هي جزء من الأنسجة ويتم تحليل. ولذلك وضعنا أنسجة الدهنية مسح تقنية، أديبو واضحة، للسماح التصور ثلاثي الأبعاد الشاملة لأنماط الجزيئية والخلوية في الأنسجة الدهنية كله. أديبو واضحة وقد تم تكييف من إيديسكو/إيديسكو +، مع التعديلات المحددة التي لإزالة الدهون المخزنة في الأنسجة مع الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة الأصلية تماما. بالاقتران مع ورقة الضوء الفلورية مجهرية، نبدي هنا استخدام الأسلوب أديبو واضحة للحصول على صور عالية الاستبانة الحجمي للأنسجة الدهنية أكملها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وحتى وقت قريب، كان تصور الأنسجة الدهنية كمجموعة غير متبلور من الخلايا الدهنية. على مدى العقود القليلة الماضية، نمت فهمنا أكثر تطورا، مع الدهون من المعترف به الآن أن يكون جهازا معقدة التي تحتوي على أنواع مختلفة من adipocytes، فضلا عن السلائف adipocyte والخلايا المناعية، والخلايا الليفية، والمفرج وإسقاطات العصب. التفاعلات بين هذه الخلايا الدهنية-المقيم وضوحاً آثار في الأنسجة الدهنية وفسيولوجيا العضوي والفيزيولوجيا المرضية1. على الرغم من أن الدراسات الناشئة قد متدهور أهمية الآليات الجزيئية الكامنة وراء بعض التفاعلات، يتطلب فهم أكثر شمولاً التنميط الهيكلية موثوقة من الأنسجة كاملة في الأبعاد الثلاثة (3D).

معرفتنا الحالية مورفولوجيا الأنسجة الدهنية يستند إلى حد كبير على التحليل النسيجي لأقسام رقيقة (5 ميكرومترات) مع تصوير نسبيا عالية التكبير (أكثر من 10 X)2،3. غير أن هذا النهج قد عدة قيود كبيرة. هياكل الخيطية أولاً، معقدة مثل الأعصاب متعاطفة والمفرج، التي من المعروف أن تلعب أدواراً هامة في الدالة الدهنية4،5،،من67، يصعب تقييمها من خلال أقسام رقيقة. ثانيا، بسبب شكله غير متبلور على ما يبدو وعدم وجود ممثل الوحدات الهيكلية للتركيز على، من الصعب نقدر هياكل الأنسجة الدهنية التي تستند فقط إلى تلطيخ الباب. وثالثاً، قد الأنسجة الدهنية محتوى دهني مرتفع جداً، يخلق تحديات في الحصول على مقاطع المسلسل متسقة مناسبة للتعمير تشريحية ثلاثية الأبعاد، طريقة تقليدية المستخدمة في دراسة مورفولوجية الدماغ كله8. ونظرا لهذه العوامل، وهناك حاجة كبيرة لاتباع نهج كل جبل يمكن تقديم التصور ثلاثي الأبعاد لمستودع الدهنية كاملة بينما لا يزال تحقيق القرار الخلوية.

3D التصوير الحجمي للجهاز أكمله يمثل تحديا بسبب آثار obscuring مبعثر الخفيفة. ويأتي مصدرا رئيسيا تشتت الضوء في الأنسجة البيولوجية من الواجهات المائية الدهنية. على الرغم من أن الجهود الرامية إلى القضاء على مبعثر بإزالة الدهون كانت مستمرة لأكثر من قرن، كانت هناك عدد كبير من الابتكارات الأخيرة9. أحد هذه الأساليب إزالة الأنسجة المطورة حديثا تصوير 3D إيمونولابيلينج-تمكين أجهزة مسح مذيب (إيديسكو/إيديسكو +)10،11. بيد أن الأنسجة الدهنية يمثل تحديا خاصا نظراً للمستوى المرتفع من الدهون، ومن ثم، تعديلات إضافية إيديسكو/إيديسكو + البروتوكول المطلوبة لاستخراج الدهون الكامل بينما تحمي الأنسجة من الانهيار. يستخدم بروتوكول تعديل وضعنا، وتسمى الآن أديبو-واضحة، ديليبيديشن على الميثانول/الميثان من الأنسجة الدهنية لتحقيق الشفافية المثلى المناسبة ل التصوير الحجمي عالية الدقة12. نظراً ديليبيديشن خطوة إلى حد كبير يروي اندوجينوسلي أعرب عن الفلورسنت البروتينات مثل التجارة والنقل وطلب تقديم العروض، ويجب تحقيق التصور هذه البروتينات قبل إيمونولابيلينج. عموما، يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسيطة وقوية لدراسة المنظمة مستوى الأنسجة من الخلايا الدهنية-المقيم، وتتبع نسب الخلايا السلف adipocyte، و morphogenesis الدهنية أثناء التطوير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت وفقا للإجراءات التي أقرتها لجنة الاستخدام في جامعة روكفلر ورعاية الحيوان مؤسسية رعاية الحيوان والتجريب.

1-إعداد الأنسجة

  1. إجراء نضح intracardiac القياسية مع ~ 20 مل من 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في 4 درجات مئوية حتى تتم إزالة الدم تماما من الأنسجة.
  2. قم بالتبديل بيرفوساتي إلى ~ 20 مل محلول مثبت (بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 1 x) عند 4 درجات مئوية حتى العنق والذيل يكون تشديد كبير.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة. تجنب ملامسة الجلد والعيون والأغشية المخاطية. وينبغي إيجاد حلول داخل غطاء دخان.
  3. تشريح منصات الدهون ذات الاهتمام بعناية لإزالة لوحة الدهون كاملة دون الأضرار بها. استخدام الملقط انتهت بلانت لتجنب معسر أو الضغط على الأنسجة. تجنب تلويث تشريح الأنسجة مع أي الفراء.
  4. بعد إصلاح الأنسجة في 4% بين عشية وضحاها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية. لكل لوحة الدهون، بعد الإصلاح مع ~ 10 مل من محلول التثبيت في أنبوب مخروطي 15 مل.
  5. أغسل 3 مرات (1 ح في كل) مع برنامج تلفزيوني 1 x الأنسجة في درجة حرارة الغرفة (RT).
  6. تخزين الأنسجة لفترات قصيرة (تصل إلى 2 أسابيع) في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء. للتخزين طويل الأجل (مثلاً، 1-2 سنوات)، تبديل المخزن المؤقت لبرنامج تلفزيوني x 1 مع أزيد الصوديوم 0.05% (كمادة حافظة).
    تنبيه: أزيد الصوديوم شديد السمية عند بلعها شفويا أو امتصاصها من خلال الجلد. وتتركز أزيد الصوديوم ينبغي التعامل مع الحلول (5% أو أكبر) تحت غطاء دخان.

2-ديليبيديشن وبيرميبيليزيشن

التوقيت: 1-2 أيام

  1. إعداد 20%، 40%، 60%، و 80% ميثانول التدرج مع B1n المخزن المؤقت (الجدول 1) (v/v)، مثلاً، 20% من الميثانول/B1n المخزن المؤقت، مزيج 20 مل من الميثانول و 80 مل من B1n المخزن المؤقت. تخزين كافة المخازن المؤقتة في 4 درجات مئوية. وسوف يعجل بلورات جليكاين من مخازن الميثانول/B1n 60% و 80% بسبب التشبع. تجنب إزالة البلورات؛ استخدام حل السائل ليغسل التالية.
    تنبيه: الميثانول متقلبة ومهيجة والقابلة للاشتعال. تجنب الاتصال بالعين أو الجلد.
  2. إزالة الشعر بلطف من العينة تحت مجهر تشريح. سوف يسبب أي الشعر أو الوبر أو الحطام التي تعلق على العينة الظلال أثناء التصوير. نقل العينة تنظيفها في أنبوب جديد.
  3. تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد أو عند 4 درجة مئوية، ما لم يبين خلاف ذلك. للحصول على عينات صغيرة (مثلاً، الخلفي منصات الدهون تحت الجلد/بيريجونادال من صغار الفئران الهزيل)، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل الحل. لعينات كبيرة أو عينات ذات المحتوى الدهني المرتفع (مثلاً، منصات الدهون من السمنة الفئران)، استخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل الحل.
    1. وضع الأنابيب التي تحتوي على عينات أفقياً على شاكر مداري تعيين في ~ 100 لفة في الدقيقة. تأكد من أن العينات التي يمكن أن تتحرك بحرية داخل الأنبوب.
  4. يذوي العينة في سلسلة متدرجة من المخزن المؤقت الميثانول/B1n 20%، 40%، 60%، 80%، و 100% للوقت المشار إليه (الجدول 2). تصغير الحل المرحل.
  5. ديليبيداتي العينة بنسبة 100% الميثان (DCM) (3 مرات)، كل منها فترة حضانة المرض المشار إليها في الجدول 2. وينبغي أن تغرق العينة إلى الجزء السفلي من الأنبوب في نهاية يغسل DCM الثانية والثالثة. إذا لم يكن كذلك، تمديد فترة الحضانة لضمان ديليبيديشن كاملة (مثلاً، تمتد من 30 دقيقة إلى ح 1-2).
    تنبيه: ينبغي التعامل مع DCM داخل غطاء دخان. استخدام حاويات زجاجية للتخزين وميكروسينتريفوجي أنابيب مصنوعة من مادة البولي بروبيلين إينكوبيشنز. لا يمكن استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي للتخزين على المدى الطويل من DCM. أطباق بتري والماصات المصلية مصنوعة من البوليسترين غير متوافقة مع DCM. • قرار مجلس الوزراء متقلبة للغاية. نقل العينة إلى حل جديد بسرعة لمنع جفاف.
  6. تغسل مرتين مع 100 ٪ الميثانول للوقت المشار إليه (الجدول 2).
  7. اختياري: إذا كانت العينة غير perfused جيدا، لون الهيموغلوبين من خلايا الدم الحمراء المتبقية قد يسبب أوتوفلوريسسينسي قوية. بليتش مع 5 ٪ ح2س2 في الميثانول (المجلد 1 من 30 ٪ ح2س2 إلى 5 وحدات التخزين من الميثانول) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. ترطيب العينة في سلسلة عازلة عكس ميثانول/B1n: 80%، 60%، 40% و 20% ميثانول/B1n و 100% B1n المخزن المؤقت (2 مرات) للوقت المشار إليه (الجدول 2).
  9. تغسل العينة مع بتكسوه المخزن المؤقت (الجدول 1) لح 2 في الرايت
  10. تخزين العينة ديليبيداتيد في المخزن المؤقت بتكسوه عند 4 درجة مئوية (تصل إلى 1 سنة) أو انتقل مباشرة إلى الخطوة إيمونوستاينينج.

3-كله جبل إيمونوستينينج

التوقيت: 8-10 أيام

ملاحظة: جميع الخطوات التالية التي ينبغي أن يتم في الرايت إلا إذا ذكر خلاف ذلك، مع الهز والحماية من الضوء. لعينات صغيرة، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل من محلول. لعينات كبيرة، واستخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل من محلول. من المستحسن أولاً التحقق من الأجسام المضادة على قطع صغيرة من الأنسجة أو أقسام الأنسجة المعالجة الميثانول.

  1. تضعف جسم الأولية في المخزن المؤقت بتكسوه لتركيز الموصى بها. الطرد المركزي حل جسم المخفف في ~ 20,000 x ز لمدة 10 دقيقة لمنع إدخال رواسب الأضداد أو تجميعات.
  2. احتضان العينة ديليبيداتيد مع الحل جسم الأولية للوقت المشار إليه (الجدول 2).
  3. تغسل العينة مع المخزن المؤقت بتكسوه في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، ح 1، ح 2، ح 4، وبين عشية وضحاها.
  4. تضعف جسم الثانوية في المخزن المؤقت بتكسوه لتركيز الموصى بها. الطرد المركزي حل جسم المخفف في ~ 20,000 x ز لمدة 10 دقيقة لمنع إدخال رواسب الأضداد أو تجميعات.
    ملاحظة: لتجنب الخلفية العالية الناجمة عن أوتوفلوريسسينسي الأنسجة، ينصح الثانوي الأجسام المضادة مترافق مع فلوروفوريس التي ينبعث منها الضوء في منطقتي البحر الأحمر واستعملنا. اعتماداً على عدد خطوط الليزر المتاحة في مجهر، يمكن تصويرها تصل إلى 3-4 علامات في وقت واحد في عينة واحدة.
  5. احتضان العينة مع الحل جسم الثانوية للوقت المشار إليه (الجدول 2).
  6. أغسل عينة مع المخزن المؤقت بتكسوه في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة، 10 دقيقة، 15 دقيقة، 20 دقيقة، ح 1، ح 2، ح 4، وبين عشية وضحاها.
  7. اختياري: لأنواع النسيج الهش، إصلاح النسيج الملون مع 4% بين عشية وضحاها منهاج العمل في برنامج تلفزيوني x 1 في 4 درجات مئوية المساعدة في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة.
    ملاحظة: هذه الخطوة قد تزيد خلفية التصوير. فإنه ليس من الضروري القيام بهذه الخطوة للأنسجة الدهنية.
  8. تغسل العينة مع برنامج تلفزيوني 1 x في سلسلة من الخطوات الحضانة: 5 دقيقة و 10 دقيقة و 30 دقيقة.
  9. بلطف بإزالة الوبر من العينة تحت مجهر تشريح.

4-الأنسجة المقاصة

التوقيت: 1-2 أيام

  1. اختياري: تضمين العينة في [اغروس] لتسهيل تركيب العينة للفحص المجهري الورقة الضوء.
    ملاحظة: ينصح بشدة هذه الخطوة للأنسجة الدهنية لتحقيق الاستقرار في شكله أثناء التصوير.
    1. إعداد الحل التضمين مع 1% [اغروس] في برنامج تلفزيوني 1 x (w/v). بارد حل التضمين ~ 40 درجة مئوية لتجنب تعريض العينة للحرارة المفرطة.
    2. ضع العينة تنظيفها إلى العفن (مثلاً، طبق بتري أو وزنها القارب) وترتيب ذلك إلى الموضع الذي تريده. تجنب أي ترحيل السائل. صب بلطف الحل تضمين أكثر من العينة. تجنب أي فقاعات الهواء.
    3. واسمحوا [اغروس] يصلب تماما في قطع الرايت خارج كتلة تحتوي على العينة.
      ملاحظة: كافة الخطوات التالية بما في ذلك إينكوباتيونس بين عشية وضحاها وينبغي أن يتم على RT، مع الهز والحماية من الضوء. لعينات صغيرة، استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع 1.6 مل من محلول. لعينات كبيرة، واستخدام أنابيب 5 مل مع 4 مل من محلول.
  2. يذوي العينة في التدرج الميثانول مع H2o: 25%، 50%، 75%، و 100% (3 مرات) للوقت المشار إليه (الجدول 2).
    ملاحظة: نموذج يمكن أن تترك بين عشية وضحاها في الخطوة الميثانول 100%.
  3. احتضان العينة في DCM 100% ح 1 مع الهز (3 مرات). يجب أن تغرق عينة على الجزء السفلي من الأنبوب في نهاية كل غسل DCM. إذا لم يكن الأمر كذلك، تمديد فترة الحضانة لضمان الإزالة الكاملة من الميثانول. يمكن أن تترك العينة بين عشية وضحاها في الخطوة DCM 100%.
  4. احتضان العينة في ديبينزيل خماسي البروم ثنائي الفينيل (قسم تعزيز الحدود) بين عشية وضحاها مع الهز الخفيف لتحقيق مطابقة الانكسار.
    ملاحظة: في نهاية المطاف سيصبح نموذج شفاف في الضوء المرئي.
    تنبيه: قسم تعزيز الحدود خطرة. تجنب أي اتصال مع الجلد. التعامل معها داخل غطاء دخان مع قفازات مزدوج الطبقات. تجاهل القفازات بمجرد أنها ملوثة بقسم تعزيز الحدود. استخدام حاويات زجاجية لأنابيب التخزين وميكروسينتريفوجي (بولي بروبلين) لإينكوباتيونس. لا يمكن استخدام أنابيب ميكروسينتريفوجي للتخزين على المدى الطويل من قسم تعزيز الحدود. أطباق بتري والماصات المصلية مصنوعة من البوليسترين غير متوافقة مع قسم تعزيز الحدود. تنظيف أي انسكاب مع الإيثانول 100%.
  5. احتضان العينة مع قسم تعزيز الحدود الطازجة مع خفيف تهتز لمخزن 2 حاء العينة في RT في الظلام أو الانتقال مباشرة إلى التصوير.
    ملاحظة: ينصح عينات تصويرها في غضون شهر. على الرغم من أن بعض فلوروفوريس أكثر استقرارا من غيرها، لا ينصح بتخزين طويل الأجل من العينات في هذه المرحلة.

5-الفحص المجهري

  1. تصوير مع مجهر الضوء-ورقة متوافق مع قسم تعزيز الحدود.
    ملاحظة: يمكن استخدام فقط الأهداف التي تتم الموافقة عليها للتصوير على أساس المذيبات العضوية ومطابقتها مع الانكسار من قسم تعزيز الحدود غمس الأهداف في تصوير مغمورة قسم تعزيز الحدود.
    1. جبل العينة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] على حامل يمكن منع حركة أثناء التصوير. تزج العينة في غرفة مملوءة بقسم تعزيز الحدود.
    2. جمع z-كومة تغطي العينة كاملة (مثلاً، 1-2 X التكبير) للحصول على كل الأنسجة/هيكل التوزيع علامة للفائدة.
    3. قم بالتبديل إلى هدف مع أعلى التكبير (مثلاً، 4-12 X التكبير) التكبير والتصغير في المناطق ذات الصلة بصورة مفصلة هياكل.
      ملاحظة: الكولاجين هو مساهم رئيسي في المصفوفة خارج الخلية في الأنسجة الدهنية التي تحيط بجميع الخلايا الدهنية13. الكولاجين وقد طيف انبعاث نموذجية تتراوح بين حوالي 400 نانومتر إلى 550 نانومتر14. التصوير العينة مع خط الليزر 488 (الأخضر) وجمع الضوء المنبعثة في نطاق الطول موجي التي تقع ضمن الطيف الانبعاث من الكولاجين (مثلاً، 525-550 نيوتن متر) سوف توفر إشارة أوتوفلوريسسينسي الأنسجة، التي عرضت سابقا على تحدد كفاف الدهون في الخلايا والأنسجة عموما العمارة12.
  2. تصوير مع المقلوب [كنفوكل] أو مجهر اثنين-فوتون.
    1. ضع العينة جزءا لا يتجزأ من [اغروس] إلى شريحة دائرة بأسفل زجاج دون لمس أي قطع بلاستيكية (أو الدائرة التصوير الأخرى المتوافقة مع قسم تعزيز الحدود التي يمكن ختم). تأكد من عدم تسرب قسم تعزيز الحدود.
    2. اختيار الأهداف بمسافات أطول في العمل لتحقيق اختراق أعمق.
      ملاحظة: التصوير، وينبغي أن يتم مع مجهر [كنفوكل] أو اثنين-فوتون مقلوب من خلال الزجاج أسفل الشريحة الدائرة. تجنب الاتصال المباشر بين العينة وغمس الأهداف التي لم يقترح التصوير القائم على قسم تعزيز الحدود.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أديبو--واضحة أعد الدهون كله يمكن تصويرها منصات في 3D لتحليل كيف تتأثر التفاعلات الخلوية ومورفولوجيا الأنسجة في الولايات الهزيل والسمنة. يمكن تطبيق هذا الأسلوب بسهولة تحليل هيكل الدهنية العامة بجمع الإشارات أوتوفلوريسسينسي الأنسجة في قناة الأخضر. أظهرنا سابقا أن أوتوفلوريسسينسي إشارة في التراكبات الدهنية إيجابيا مع بيريليبين تلطيخ، علامة شائعة لمخطط adipocytes ناضجة12. على سبيل المثال، يظهر المسح الضوئي لوحة الدهون تحت الجلد الخلفي (بسوات) باستخدام مجهر الضوء-ورقة م...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أديبو--واضح هو أسلوب مباشر وقوى لإزالة الأنسجة الدهنية، والتي يمكن تنفيذها بسهولة في إعداد مختبر عادية. بالمقارنة مع الأساليب الأخرى المقاصة على أساس مذيب مثل إيديسكو/11،إيديسكو +10،12، أديبو واضحة هو الأمثل خاصة لإزالة الأنسجة الدهنية والأنسجة الأخرى مع المحتوى العالي من الدهون. الخطوة ديليبيديشن يزيل الدهون تماما من الدهنية، ولذلك يسهل إيمونولابيلينج في جميع أنحاء النسيج كله ويقلل إلى حد كبير من مبعثر الخفيفة، مما يتيح التصوير...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر بيرجاكي كريستينا، تونغ تاو والشمال أليسون من مركز الموارد بيويماجينج في جامعة روكفلر للمساعدة والدعم. ونشكر أيضا إكسيفياس قة تشو لتحرير الفيلم. وأيد هذا العمل بالبشرية الحدود العلوم برنامج المنظمة (PC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1x محلول ملحي مخزنبالفوسفات Corning21-040-CV
بارافورمالدهيدسيجما ألدريتشP6148-1KG
ميثانولفيشر ScientificA412SK-4
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100-500ML
توين 20سيجما ألدريتشP2287-500ML
هيبارينسيجما ألدريتشH3393-100KU
ثنائي كلورو ميثانسيجما ألدريتش270991
بيروكسيد الهيدروجين 30٪فيشر ساينتفيك325-100
بنزيل إيثرسيجما ألدريتش108014
أغاروزإنفيتروجين16500500
أزيد الصوديومسيجما ألدريتش71289-5 جرام
جلايسينفيشر ScientificBP381-1
أرنب متعدد النسيلة المضاد للتيروزين هيدروكسيلازMilliporeAB1521: 200 تخفيف
الماعز متعدد النسيلة مضاد ل CD31 / PECAM-1R & D SystemsAF3628التركيز النهائي ل 2 & micro; جم / مل
فئران أحادية النسيلة مضادة ل CD68 ، استنساخ FA-11Bio-RadMCA1957التركيز النهائي 2 & micro ؛ جم / مل
حمار مضاد للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch711-605-152التركيز النهائي 5-10 & micro; جم / مل
حمار مضاد للماعز IgG (H + L) Alexa Fluor 568InvitrogenA11077التركيز النهائي من 5-10 & micro ؛ جم / مل
حمار مضاد للفئران IgG (H + L) Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch712-605-153التركيز النهائي 5-10 & micro ؛ جم / مل
غرفة التصويرibidi80287
مجهر ورقة خفيفةLaVision BioTecUltramicroscope II
برنامج التصويرLaVision BioTecبرنامج المspector
المجهريBitplaneImaris
برنامج التصور

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What We Talk About When We Talk About Fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  2. Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 298 (6), E1244-E1253 (2010).
  3. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  4. Bartness, T. J., Liu, Y., Shrestha, Y. B., Ryu, V. Neural innervation of white adipose tissue and the control of lipolysis. Frontiers in Neuroendocrinology. 35 (4), 473-493 (2014).
  5. Morrison, S. F., Madden, C. J., Tupone, D. Central Neural Regulation of Brown Adipose Tissue Thermogenesis and Energy Expenditure. Cell Metabolism. 19 (5), 741-756 (2014).
  6. Xue, Y., et al. Hypoxia-Independent Angiogenesis in Adipose Tissues during Cold Acclimation. Cell Metabolism. 9 (1), 99-109 (2009).
  7. Shimizu, I., et al. Vascular rarefaction mediates whitening of brown fat in obesity. The Journal of Clinical Investigation. 124 (5), 2099-2112 (2014).
  8. Abe, H., et al. 3D reconstruction of brain section images for creating axonal projection maps in marmosets. Journal of Neuroscience Methods. 286, 102-113 (2017).
  9. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  10. Renier, N., Wu, Z., Simon, D. J., Yang, J., Ariel, P., Tessier-Lavigne, M. iDISCO: A Simple, Rapid Method to Immunolabel Large Tissue Samples for Volume Imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  11. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  12. Chi, J., et al. Three-Dimensional Adipose Tissue Imaging Reveals Regional Variation in Beige Fat Biogenesis and PRDM16-Dependent Sympathetic Neurite Density. Cell Metabolism. 27 (1), 226-236 (2018).
  13. Khan, T., et al. Metabolic Dysregulation and Adipose Tissue Fibrosis: Role of Collagen VI. Molecular and Cellular Biology. 29 (6), 1575-1591 (2009).
  14. Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence Spectroscopy and Imaging: A Tool for Biomedical Research and Diagnosis. European Journal of Histochemistry EJH. 58 (4), (2014).
  15. Oh, D. Y., Morinaga, H., Talukdar, S., Bae, E. J., Olefsky, J. M. Increased Macrophage Migration Into Adipose Tissue in Obese Mice. Diabetes. 61 (2), 346-354 (2012).
  16. Cinti, S., et al. Adipocyte death defines macrophage localization and function in adipose tissue of obese mice and humans. Journal of Lipid Research. 46 (11), 2347-2355 (2005).
  17. Wang, W., Seale, P. Control of brown and beige fat development. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (11), 691-702 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Adipose TissueTissue ClearingAdipo Clear MethodLight Sheet MicroscopyDelipidation ProcessImmunostaining ProcedureAgarose EmbeddingRefractive Index MatchingThree Dimensional ImagingAdipocyte Progenitors

Related Articles