يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الدهنية مولده لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمرض

11.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

أكتوبر 25, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ووصف هو إعداد جسيمات نانوية الاسمافرون مستضدي واستخدامها في تحفيز ب-خلية التنشيط في المختبر و في فيفو. استجابات جسم متسقة وقوية أدت إلى تطوير نموذج جديد لحساسية الفول السوداني. ويمكن تمديد البروتوكول من أجل توليد الدهنية مستضدي المستضدات المختلفة ونماذج التحصين.

الملخص

توفير استجابات جسم حرجة حصانة الحماية لمجموعة واسعة من العوامل الممرضة. لا يزال هناك مصلحة كبيرة في توليد أجسام مضادة قوية للتلقيح، فضلا عن فهم كيف الممرضة جسم تطوير الاستجابات في الحساسية وأمراض المناعة الذاتية. توليد استجابات قوية محددة مستضد الضد ليس دائماً تافهة. في نماذج الماوس، فإنه غالباً ما يتطلب جولات متعددة من التحصينات مع adjuvant الذي يؤدي إلى قدر كبير من التباين في مستويات الأجسام المضادة المستحث. مثال ذلك في نماذج الماوس من الحساسية الفول السوداني حيث سيكون من المفيد أكثر نماذج قوية واستنساخه أن تقليل إعداد الماوس واستخدام adjuvant. قدم هنا نموذج ماوس استنساخه بدرجة عالية من الحساسية المفرطة الحساسية الفول السوداني. هذا النموذج الجديد يعتمد على عاملين أساسيين: سبلينوسيتيس (1) على حدة مستضد أدوبتيفيلي نقل من ماوس توعية الفول السوداني إلى ماوس المتلقي ساذج، تطبيع عدد الذاكرة محددة مستضد خلايا ب وتي عبر عدد كبير من الفئران؛ ويتم بعد ذلك عزز الفئران المستفيدة (2) مع إيمونوجين متعددي قوية في شكل جسيمات نانوية الاسمافرون عرض حساسية الفول السوداني الرئيسية (ح ارا 2). والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو في إمكانية تكرار نتائج، مما يقلل عدد الحيوانات المستخدمة في كل دراسة، مع التقليل من عدد الحيوانات تلقي حقنات متعددة من adjuvant في نهاية المطاف. وتوفر الجمعية وحدات من هذه الدهنية مكسبه التكيف سهلة نسبيا لنماذج أخرى الحساسية أو المناعة الذاتية التي تنطوي على الأجسام المسببة للأمراض.

المقدمة

الحساسية الغذائية يؤثر على نسبة 8% أطفال في الولايات المتحدة، وقد زاد في الانتشار على مدى العقد1. يؤثر على 1 في المائة أطفال الحساسية للفول السوداني وليس المتضخمة عادة2. على الرغم من أن عدة تجارب سريرية واعدة تجري حاليا لعلاج الحساسية للأغذية، بما في ذلك العلاج المناعي عن طريق الفم (OIT) والعلاج المناعي تحت اللسان (الشق) ابيكوتانيوس المناعي (EPIT)، لا يوجد حاليا لا استراتيجيات العلاج التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير الفلورايد الأفراد حساسية الفول السوداني3،4،5،6،،م....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأسلوب العام من اقتران البروتين للدهن وإدماج في الدهنية يستند إلى حد كبير سابق عمل15. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه بجامعة كارولاينا الشمالية في "تشابل هيل رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). جميع الفئران المستخدمة في نموذج حساسية الفول السوداني هي بالب/cJ الإناث التي تم شراؤها من 3 أسابيع من العمر. جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (ACUC) قد وافق التجارب التي تنطوي على استخدام الماوس الطحال لتحليل السابقين فيفو من الفئران C57Bl/6 من 6 أسابيع على الأقل من العمر.

1-تصريف مستضد بروتين إلى دهن سي

  1. إضافة الجيل الثالث 3g حبات جل ديكستران cross-linked مع و....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن إثبات تصريف بروتين الاهتمام مع DSPE-PEG(2000) التي تعمل تقليل تظهر زيادة في الوزن الجزيئي بالمقارنة مع البروتين أونكونجوجاتيد. يظهر الشكل 1A هلام ممثل للماوس المضادة IgM F(ab) يفتت الاقتران على شماعة-دسب، مما يدل باندشيفت 2 – 3 كاتشين للبروتين التشويه والتحريف. لاحظ ظهور ما يقرب من 50 في المائة البروتين إلى التعديل، الذي من المتوقع أن تحقق ستويتشيوميتري 1:1 في جزء على القوات المسلحة البوروندية التي يتم هيتيروديمير من السلسلة الثقيلة والخفيفة. ويبين

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأساليب المذكورة هنا هي بروتوكول عام لتصريف البروتين إلى دهن الذي يتيح عرض البروتين على جسيمات نانوية الاسمافرون. للبروتينات فرعية متعددة كبير جداً، وقد يكون هذا البروتوكول محدودة الأداة المساعدة. وسيكون الأسلوب المثالي الأخذ بالعلامة الخاصة بالموقع التي تمكن استراتيجية ربط بيورثوجونال كيميائية لاستخدامها. إذا كان التعبير عن البروتين ريكومبينانتلي، هذا يمكن أن يكون ممكناً استخدام الاستراتيجيات الخاصة بالموقع المتاحة17، وطائفة واسعة من المجموعات الوظيفية في نهاية المادة الدهنية سي متوفرة تجارياً. .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث المنح المقدمة من وزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0302 و W81XWH-16-1-0303).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نموذج 2110 جامع الكسرBioRad7318122
كوليسترولسيجماC8667سيجما الصف 99٪
SPDPثيرمو فيشر العلمي21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18: 0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
الطاردأفانتي610000حقنة 1 مل مع حامل / كتلة تسخين
مرشحات 0.1 & مفلاتر 610005
0.8 ومايكرو ؛ مرشح mAvanti 610009
10 مم يدعممن Avanti
SigmaZ100633 سدادات
دورانThermo Fisher ScientificP-301398
أنابيبثيرمو فيشر ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 BeadsGE LifeSciences 17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
مصل عجل الجنينالحرارة ثيرمو فيشر العلمي10082147
HEPES (1 م)ثيرمو فيشر 15630080
EGTASigmaE3889
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر ساینتفيك15140122
1x تحلل كرات الدم الحمراء عازلةثيرمو فيشر Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
MgCl 2< / sub>SigmaM8266
CaCl 2< / sub>SigmaC4901
Fab المضاد للفأر IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F (ab') 2< / sub> مكافحة الفأر IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
دقيق الفول السودانيشركة الفول السوداني الذهبي52127112٪ دهون خفيفة تحميص ، 50٪ بروتين
إبر تغذيةCadence Science792022 جم × 1.5 بوصة ، 1.25 مم -
حرارة Microprobeمستقيم PhysitempBAT-12
مسبار المستقيم للفئرانPhysitempRet-3
Cholera xin ، من Vibrio cholera< / em>List Biological Laboratories، Inc.100BAzide free
BCA Protein Assay KitPierce23225
Carba BicarbonateSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96 well Immulon 4HBX لوحةThermo Scientific3855
منقى قابل للذوبان Ara h 2N / AN / Aمنقى كما في: Sen ، et al.< / em > ، 2002 ، مجلة علم المناعة
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE IgE المضادةل DNP BYA60251
الأغنام المضادة للفأر IgEموقع الربطPC284
حمار بيوتينيل مضاد للأغنام IgGJNS065003 كيميائي دقيق
بروتين NeutrAvidin ، HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 المضاد ل DNPMADNP105كيميائي دقيق
HRP الماعز المضاد للفأر IgG1Southern Biotech1070-05
1 مل محاقن الأنسولينBD329412U-100 الأنسولين ، 0.40 مم (27 جم) × 16.0 مم (5/8 بوصة)
Superfrost المجهر الشرائحفيشر Scientific12-550-1425 مم × 75 مم × 1.0 مم
ACK Lysing Buffergibco من Life TechnologiesA10492-01100 مل
RPMI 1640 متوسطحراري فيشر Scientific11875093500 مل
مصفاة خليةCorning35235070 & mu ؛ م نايلون ، أبيض ، معقم ، معبأ بشكل فردي
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein GelInvitrogenNP0322BOX10 المواد الهلامية NuPAGE
LDS buffer ، 4xInvitrogenNP0008250 مل
SeeBlue Plus2 معيار ملطخمسبقا InvitrogenLC5925500 & micro ؛ L
NuPAGE MES / SDS عازلة للتشغيل ، 20xInvitrogenNP0002500 مل
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 مل
أفانتي قارورة زجاجية مستديرة سفلية 6100014 المعطل العلمي ميزان Buffer كيميائي دقيق

المراجع

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الجسيمات النانوية الليبوزوميةمسبب الحساسية Ara h 2نموذج حساسية الفول السودانيالنقل التبنيعزل الخلايا الطحاليةقياس التدفق الخلويمقايسة تدفق الكالسيومالكشف بواسطة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)بثق الليبوزوم