يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الدهنية مولده لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمرض

11.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

أكتوبر 25, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ووصف هو إعداد جسيمات نانوية الاسمافرون مستضدي واستخدامها في تحفيز ب-خلية التنشيط في المختبر و في فيفو. استجابات جسم متسقة وقوية أدت إلى تطوير نموذج جديد لحساسية الفول السوداني. ويمكن تمديد البروتوكول من أجل توليد الدهنية مستضدي المستضدات المختلفة ونماذج التحصين.

الملخص

توفير استجابات جسم حرجة حصانة الحماية لمجموعة واسعة من العوامل الممرضة. لا يزال هناك مصلحة كبيرة في توليد أجسام مضادة قوية للتلقيح، فضلا عن فهم كيف الممرضة جسم تطوير الاستجابات في الحساسية وأمراض المناعة الذاتية. توليد استجابات قوية محددة مستضد الضد ليس دائماً تافهة. في نماذج الماوس، فإنه غالباً ما يتطلب جولات متعددة من التحصينات مع adjuvant الذي يؤدي إلى قدر كبير من التباين في مستويات الأجسام المضادة المستحث. مثال ذلك في نماذج الماوس من الحساسية الفول السوداني حيث سيكون من المفيد أكثر نماذج قوية واستنساخه أن تقليل إعداد الماوس واستخدام adjuvant. قدم هنا نموذج ماوس استنساخه بدرجة عالية من الحساسية المفرطة الحساسية الفول السوداني. هذا النموذج الجديد يعتمد على عاملين أساسيين: سبلينوسيتيس (1) على حدة مستضد أدوبتيفيلي نقل من ماوس توعية الفول السوداني إلى ماوس المتلقي ساذج، تطبيع عدد الذاكرة محددة مستضد خلايا ب وتي عبر عدد كبير من الفئران؛ ويتم بعد ذلك عزز الفئران المستفيدة (2) مع إيمونوجين متعددي قوية في شكل جسيمات نانوية الاسمافرون عرض حساسية الفول السوداني الرئيسية (ح ارا 2). والميزة الرئيسية لهذا النموذج هو في إمكانية تكرار نتائج، مما يقلل عدد الحيوانات المستخدمة في كل دراسة، مع التقليل من عدد الحيوانات تلقي حقنات متعددة من adjuvant في نهاية المطاف. وتوفر الجمعية وحدات من هذه الدهنية مكسبه التكيف سهلة نسبيا لنماذج أخرى الحساسية أو المناعة الذاتية التي تنطوي على الأجسام المسببة للأمراض.

المقدمة

الحساسية الغذائية يؤثر على نسبة 8% أطفال في الولايات المتحدة، وقد زاد في الانتشار على مدى العقد1. يؤثر على 1 في المائة أطفال الحساسية للفول السوداني وليس المتضخمة عادة2. على الرغم من أن عدة تجارب سريرية واعدة تجري حاليا لعلاج الحساسية للأغذية، بما في ذلك العلاج المناعي عن طريق الفم (OIT) والعلاج المناعي تحت اللسان (الشق) ابيكوتانيوس المناعي (EPIT)، لا يوجد حاليا لا استراتيجيات العلاج التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير الفلورايد الأفراد حساسية الفول السوداني3،4،5،6،،من78. ولذلك، يجب أن دقة تجنب حساسية الأفراد حساسية لتجنب الحساسية المفرطة. تبقى العديد من الأسئلة فيما يتعلق بطرق التوعية والكامنة وراء آليات لتنمية الحساسية الغذائية.

نماذج الفأرة أداة قيمة لدراسة آليات الحساسية، فضلا عن تطوير توليروجينيك جديدة والحساسية العلاجات9،10،،من1112. وهذا صحيح بصفة خاصة نظراً لحساسية الفول السوداني الرئيسية (ارا ح 2؛ Ah2) في البشر هو أيضا وصف الحساسية الغالبة في عدة الماوس نماذج13،14. في حين لا تقدر بثمن في دراسة آليات التوعية والتسامح نماذج الماوس من حساسية الفول السوداني، هو عيب أنهم يمكن أن يكون متغير وتتطلب استخدام المواد المساعدة. إيمونوجينس أقوى هو السبيل الوحيد للحد من تقلب الجوهرية لهذه النماذج. حيث يتم تنشيط الخلايا البائية بشدة من متعددي مولدات المضادات، مولده الدهنية عرض الحساسية خيار جيد بسبب قدرتها لتنشيط الخلايا البائية يحتمل أن تكون من خلال مستقبلات الخلية ب (المركز) بينما أيضا وجود ملك لكفاءة فتيلة حجرة تي خلية عن طريق يجري تناولها غير تحديداً بعرض مستضد الخلايا.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصل للتصريف المستضدات البروتين إلى جسيمات نانوية الاسمافرون استخدام استراتيجية سهلة ووحدات. استخدام مستضد مركب، ويفتت المضادة IgM القوات المسلحة البوروندية، نبدي قوية كيف يمكن أن تكون هذه الدهنية مولده في تحفيز ب-خلية التنشيط. واستخدمت الدهنية مستضدي عرض مستضد Ah2 تطوير نموذج ماوس جديدة الممنوحة للحساسية. في هذا النموذج، يتم نقل سبلينوسيتيس من التحقق من الفئران حساسية الفول السوداني، التي تحتوي على ذاكرة خاصة بالفول السوداني ب وخلايا تي، في الفئران كونجينيك ساذج. هي استجابات جسم الذاكرة الناجم عن حقن الدهنية مترافق مع Ah2 في الفئران المستفيدة، من أجل حمل الأجسام المضادة ضد Ah2. تليها دفعة واحدة فقط مع Ah2 القابلة للذوبان، الأجسام المضادة Ah2 محددة تؤدي إلى استجابة قوية تحسسي عند وتحدي هذه الفئران في وقت لاحق مع Ah2. كما الفئران تمر الارتكاس التحسسي الاستجابة بطريقة موحدة إلى حد كبير ولم نتلق adjuvant، هذا النهج نموذج مرغوب فيه حساسية الفول السوداني والنتائج تشير إلى أن التقرير قد يكون أداة في نماذج أخرى الماوس مدفوعا بمولدات المضادات التي تستهدف المواد المسببة للحساسية، وربما أوتوانتيجينس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الأسلوب العام من اقتران البروتين للدهن وإدماج في الدهنية يستند إلى حد كبير سابق عمل15. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الواردة أدناه بجامعة كارولاينا الشمالية في "تشابل هيل رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك). جميع الفئران المستخدمة في نموذج حساسية الفول السوداني هي بالب/cJ الإناث التي تم شراؤها من 3 أسابيع من العمر. جامعة ألبرتا رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (ACUC) قد وافق التجارب التي تنطوي على استخدام الماوس الطحال لتحليل السابقين فيفو من الفئران C57Bl/6 من 6 أسابيع على الأقل من العمر.

1-تصريف مستضد بروتين إلى دهن سي

  1. إضافة الجيل الثالث 3g حبات جل ديكستران cross-linked مع وجود مجموعة من دالتونس 1,500 – 30,000 (دا) قارورة فراغ 250 مل. إضافة 60 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويحرك باستمرار مع شريط إثارة مغناطيسية. ختم قارورة ونعلق على فراغ لبدء فصل الغاز على صفيحة ضجة للحد ني ح 1.
  2. في عمود الفصل لوني لزجاج 1.0 سم × 30 سم مع سداده دوران مغلقة، إضافة برنامج تلفزيوني للعمود لغسل. فتح سداده دوران واستنزاف العمود. بعد الغسيل، إضافة الطين الخرز دي المشككين إلى العمود. باستمرار إضافة الملاط حتى هي معبأة في العمود بارتفاع 24 سم تقريبا حبة.
  3. مرة واحدة العمود 'رأس' حوالي 4 – 5 سم من برنامج تلفزيوني أعلاه الخرز معبأة، تكون الخطوات التالية جاهزة.
    1. إنشاء سيفون تدفق جاذبية بقياس قطعة من أنابيب طويلة بما يكفي للوصول إلى رف 1-2 أقدام فوق رأس العمود وإنشاء حلقة يسقط بالقرب من أسفل العمود وترجع إلى أعلى العمود. إضافة سداده دوران إلى واحدة من نهاية الأنبوب، ترك جانب واحد من فتح الأنابيب. ضع نهاية الأنبوبة مفتوحة في زجاجة 500 مل من برنامج تلفزيوني ووضع على الرف بأعلى العمود.
    2. نهاية بسداده دوران وإرفاق حقنه 10 مل. فتح صمام سداده الدوران على خط الأنابيب ورسم برنامج تلفزيوني من خلال الأنبوب. مجرد برنامج تلفزيوني وصل إلى ثلاثة أرباع الطريق من خلال الأنبوب، بسرعة إزالة المحاقن وإضافة سداده دوران إلى أعلى العمود — يجب أن يشغل السائل على العمود.
      ملاحظة: يجب أن يكون مقدار 'رأس' في برنامج تلفزيوني غادر على رأس العمود بين 1 و 3 سم. الحد الأدنى لغسل العمود 3 العمود مجلدات.
  4. تحديد كمية البروتين (الشامات) لترتبط بالدهون استناداً إلى الوزن الجزيئي (ميغاواط).
    ملاحظة: الجزء Fab الماعز بالماوس المضادة IgM (نفسها مفتش) يستخدم هنا مستضد بديل عالمي لتنشيط الخلايا البائية [بولكلونل]. تبعاً لذلك، بلغة القوات المسلحة البوروندية من الماعز مفتش ميغاواط من حوالي 48 كيلودالتون (كاتشين) وهو متاح تجارياً بكمية إجمالية 1.3 ملغ. وبالتالي، من كمية البروتين ربط 27.1 µmol.
  5. تحديد معامل الانقراض من بروتين الفائدة. إذا كان غير معروف، قياس امتصاص البروتين في 280 نانومتر باستخدام جهاز المطياف الضوئي والفجوة قيمة280 عدد من جزيئات المحسوبة في الخطوة 1، 4.
    ملاحظة: انقراض co كفاءة من القوات المسلحة البوروندية ماعز مفتش في 280 نانومتر هو م 64,600-1.
  6. لضمان أن تتبع المبالغ التي تحتوي على أمين تتم إزالة المخزن المؤقت، وتحلية البروتين في العمود التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.1-1.3 وجمع الكسور البروتين إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب (~ 500 ميليلتر كل جزء).
    1. إغلاق صمام دوران سداده متصلة بالجزء العلوي للعمود وإزالة الجزء العلوي من العمود. إذا لم يكن بالفعل فتح، وفتح صمام سداده دوران في الجزء السفلي من العمود والانتظار حتى 'رأس' برنامج تلفزيوني يضرب الجزء العلوي من الخرز.
    2. ببطء إضافة في بروتين الفائدة إلى الأعلى من استخدام زجاج الخرز ماصة باستور، مع الحرص على تقليل الاضطرابات إلى الجزء العلوي من الخرز.
    3. بمجرد 'رأس' حل البروتين وصلت إلى الجزء العلوي من الخرز، إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني بلطف عبر ماصة باستور. كرر ثلاث مرات. إضافة برنامج تلفزيوني لإنشاء رأس من 4 – 5 سم وكرر الخطوة 1.3 لغسل العمود.
      ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة إذا كان من المؤكد أن أي مخزن مؤقت الذي يحتوي على أمين موجود.
  7. تحديد الكسور التي تحتوي على البروتين بقياس القيم A280 وتجمع الكسور التي تعطي حوالي 90% في الانتعاش من البروتين.
    ملاحظة: هذا يخفف عادة البروتين 1.5-2-إضعاف. تحديد تركيز البروتين بعد تجميع. تركيز البروتين في هذه الخطوة، إذا لزم الأمر، استخدام مركزات الطرد المركزي.
  8. إضافة ما يعادل 2.5 المولى كروسلينكير هيتيروبيفونكشونال للبروتين.
    1. أولاً، تزن حوالي 5 ملغ سوكسينيميديل 3-(2-بيريديلديثيو) بروبيونات (سبدب، MW = 314 g/mol) في أنبوب ميكروسينتريفوجي. لتحديد الحجم تذوب في سبدب وأخذ تركيز البروتين المولى واضربها ب 250 x لإيجاد حل 100 x التي ستعطى فائض مولى 2.5 في رد الفعل.
      ملاحظة: على سبيل المثال، إذا كان تركيز البروتين 50 ميكرومتر، من سبدب في 12.5 ملم هناك حاجة إلى حل. ل 5 ملغ سبدب، وهذا يناظر 1.27 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]).
  9. إضافة سبدب لبروتين مصلحة في إضعاف 1: 100. ضع رد فعل على شاكر التذبذب في درجة حرارة الغرفة (RT) لحوالي 1 ح.
  10. لإزالة سبدب الزائدة وحماية bond(s) ثنائي كبريتيد الذاتية، في البروتين في فترة خطوة التخفيض اللاحقة، وحجته وتغسل العمود التي تم إنشاؤها في الخطوات 1.1-1.3 في 100 ملم خلات الصوديوم (نواك) على درجة الحموضة 5.5 أو إنشاء عمود مطابق للاستخدام فقط في هذا المخزن المؤقت.
  11. بعد حضانة ح 1 مع سبدب، تحلية البروتين في العمود اكويليبراتيد في 100 مم ناواك. القيام بهذه الخطوة بطريقة مماثلة كخطوة 1.6 ما عدا استخدام 100 ملم نواك (pH 5.5) كما الوينت. جمع الكسور وتحديد A280، وتجمع الكسور الأعلى. أغسل العمود في برنامج تلفزيوني.
  12. تعد حلاً من 2.5 م من DTT (MW = 154 غ/مول) في ازدواجية المقطر المياه (ddH2س). إضافة 25 مم DTT للكسور المجمعة من البروتين لمدة 5-10 دقائق.
  13. قياس أ280 من البروتين، وهذه القسمة على معامل الانقراض. كما أن تحديد A343. حساب نسبة الربط استناداً إلى مولاريتي من البروتين (280)، ورابط (343).
    ملاحظة: إيقاف السيارات A340-المعايرة إذا استخدام جهاز المطياف الضوئي نانودروب. يمثل قياس343 بامتصاص الفريق 2-ثيوني بيريدين (معامل الانقراض = 7550 م-1) التي تتم إزالة من كروسلينكير سبدب بالقيمة. نسبة مولى لرابط: نسبة البروتين من 1.2 – 1.5 عموما يتحقق عند القيام برد فعل مع فائض مولى 2.5 من الشعبة في طائفة واسعة من البروتينات.
  14. تشغيل الكسور المجمعة عبر العمود غسلها في برنامج تلفزيوني كما هو موضح أعلاه. جمع الكسور وتحديد A280، وتجمع الكسور الأعلى. تحديد تركيز البروتين التي A280 بعد تجميع الكسور.
  15. إعداد دسب-شماعة (2000)-ماليميدي (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000)--ماليميدي. وهذا سوف تضاف إلى البروتين بنسبة 10:1 مولى. إعداد مخزون 100 x دسب-شماعة (2000)-ماليميدي لتحقيق التركيز المطلوب.
    1. على سبيل المثال، إذا كان تركيز البروتين 10 ميكرون بعد الخطوة 1، 14، إعداد مخزون من دسب-شماعة (2000)--ماليميدي في 10 ملم. تزن بعناية على شماعة دسبي (2000)-ماليميدي (MW = 3000 g/mol) وإضافة كمية مناسبة من [دمس]. قد تحصل على جولات متعددة للطيف فورتيكسينج وسونيكاتينج فحلت تماما.
  16. تحديد الحجم الإجمالي للكسور من الخطوة 1، 14 وتحويل الحل بعناية إلى صغيرة (10-25 مل) جولة أسفل قارورة (المصرف). إضافة المقدار المناسب من 100 × دسب-شماعة (2000)-ماليميدي للبروتين لتحقيق علامة x 1، إذ المولى التركيز الزائد، والنهائي. بلطف دوامة الحل للتأكد من أن [دمس] الكامل موزعة.
  17. تشغيل رد الفعل بين عشية وضحاها تحت النيتروجين في المصرف مختومة. استخدم الغشاء المطاطي وفي غطاء دخان.
    1. إزالة الغلاف الجوي عن طريق ثقب في الحاجز بإبرة ز 20 المرفقة بحقنه 3 مل في نهاية الأنابيب التي تعلق على فراغ، ودورة على فراغ ل s 3 – 5.
    2. استبدال الغلاف الجوي مع النيتروجين. ملء بالون المرفقة بحقنه 3 مل خفض إلى النصف مع النيتروجين وإرفاق إبرة 20 غ. ثقب الحاجز لملء الغلاف الجوي داخل قارورة أسفل جولة مع النيتروجين. كرر إزالة الغلاف الجوي واستبدالها بالنيتروجين مرة أخرى وترك البالون النيتروجين تعلق بين عشية وضحاها.
  18. إعداد عمود حبة جل ديكستران cross-linked منفصلة مع وجود مجموعة من 4,000 – 150,000 دا في عمود الفصل لوني لزجاج 1.0 سم x 50 سم (حسب الخطوات 1.1-1.3).
  19. في اليوم التالي، إزالة البروتين من قارورة أسفل جولة أعد الخطوة 1.17 وتشغيل (اتبع الطريقة المستخدمة في الخطوة 1، 6) على العمود حبة جل ديكستران cross-linked (من الخطوة 1، 18).
    ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي تحميل على العمود لا يزيد عن 2 مل. إذا تم استخدام فعل أكبر، انقسم إلى اثنين وتشغيل في أعمدة منفصلة أو تشغيل على عمود قطر أكبر.
    1. جمع الكسور وتحديد ألف280، تجمع الكسور أعلى، وتحديد تركيز البروتين. لن يؤثر وجود الدهن القياسات.
  20. تخزين الكسور المجمعة النهائية المرتبطة بالدهن البروتين في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

2. إعداد الحويصلية

  1. وزن خارجاً الدهون: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000 ميجاوات = 2805.5 g/mol؛ ميغاواط (3b-هيدروكسي-5-تشوليستيني، 5-تشوليستين-3b-الرتب الأخرى)، الكولسترول = 386.7 g/mol؛ ودسبك (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) ميغاواط = 790.1 ز/mol. إنشاء حل 5 ملغ/مل دسبك والحل 4 مغ/مل من نسبة الكولسترول في الدم، والحل 2 مغ/مل من DSPE-PEG(2000) في كلوروفورم.
  2. التأكد من أن نسبة الدهون في الدهنية المولى: 57% دسبك، 38% نسبة الكولسترول في الدم، و 5% DSPE-PEG(2000)، كما هو ممثل في الجدول 1.
    ملاحظة: من المهم للتحكم في مقدار مستضد على الحويصلية، التي تتراوح عادة بين 0.01-0.1%. ويستخدم في الجدول 1، 0.1% من الماعز الماوس المضادة IgM القوات المسلحة البوروندية يفتت مرتبطة بدهن سي. من المهم أن تأخذ في الاعتبار المولى إذ الزائدة من شماعة دسبي (2000)-ماليميدي الذي تمت إضافته إلى البروتين في الخطوة 1، 15، ضمان عدم تجاوز المبلغ الإجمالي للدهون سي 5%.
  3. النظر في المبالغ النهائية في الدهون (µmol) عند إنشاء الدهون لقذف. انظر الجدول 1 للحصول على مثال لحساب تركيزات الدهون المولى لخلق الدهنية بتركيز دهن مجموع ميكرومتر 1.25.
  4. بمجرد تم حساب المبلغ الصحيح لكل الدهن تضاف معا، الجمع جميع أنبوب اختبار زجاج البورسليكات 12 مل.
  5. ينفخون في كلوروفورم بعناية.
    1. استخدام الأنبوب وحقنه 3 مل مع الإبرة، أعدت في خطوة 1.17.1، لتفجير بعناية كلوروفورم في الأنبوب مع النيتروجين. بلطف ضربة تيار نيتروجين في الحل أثناء تدوير الأنبوبة باليد الأخرى. احرص على تقليل الرش أو التسبب في السائل لتشغيل الطريق حتى الجانب من الأنبوب كما أنه قد يكون أكثر صعوبة للحصول على هذا في الحل في الخطوة التالية.
  6. إضافة 100 ميليلتر من [دمس] لكل أنبوبة وليوفيليزي هذا الحل بين عشية وضحاها. يغطي الجزء العلوي من الأنبوب مع مسح مختبرات غير ثابتة، أماناً مع شريط المطاطي، وتجميد-80 درجة مئوية.

3-الحويصلية البثق

  1. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على بروتين مرتبطة بالمادة الدهنية إلى 12 مل الأنبوبة التي تحتوي على الدهون. Sonicate الحل لما يقرب من 30 ثانية إلى 1 دقيقة في حمام مائي sonication. الراحة لمدة 5 دقائق أو أكثر بين كل جولة، وكرر 3 – 4 مرات.
  2. إعداد الطارد حسب توجيهات الشركة المصنعة.
    1. إضافة يدعم مرشح لدعم الغشاء الداخلي، وضع بضع قطرات (10 ميليلتر في كل) من برنامج تلفزيوني على الفيلم البارافين. استخدام الملقط، الاستيلاء على حافة لدعم مرشح وتراجع ذلك في إسقاط 10 ميليلتر.
    2. وضع التصفية داخل يا الدائري. القيام بهذا لكلا الجانبين. استخدام الملقط، الاستيلاء على عامل تصفية 0.8 ميكرومتر على الحافة وتراجع في إسقاط 10 ميليلتر ومعطف خارج الدائري مع برنامج تلفزيوني. وضع التصفية 0.8 ميكرومتر بلطف على الدائري حيث لا عامل التصفية ليست أكثر من تعليق دعم الغشاء الداخلي.
  3. وضع كتلة تدفئة الطارد على صفيحة ساخنة للحرارة مسبقاً في الطارد. التبديل صفيحة منخفضة وتسمح الطارد تدفئة كتلة للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. لتجنب المشاكل المحتملة مع تجميع البروتين، عدم تسخين كتلة الماضية 37 درجة مئوية.
  4. تحميل عينة سونيكاتيد إلى واحدة من المحاقن extruding وضعها في الطارد. ضع المحاقن الطارد في الطرف الآخر من الطارد. تأكد من تعيين المكبس المحاقن الفارغة إلى الصفر. سيتم ملء المحاقن الفارغة كما هو مقذوف الدهن عبر غشاء البولي 0.8 ميكرومتر. في محاولة لتجنب تمرير فقاعات ذهابا وإيابا عبر الغشاء.
  5. المكان الطارد مجمع بشكل كامل إلى كتلة التدفئة. ادفع برفق المكبس لحقنه مليئة بالدهون للمحاقن الفارغة. اعتماداً على تركيز المادة الدهنية، وهذا سيكون من الصعب على الدفع من خلال. كرر 20 x.
  6. إزالة الطارد مجمع بشكل كامل من كتلة التدفئة. ببطء إزالة المحاقن شغلها من الطارد، يجب التأكد من جمع أي الدهون التي قد تسرب عند إزالة. ضع الدهنية في قنينة نظيفة. كرر الخطوات من 3، 3، 4-6 استخدام البولي 0.2 ميكرون و 0.1 ميكرومتر الأغشية.
  7. إنشاء عمود حبة cross-linked [اغروس]2 0.7 x 50 سم مع مجموعة الفصل 0.7-10 ميجا دالتونس (MDa) اكويليبراتيد في برنامج تلفزيوني. إضافة الدهنية وتشغيل كما هو الحال في الخطوة 1، 6. وانخفضت الكسور التي تحتوي على الدهنية سوف انتقال الضوء في حدود 250 – 400 نانومتر.
  8. تخزين الدهنية عند 4 درجة مئوية ولا تجمده.

4-الكالسيوم التمويه لمراقبة تفعيل ب-الخلايا الدهنية مستضدي

  1. Euthanize الفئران بثاني أكسيد الكربون (CO2) أو جرعة isoflurane، وفقا لإجراءات التشغيل الموحدة المؤسسية. تأكيد القتل الرحيم للفئران بخلع عنق الرحم.
  2. تعقيم الأدوات الجراحية والذبيحة الفئران باستخدام الإيثانول 70%. استخدام 10 سم طويلة، نصيحة 0.8 ملم، منحنى ملقط القزحية لفصل الجلد الذي يغطي تجويف الصدر من القفص الصدري. استخدام 10 سم منذ فترة طويلة، على التوالي تشريح مقص جعل شق القاصي مع شق ثنائية.
  3. استخدام الملقط آيريس المنحنية ومقص تشريح لاستخراج الطحال من تجويف البطن. إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة الطحال وثم وضعه في أنبوب مخروطي البوليستيرين 15 مل مليئة RPMI1640 المتوسطة التي تحتوي على 1% العجل الجنين المصل (FCS) والبنسلين والستربتوميسين.
  4. نقل الطحال ووسائط الإعلام على مصفاة خلية 40 ميكرومتر تركيبها على أنبوب مخروطي 50 مل. برفق باستخدام المطاط نهاية المكبس حقنه 3 مل، سحق الطحال. أغسل مصفاة خلية 40 ميكرومتر مع وسائل الإعلام. كرر هذه العملية حتى يتم ترك فقط الأنسجة الدهنية في مصفاة ميكرومتر 40 على الخلية. شطف غربال مع 3-5 مل من وسائل الإعلام لزيادة استرداد الخلية.
  5. الطرد المركزي هوموجيناتي خلية في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وبعد الطرد المركزي، تجاهل المادة طافية وإضافة 10 مل من 1 x ربك تحلل العازلة لبيليه. "الماصة؛" صعودا وهبوطاً، وتترك لمدة 2 – 3 دقيقة في RT، وثم الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت
  6. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند سبلينوسيتيس خلايا الدم الحمراء المنضب في 10 مل من وسائل الإعلام. تحديد أرقام مجموع الخلية باستخدام هيموسيتوميتير أو خلية أخرى عد الجهاز. بيليه الخلايا باستخدام الطرد المركزي كما هو موضح أعلاه.
    ملاحظة: هو تركيز النهائية المثالية اللازمة لتحميل الهندية-1 سبلينوسيتيس 10 – 20 × 106 خلايا/مل، ولكن يمكن استخدام تركيز أقل من الخلايا.
  7. ريسوسبيند سبلينوسيتيس في 15 × 106 خلايا/مل في تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت (المتوسطة RPMI1640 التي تحتوي على 1% سفح المنحدر القاري، 10 ملم 4-(2-hydroxyethyl)-1-بيبيرازينيثانيسولفونيك حامض (هيبيس)، كلوريد المغنيسيوم 1 مم (MgCl2)، (جليكول-مكررا 1 مم Β-أمينو إيثايل البروم ثنائي الفينيل)-ن، ن، ن '، ن'--تيتراسيتيك الحمضية (اجتا)، و 5% البنسلين-ستربتوميسين). إضافة في 1.5 ميكرومتر الهندية-1 من حل أسهم [دمس] 1 مم، عكس الأنبوب عدة مرات المزيج. حماية من الضوء، واحتضان خلايا في حمام الماء 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. وبعد تفريخ 30 دقيقة، إضافة في 5 × مقدار تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 7 دقائق في الرايت
  9. النابضة في الخلايا ب، وصمة عار الخلايا مع الماوس المضادة 1: 200 CD5-PE والماوس المضادة 1: 200 B220-PE/Cy7 في 0.5 مل من تحميل المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية مدة 20 دقيقة، محمية من الضوء.
  10. أغسل سبلينوسيتيس في تدفق الكالسيوم تحميل المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز 7 دقيقة في الخلايا "الرايت ريسوسبيند" في 10 – 20 × 106 خلايا/مل في تدفق الكالسيوم تشغيل المخزن المؤقت (هانك لموازنة محلول الملح (حبس) يحتوي على السفح 1%، 1 MgCl2 و 1 ملم كلوريد (كاكل2) من الكالسيوم). تخزين على الجليد، ومحمية من الضوء حتى جاهز لتشغيل على تدفق سيتوميتير.
  11. إعداد التدفق الخلوي مع ضوابط وصمة عار أونستينيد وواحد للتعويض.
    1. تشغيل الخلايا الملون لإعداد البوابات على النحو المناسب (انظر الشكل 2 أ). الإعداد الهندية-1 (البنفسجي) مقابل الأرض الهندية-1 (أزرق)، وضبط الفولتية في القنوات الهندية-1 وضع الخلايا تلطيخ في منحدر من 45 – 60 ° إلى أقصى حد الإشارة: نسبة الضوضاء من البنفسجي الهندية-1: تغيير الأزرق في نسبة بعد تنشيط الخلية ب.
      ملاحظة: تأكد من أن الفولتية ليست مرتفعة للغاية، حيث أن نسبة كبيرة من الخلايا (> 5%) هي ضد الأعلى من الأرض.
    2. إنشاء بوابة قطري بتغليف الجزء الأيسر العلوي (فيوليت+الأزرق–) من الأرض، بدون تحفيز < 10% الخلايا في البوابة، التي ينبغي أن تزيد من الناحية المثالية إلى > 75% بعد التحفيز.
  12. إضافة 0.5 مل خلايا إلى 5 مل توج الجولة أسفل الأنبوبة البوليستيرين (خلية تنشيط fluorescence فرز أنابيب (نظام مراقبة الأصول الميدانية)) والخلايا إلى 37 درجة مئوية لمدة 3-5 دقائق في حمام مائي دافئ. ضع الأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية في الدائرة 37 درجة مئوية واتيرجاكيتيد متصل بحمام مائي إعادة تعميم.
    1. تشغيل الأنبوب واتيرجاكيت على سيتوميتير تدفق والشروع في اقتناء، دون تخزين البيانات، وفي حوالي 5,000 – 10,000 الأحداث/s. متى استقرت الخلايا (15 – 30 ثانية)، بدء البيانات اقتناء وجمع البيانات لمالا يقل عن 10 s لوضع الخلفية.
    2. عند علامة s 10، بسرعة إزالة الأنبوب من cytometer تدفق وإضافة التحفيز (5-50 ملم الدهنية مولده في 2 – 20 مل)، ودوامه النبض، والعودة أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية على cytometer التدفق. الحفاظ على الحصول على البيانات والتخزين من خلال هذا الوقت، وجمع البيانات لمدة 3 – 5 دقائق.
  13. تحليل البيانات في برامج التحليل المناسب تحت مهام حركية.

5-إعداد استخراج الفول السوداني

  1. استخراج بروتينات الفول السوداني بخلط طحين الفول السوداني بنسبة 1:5 (wt:vol) من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 1 م كلوريد الصوديوم (NaCl). مزيج الحل على لوحة إثارة المغناطيسية ح 2 في الرايت مع الاحتفاظ في pH 8.5.
  2. حل أجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية. صب وتصفية-تعقيم المادة طافية تسلسلياً من خلال عامل تصفية 0.4 ميكرومتر تليها فلتر 0.2 ميكرون. تحديد تركيز البروتين بمقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك استخدام ألبومين المصل البقري (BSA) كالمعيار.
  3. تقليل وتؤذي عينة بروتينات الفول السوداني مع ديثيوثريتول 50 ملم (DTT) في المخزن مؤقت الذي يحتوي على الليثيوم دوديسيل كبريتات في الرقم الهيدروجيني 8.4، مما يسمح للنشاط القصوى الفلزي والحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. تشغيل 10 ميكروغرام للتشويه والتحريف بروتين الفول السوداني في تريس مكررا 4 – 12% بريكاستيد بولياكريلاميدي هلام مصممة لإعطاء الفصل الأمثل جل التدرج مع الوزن الجزيئي قبل الملون القياسية.
  5. وصمة عار للهلام مع تريفينيلميثاني ديسولفوناتيد وديستاين مع ddH2تحديد O. تعرف حساسية الفول السوداني الرئيسية ارا ح 1 و 2 و 3 في استخراج الأعمال التحضيرية. ح ارا 1 يظهر في كاتشين 63، ح ارا 2 يجب أن تظهر ك isoforms اثنين في كاتشين 17 و 19، ويظهر ح ارا 3 كاتشين 37 (وحدة فرعية الحمضية).

6-توعية فئران للفول السوداني

  1. ريسوسبيند 1 ملغ الكوليرا السمية في 1 مل من الماء عالي النقاوة. إعداد 200 ميليلتر المخفف استخراج الفول السوداني التي تحتوي على بروتين الفول السوداني 2 مغ والسمية الكوليرا 10 ميكروغرام في برنامج تلفزيوني.
  2. إدارة 200 ميليلتر من استخراج الفول السوداني التي تحتوي على السم (بروتين الفول السوداني 2 ملغ و 10 ميكروغرام الكوليرا السمية) الكوليرا عن طريق تزقيمية الشفوي لكل أسبوع 4 – 5 القديمة بالب/cJ الماوس الإناث. كرر مرة واحدة في أسبوع لمدة ثلاثة أسابيع (أي أيام 0 و 7 و 14).
  3. إدارة 300 ميليلتر المخفف استخراج الفول السوداني (الذي يحتوي على بروتين الفول السوداني 5 ملغ و 10 ميكروغرام الكوليرا السمية) عن طريق الفم تزقيمية مدتها لكل الماوس في الأسبوع الرابع (أي، 21 يوما).

7-التحدي الفئران مع استخراج الفول السوداني

  1. في يوم 28، إعداد استخراج الفول السوداني بتركيز 1 ملغ/مل في برنامج تلفزيوني نهائي. قياس درجة حرارة الجسم الأساس باستخدام مقياس حرارة مستقيمي (حوالي 37.5 – 38.5 درجة مئوية). إدارة 200 ميليلتر (200 مكغ) استخراج الفول السوداني عن طريق الحقن داخل (القائمة).
  2. قياس درجة حرارة الجسم مع الحرارة المستقيمي كل 15 دقيقة ح 1 بعد الحقن. ويشير إلى تراجع في درجة حرارة الجسم الحساسية للفول السوداني.
    ملاحظة: انخفاض درجة حرارة الجسم السمة مميزة لفرط الحساسية في الفئران. وسوف يثبت هذا التحدي أن الفئران حساسية من الفول السوداني. عادة، وضع 90% فئران بالب/cJ التي يخضع لها البروتوكول التوعية الحساسية خلال التحدي التي تتميز بانخفاض درجة حرارة 2-3 درجة مئوية على الأقل.

8-عزل سبلينوسيتيس من حساسية الفئران ونقل التبني

  1. عزل سبلينوسيتيس من السذاجة والفئران حساسية الفول السوداني.
    1. في يوم 30، euthanize ساذجة وتأكدت من الفئران حساسية الفول السوداني بإدارة 3 لتر في الدقيقة من CO2 في غرفة الغاز. تأكيد القتل الرحيم للفئران بواسطة thoracotomy الثنائية. تعقيم الأدوات الجراحية والذبيحة الماوس باستخدام الإيثانول 70%. استخدام الملقط لفصل الجلد الذي يغطي تجويف الصدر من القفص الصدري. استخدام مقص تشريح مستقيم جعل شق ثنائية كسر الأضلاع اليمنى واليسرى.
    2. استخدام الملقط ومقص تشريح لاستخراج الطحال من تجويف البطن. إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة الطحال قبل وضع في الأنبوبة المخروطية البوليستيرين 15 مل، مليئة بمتوسط 10 مل 1640 ربمي.
    3. في غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة، صب الطحال ووسائط الإعلام في البوليسترين 35 مم طبق بيتري. تبقى ساذجة وحساسية سبلينوسيتيس في أطباق بتري منفصلة ووسائل الإعلام خلال عزل الخلية. استخدام الملقط المعقم وتشريح المقص لقطع الطحال إلى ثلاث قطع والعودة إلى طبق بيتري.
    4. استخدام حافة خشنة، متجمد الزجاج مجهر شريحتين، بلطف مجانسة (في ربمي) القطع الطحال حتى تبقى الأنسجة البيضاء بين الشرائح. تغيير الشرائح بين المجموعات.
    5. نقل الخلية هوموجيناتي من صحن بيتري من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر تركيبها على أنبوب مخروطي 50 مل. تمرير أجزاء الطحال المتبقية من خلال المصفاة مع المكبس من حقنه 1 مل. شطف غربال مع 5 مل ربمي إلى أقصى حد خلية الإنعاش. نقل فيلتراتي إلى أنبوب مخروطي البوليستيرين 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي (450 x ز، 10 دقيقة، RT).
    6. نضح المادة طافية وإضافة ريسوسبيند خلية بيليه في المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء 2 مل (0.83% كلوريد الأمونيوم في 10 ملم تريس العازلة، الرقم الهيدروجيني 7.2). خلط واحتضان في RT 2 – 3 دقيقة إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني-2% FBS وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 7 دقائق في الرايت
    7. تغسل الخلايا مرة أخرى مع 12 مل برنامج تلفزيوني-2% FBS تماما إزالة أي بقايا من كلوريد الأمونيوم، والطرد المركزي في 300 x غ 7 دقيقة في الخلية "الرايت تعليق" إعادة بيليه في 2 مل متوسط RPMI 1640. حساب عدد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو محلل الدم التلقائي.
  2. 27 زاي، إبرة 5/8 بوصة في حقنه الأنسولين 1 مل، باستخدام حقن الوريد 15 × 106 حساسية أو السذاجة سبلينوسيتيس استخراج كما هو موضح أعلاه (في 200 ميليلتر) عن طريق الوريد الذيل في الفئران السذاجة (أونسينسيتيزيد).

9-حقن الفئران مع ارا ح 2 الدهنية مستضدي

  1. إعداد Ah2 الدهنية المحتوية على 0.1% Ah2 في الدهن 2.5 ملم. لحساب تركيز البروتين، هو معامل الانقراض Ah2 م 15,000-1. تمييع الدهنية إلى 300 ميكرون في برنامج تلفزيوني العقيمة.
  2. يوم واحد بعد نقل التبني (يوم 31) من حساسية أو السذاجة سبلينوسيتيس، حقن الوريد 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو الدهنية Ah2 مستضدي (300 ميكرون) التي تحتوي على إجمالي 1.38 ميكروغرام من Ah2 عن طريق الوريد ذيل بالب/cJ الفئران التي حصلت سبلينوسيتيس في الخطوة 8.2.

10-دفعة والتحدي المتمثل في الفئران مع ارا ح 2

  1. استخدام أسبوعين بعد الحقن مع Ah2 الدهنية، في يوم 45، انسيت حيوان 4 مم لجمع 50 – 200 ميليلتر من الدم من مفرق اللهاة من الماوس. جمع الدم في أنبوب فاصل مصل دون الهيبارين؛ منفصلة المصل من سينتريفوجينج في س 6,000 ز عن 15 دقيقة استخدام المصل التي جمعت في وقت لاحق إلى قياس محددة مستضد الأجسام المضادة.
  2. اليوم 46، أسبوعين بعد حقن الفئران الدهنية (الخطوة 9.2)، تعزيز الفئران بحقن القائمة من 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو 200 ميكروغرام من Ah2 القابلة للذوبان (تنقية كما هو موضح سابقا16).
  3. اليوم 60، جمع 50-200 ميليلتر من الدم من مفرق اللهاة من الماوس، وتجهيز الدم كما هو موضح سابقا.
  4. في يوم 61، تحدي كل مجموعة من الفئران بحقن القائمة من 200 ميليلتر من 300 ميكروغرام Ah2 القابلة للذوبان. قياس درجة حرارة الجسم مع المسبار المستقيمي كل 15 دقيقة كما هو الحال في المادة 7.

11-تحديد مقدار ح ارا 2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي و IgG1 قبل أليسا

  1. معطف مقايسة الممتز المرتبط بالانزيم 96-جيدا (أليسا)-لوحة متوافق مع 100 ميليلتر يمتلكهما-التثقيف (2، 4-دينيتروفينيل هابتين ألبومين المصل مترافق للبشرية، 20 ميكروغرام/مل) للمنحنى المعياري أو Ah2 (5 ميكروغرام/مل) لجمع عينات المصل في الخطوات 10-1 و 10-3، تضعف في طلاء المخزن المؤقت (50 مم كربونات بيكربونات المخزن المؤقت، pH 9.6) في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها أو 37 درجة مئوية > ح 1.
  2. أغسل ثلاث مرات مع 200 ميليلتر PBS-T (برنامج تلفزيوني مع 0.05% توين-20) وكتلة الآبار مع 200 ميليلتر تي برنامج تلفزيوني يحتوي على 2% جيش صرب البوسنة في 37 درجة مئوية > ح 2.
  3. أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، إضافة 50 ميليلتر فريق الخبراء الحكومي الدولي-مكافحة-التثقيف المعايير (2 – 0.002 ميكروغرام/ملليلتر، أعد من تخفيف المسلسل 1:2) أو عينات المصل الماوس (01:20 إضعاف) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. أليسا IgG1 Ah2 على حدة، لإضافة 100 ميليلتر تنقية معايير IgG1-مكافحة-التثقيف (2 – 0.002 ميكروغرام/ملليلتر، أعد من تخفيف المسلسل 1:2) أو الماوس عينات المصل (تخفيف 1: 500) واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1 في 37 درجة مئوية.
  4. أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، إضافة 100 ميليلتر الأغنام الماوس المضادة فريق الخبراء الحكومي الدولي (0.5 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1. أليسا IgG1 Ah2 على حدة، لإضافة 100 ميليلتر الماعز HRP الماوس المضادة IgG1 (المخفف 1:40,000 في "جيش صرب البوسنة" PBS-تي-2%). احتضان في 37 درجة مئوية ح 1.
  5. أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. لفريق الخبراء الحكومي الدولي الخاصة Ah2 أليسا، إضافة 100 ميليلتر بيوتينيلاتيد-حمار الغنم المضادة مفتش (0.5 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. لإليزا IgG1 Ah2 محددة، قم بالتخطي إلى الخطوة 11.7.
  6. أغسل ثلاث مرات مع ميليلتر 200 برنامج تلفزيوني-ت. أليسا Ah2-خاصة بفريق الخبراء الحكومي الدولي، أضف محايدة مكلفة 100 ميليلتر avidin-الفجل البيروكسيديز (مثلاً، نيوترافيدين-برنامج الصحة الإنجابية، 0.3 ميكروغرام/مل) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  7. إضافة 100 ميليلتر 3, 3 ', 5, 5'--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة، واحتضان 10-15 دقيقة، أو حتى تشغيل عينات اللون الأزرق الداكن، ثم قم بإضافة 100 ميليلتر TMB وقف الحل. قراءة اللوحة في 450 نانومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن إثبات تصريف بروتين الاهتمام مع DSPE-PEG(2000) التي تعمل تقليل تظهر زيادة في الوزن الجزيئي بالمقارنة مع البروتين أونكونجوجاتيد. يظهر الشكل 1A هلام ممثل للماوس المضادة IgM F(ab) يفتت الاقتران على شماعة-دسب، مما يدل باندشيفت 2 – 3 كاتشين للبروتين التشويه والتحريف. لاحظ ظهور ما يقرب من 50 في المائة البروتين إلى التعديل، الذي من المتوقع أن تحقق ستويتشيوميتري 1:1 في جزء على القوات المسلحة البوروندية التي يتم هيتيروديمير من السلسلة الثقيلة والخفيفة. ويبين

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأساليب المذكورة هنا هي بروتوكول عام لتصريف البروتين إلى دهن الذي يتيح عرض البروتين على جسيمات نانوية الاسمافرون. للبروتينات فرعية متعددة كبير جداً، وقد يكون هذا البروتوكول محدودة الأداة المساعدة. وسيكون الأسلوب المثالي الأخذ بالعلامة الخاصة بالموقع التي تمكن استراتيجية ربط بيورثوجونال كيميائية لاستخدامها. إذا كان التعبير عن البروتين ريكومبينانتلي، هذا يمكن أن يكون ممكناً استخدام الاستراتيجيات الخاصة بالموقع المتاحة17، وطائفة واسعة من المجموعات الوظيفية في نهاية المادة الدهنية سي متوفرة تجارياً. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيد هذا البحث المنح المقدمة من وزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0302 و W81XWH-16-1-0303).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نموذج 2110 جامع الكسرBioRad7318122
كوليسترولسيجماC8667سيجما الصف 99٪
SPDPثيرمو فيشر العلمي21857
DSPCAvanti850365
DSPE-PEG 18: 0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
الطاردأفانتي610000حقنة 1 مل مع حامل / كتلة تسخين
مرشحات 0.1 & مفلاتر 610005
0.8 ومايكرو ؛ مرشح mAvanti 610009
10 مم يدعممن Avanti
SigmaZ100633 سدادات
دورانThermo Fisher ScientificP-301398
أنابيبثيرمو فيشر ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Sephadex G50 BeadsGE LifeSciences 17004201
Sephadex G100 BeadsGE Life Sciences17006001
مصل عجل الجنينالحرارة ثيرمو فيشر العلمي10082147
HEPES (1 م)ثيرمو فيشر 15630080
EGTASigmaE3889
البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)ثيرمو فيشر ساینتفيك15140122
1x تحلل كرات الدم الحمراء عازلةثيرمو فيشر Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-Cy7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112بدون الكالسيوم والمغنيسيوم
MgCl 2< / sub>SigmaM8266
CaCl 2< / sub>SigmaC4901
Fab المضاد للفأر IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F (ab') 2< / sub> مكافحة الفأر IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
دقيق الفول السودانيشركة الفول السوداني الذهبي52127112٪ دهون خفيفة تحميص ، 50٪ بروتين
إبر تغذيةCadence Science792022 جم × 1.5 بوصة ، 1.25 مم -
حرارة Microprobeمستقيم PhysitempBAT-12
مسبار المستقيم للفئرانPhysitempRet-3
Cholera xin ، من Vibrio cholera< / em>List Biological Laboratories، Inc.100BAzide free
BCA Protein Assay KitPierce23225
Carba BicarbonateSigmaC3041
TMB Stop SolutionKPL50-85-06
SureBlue TMB Microwell Peroxidase SubstrateKPL5120-0077
96 well Immulon 4HBX لوحةThermo Scientific3855
منقى قابل للذوبان Ara h 2N / AN / Aمنقى كما في: Sen ، et al.< / em > ، 2002 ، مجلة علم المناعة
HSA-DNPSigmaA-6661
Mouse IgE IgE المضادةل DNP BYA60251
الأغنام المضادة للفأر IgEموقع الربطPC284
حمار بيوتينيل مضاد للأغنام IgGJNS065003 كيميائي دقيق
بروتين NeutrAvidin ، HRPThermoFisher Scientific31001
Mouse IgG1 المضاد ل DNPMADNP105كيميائي دقيق
HRP الماعز المضاد للفأر IgG1Southern Biotech1070-05
1 مل محاقن الأنسولينBD329412U-100 الأنسولين ، 0.40 مم (27 جم) × 16.0 مم (5/8 بوصة)
Superfrost المجهر الشرائحفيشر Scientific12-550-1425 مم × 75 مم × 1.0 مم
ACK Lysing Buffergibco من Life TechnologiesA10492-01100 مل
RPMI 1640 متوسطحراري فيشر Scientific11875093500 مل
مصفاة خليةCorning35235070 & mu ؛ م نايلون ، أبيض ، معقم ، معبأ بشكل فردي
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein GelInvitrogenNP0322BOX10 المواد الهلامية NuPAGE
LDS buffer ، 4xInvitrogenNP0008250 مل
SeeBlue Plus2 معيار ملطخمسبقا InvitrogenLC5925500 & micro ؛ L
NuPAGE MES / SDS عازلة للتشغيل ، 20xInvitrogenNP0002500 مل
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 مل
أفانتي قارورة زجاجية مستديرة سفلية 6100014 المعطل العلمي ميزان Buffer كيميائي دقيق

المراجع

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الجسيمات النانوية الليبوزوميةمسبب الحساسية Ara h 2نموذج حساسية الفول السودانيالنقل التبنيعزل الخلايا الطحاليةقياس التدفق الخلويمقايسة تدفق الكالسيومالكشف بواسطة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA)بثق الليبوزوم
الدهنية مولده لتوليد الأجسام المضادة الخاصة بالمرض
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.