Method Article

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

DOI:

10.3791/58321

⸱

November 6th, 2018

 ,  , 
1Graduate Program in Pharmacology and Experimental Therapeutics, University of Cologne, 2Department of Dermatology and Venereology, University Hospital of Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence in Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, 4Department of General Ecology, Institute for Zoology, Biocenter Cologne, University of Cologne

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العقدة ولوحة نوتوتشوردال عابرة يشير المنظمون في وضع الماوس الأجنة التي يمكن تصور استخدام العديد من التقنيات. هنا، نحن تصف بالتفصيل كيفية تنفيذ اثنين من التقنيات لدراسة هيكل و morphogenesis: 1) المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)؛ و 2) جبل كاملة الفلورة (ومف).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الماوس بعد زرع الجنين يخضع لتغيرات رئيسية الشكل بعد بدء جاستروليشن و morphogenesis. تشكيل المنظمون عابر، بعقدة ولوحة نوتوتشوردال، ومن الخلايا التي مرت من خلال الانتصارات البدائية هو السمة مميزة ل morphogenesis. تشكيل هذه المراكز إرسال الإشارات المناسبة أمر ضروري لتطوير خطة الهيئة وتقنيات لتصور لهم ذات أهمية عالية لعلماء الأحياء التنموي الماوس. تكمن العقدة ولوحة نوتوتشوردال على السطح البطني لاجنة الفأر جاسترولاتينج حول يوم الجنينية (ه) 7.5 من التنمية. العقدة هو بنية على شكل كأس الخلايا التي تمتلك مفردة مرهف هدب كل. تعريب سوبسيلولار السليم وتناوب أهداب في الحفرة عقده يحدد عدم التماثل في اليسار واليمين. كما تمتلك الخلايا لوحة نوتوتشوردال أهداب واحد أن كان أقصر من تلك الخلايا العقدة. وتشكل لوحة نوتوتشوردال نوتوتشورد الذي يعمل كمنظم إشارات هامة سوميتوجينيسيس والزخرفة العصبية. نظراً لأن خلايا العقدة ولوحة نوتوتشوردال موجودة عابر على السطح، وتمتلك أهداب، يمكن تصور استخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). من بين التقنيات الأخرى المستخدمة لتصور هذه الهياكل على المستوى الخلوي هو جبل كاملة الفلورة (ومف) باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات التي يتم التعبير عنها عاليا في العقدة ولوحة نوتوتشوردال. في هذا التقرير، تصف نحن لدينا البروتوكولات الأمثل لأداء ومف العقدة ولوحة نوتوتشوردال ووزارة شؤون المرأة في وضع الماوس الأجنة للمساعدة في تقييم منظمة الخلوية في البرية من نوع وشكل الأنسجة والأجنة gastrulation المسخ.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جاستروليشن وحركات morphogenetic المصاحبة حاسمة بالنسبة لتشكيل الجنين الماوس1. التغييرات في الشكل الخلوية والمنظمة خلال morphogenesis إملاء المعلومات الموضعية لتنظيم مصير الخلية وتسمح أيضا مسارات الإشارات التي تلت ذلك بدقة أداء مهامهم لتنويع الطبقات الجرثومية تشكل حديثا1. تشكيل تنظيم هياكل عابرة، ويشير إلى مراكز مثل العقدة و notochord أمر ضروري لتنفيذ برنامج إنمائي2. علماء الأحياء التنموي قد استخدمت مجموعة متنوعة من التقنيات لدراسة morphogenesis لهذه الهياكل، وأبرزها وهو استخدام الصحفيين الخلوية ويعيش السابقين فيفو التصوير لمتابعة الديناميات في السلوك الخلوية وسوبسيلولار2 ،،من34. وفي هذا التقرير، علينا أن نركز على وصف تفاصيل لدينا البروتوكولات الأمثل لاثنين من هذه التقنيات: المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) وجبل كاملة الفلورة (وميف)، التي كانت ولا تزال مفيدة في دراسة morphogenesis العقدة ولوحة نوتوتشوردال، تمهيدا نوتوتشورد.

العقدة الجنينية الماوس هو كوب على شكل دمعة الخلايا الموجودة على السطح البطني للجنين الماوس حولها وقت مبكر للمراحل المتأخرة من إضعاف رئيس خلال gastrulation و morphogenesis (يوم الجنينية، E7.5 E8)،،من25 6،7. لوحة نوتوتشوردال شكلياً ينبع الأسفل من العقدة3. كل خلية في العقدة ولوحة نوتوتشوردال يتسم هدب واحد أن يبرز إلى الخارج، وهو أطول في خلايا العقدة ولكن طوله يختلف مع مرحلة النمو2. ثبت تناوب أهداب في الحفرة عقده هامة للإشارات التي تحدد عدم التماثل في اليسار واليمين4. لوحة نوتوتشوردال هو مقدمة نوتوتشورد، مما يشير إلى مركز مهم للزخرفة somites المتاخمة و الأنبوب العصبي السطحية3.

وبسبب سمات الموقع (السطح) والشكل (كأس) وتمتلك هياكل متميزة الخلوي الخارجي (أهداب)، استخدمت وزارة شؤون المرأة تقليديا لتصور عقده ولوحة نوتوتشوردال ودراسة عن تكوين وهيكل2، 7-وزارة شؤون المرأة ويستخدم أيضا دراسة التغيرات في هيكل العقدة نفسها أو أهداب على خلاياه في الطفرات التي تؤثر في جاستروليشن، morphogenesis، فضلا عن أهداب تشكيل8،،من910. ووزارة شؤون المرأة هو أسلوب الذي يستخدم تركيز شعاع الإلكترونات باستجواب أولتراستروكتوري الطوبوغرافية للسطح الخارجي لمواد مثل العينات البيولوجية11. العينة هي عادة ثابتة والمجففة وثم الرش المغلفة مع المعادن لمراقبة تحت مجهر الإلكترون المسح كما يصف لنا في الخطوة 1.

ومف أسلوب المصبوغة لتصور منتجات الجينات، مثل البروتينات، في ثلاثة أبعاد (3D). وميف أنسجة أو أجهزة أو الكائنات كلها حتى يوفر المعلومات المكانية حول التوزيع الإشارات وشكل هيكل الناتج في 3D. يستند الأسلوب تحديد العينة ثم تلوين أنه مع يصرف الفلورسنت. ماوس الأجنة ~ E7.5 صغيرة وشفافة وذلك مثالية للبروتوكولات ومف تصور عقده ولوحة نوتوتشوردال. على سبيل المثال، عامل النسخ وأعرب عن بارتشيوري (T) في نواة لعقدة ولوحة نوتوتشوردال، وإلى حد أقل في الانتصارات البدائية، حول E7.5-E8 من التنمية الجنينية وحسن الأجسام المضادة للعامل ضد تي قبل وميف تجارياً المتاحة وإجراء المصبوغة الممكنة. خلايا العقدة ولوحة نوتوتشوردال تتميز أيضا بالأسطح قمي مقيدة، التي تواجه الخارج وهكذا يمكن ملطخة فالويدين fluorescence مترافق لمارك واكتين في التفجرات قمي. باستخدام هذه الكواشف كأمثلة، يوفر الجمع بين T وواو-أكتين تلطيخ ومف تمثيل العقدة ولوحة نوتوتشوردال في 3D في جاسترولاتينج الماوس الأجنة كما نبدي في الخطوة 2 8. ومع ذلك، يمكن استخدامها علامات أهداب، مثل ARL13B أو توبولين أسيتيلاتيد، فضلا عن علامات أخرى لعقدة ولوحة نوتوتشوردال، مثل FOXA2، أيضا أداء ومف على وضع الماوس الأجنة3،4.

وقد أظهرنا أن بروتين سترياتين-التفاعل 1 (STRIP1) ضروري ل gastrulation العادي و morphogenesis في جنين الفأر8. STRIP1 هو عنصر أساسي من التفاعل سترياتين فوسفاتاسيس ومجمعات مؤنزم (ستريباك)، التي تورطت في أكتين cytoskeleton المنظمة8،12نحن وآخرون. عيب رئيسي في الأجنة متحولة Strip1 في تشكيل mesoderm المحوري (العقدة ولوحة نوتوتشوردال)، وامتداد للمحور الخلفي أنتيرو الجسم. أننا استخدمنا ومف ووزارة شؤون المرأة لتحليل العقدة ولوحة نوتوتشوردال في البرية من نوع (WT) والأجنة Strip1 متحولة كما نعرض في نتائج الممثل والأرقام المقابلة.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع التجارب التي تشمل التجارب على الحيوانات بموافقة السلطات المسؤولة في شمال الراين وستفاليا (لانوف-NRW).

1-فحص المجهر الإلكتروني للعقدة الجنينية الماوس

  1. التضحية بالماوس الإناث الحوامل في ~ E7.5 (2-4 المرحلة سميط) بخلع عنق الرحم. شرح مفصل مع الرسومات التخطيطية للخطوات 1.1-1.7 متوفر في الماوس الجنين مختبر الأدلة13.
  2. فتح البطن من خلال الجلد وميسينتيريس وإزالة الرحم باستخدام مقص وملقط غرامة.
  3. شطف الرحم بإيجاز في الماء المقطر ووضعه في طبق بتري نظيفة صغيرة (6 سم) يحتوي على 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS).
  4. تحت مجهر تشريح واستخدام الملقط غرامة، إزالة عضلات الرحم لتحرير ديسيدواي الفردية أو المواقع غرس.
  5. يعقد كل أوروبية مع زوج واحد من الملقط واستخدام الزوج الأخرى لجعل شق كامل-سمك طولية بين الجزء الأحمر (المستقبل المشيمة) والجزء الأبيض (حيث يقع الجنين). جعل ثقوب سطحية عمودياً على طول الجزء الأبيض من أوروبية متجاورة مع الشق. سحب أوروبية عن بعضها البعض أفقياً إلى نصفين وعناية يستخرج الجنين في الجزء الأبيض من أوروبية.
  6. نقل الجنين إلى طبق بتري جديدة (35 ملم) مع برنامج تلفزيوني جديد العقيمة التي تمت تصفيتها. كرر لكل ديسيدواي/الأجنة.
  7. إزالة الغشاء رايشرت ب، غشاء مبهمة نسبيا التي تجتاح الجنين، من كل جنين باغاظة أنه بعيداً مثل جورب بدءاً من مخروط اكتوبلاسينتال (موقع غرس المحمر). للتنميط، تأخذ قطعة صغيرة (~ 0.1 مم2) من كيس ألمح في هذه المرحلة.
  8. تحت غطاء كيميائية ويرتدي الحماية المناسبة (قفازات)، نقل الأجنة إلى مثبت الرتب EM تتألف من 2.5 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها في أنبوب ميكروسينتريفوجي (1.5 مل) في درجة حرارة الغرفة. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  9. بعناية إزالة مثبت glutaraldehyde من الأنبوب دون لمس الأجنة وتجاهل في حاوية نفايات سليم. تغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها، لمدة كل 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. يذوي الأجنة في سلسلة إيثانول لمدة 5 دقائق: 50%، 70%، 85%، وثلاث مرات في 100% أو الإيثانول المطلقة. تخزين الأجنة في −20 درجة مئوية في الإيثانول أو انتقل مباشرة إلى الخطوة التالية.
  11. نقل الأجنة في الإيثانول إلى سلال للنقطة الحرجة التجفيف (وثيقة البرنامج القطري) في جهاز مجفف نقطة حرجة. ملء الدائرة مع الإيثانول لتغطية السلال تماما.
  12. تبادل الإيثانول بالتنظيف بعناية مع سائل CO2 لعشر مرات في 10 درجة مئوية. استنزاف قبالة السائل CO2 بعد الخطوة الأخيرة حتى الدائرة نصف كاملة. حرارة تصل إلى 40 درجة مئوية حتى يصل الضغط إلى أشرطة 80 (النقطة الحرجة) و أول أكسيد الكربون السائل2 يتغير إلى غاز. انتظر لمدة 10 دقائق ثم ضربة ببطء قبالة الغاز على مدى ما يقرب من 45 دقيقة.
  13. كبديل أسهل لوثيقة البرنامج القطري للتجفيف، إضافة هيكساميثيلديسيلازاني (همدس) بنسبة 1:1 للأجنة في الإيثانول لمدة 30 دقيقة. ثم نقل الأجنة إلى همدس نقية للحد الأدنى 30 إزالة الأجنة من السائل باستخدام ماصة وتركها لتجف لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: كلا أساليب التجفيف عملت على قدم المساواة في أيدينا.
  14. استخدام فرشاة دقيقة لتحميل الأجنة المجففة مع الجانب البطني (عقده) حتى على كعب SEM مع شريط مزدوج الوجهين.
  15. إدراج بذرة مع الأجنة في آلة الرش طلاء لطلاء الذهب الجسيمات، الذي هو المفضل لشحن أهداب رقيقة طويلة. تطبيق طبقة من 120-150؛ الوقت يتوقف على الحالية، التي تختلف مع كل عينة.
  16. ضع بذرة مغلفة بالأجنة إلى مجهر SEM وتطبيق فراغ وتلتزم بالعقدة الجنينية والخلايا لوحة نوتوتشوردال بأهداب في تكبير تتراوح بين 1000 X 15، 000 X.

2-كاملة الفلورة جبل العقدة الماوس ولوحة نوتوتشوردال

  1. استخدام برنامج تلفزيوني المثلج مع 0.05% 20 توين (ببستو)، اتبع الخطوات أعلاه 1.1-1.7 إزالة الأجنة في E7.75 ووضعها في ببستو في 35 مم طبق بيتري على الجليد.
  2. تحت غطاء كيميائية ويرتدي الحماية المناسبة (قفازات)، نقل الأجنة إلى حل مثبت بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني في أنبوب ميكروسينتريفوجي. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. بعناية إزالة مثبت بارافورمالدهيد من الأنبوب دون لمس الأجنة وتجاهل في حاوية نفايات سليم. تغسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2% Triton X-100 (PBSTr) لمدة كل 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أداء جميع المياه والصرف الصحي وحضانة الخطوات التالية على شاكر نوتاتينج.
  4. إزالة الغسيل الأخير وإضافة حظر حل الذي يحتوي على PBSTr مع المصل إبطال الحرارة 10% (من الأنواع المضيفة من جسم الثانوي). كتلة من ح 2 إلى بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.
  5. إزالة حجب وإضافة ~ 1 مل جسم الابتدائي المخفف في عرقلة الحل، على سبيل المثال جسم المضادة-تي في تمييع 1: 500. تبني بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.
  6. إزالة الأجسام المضادة الأولية وحفظها من أجل استخدامها لاحقاً بإضافة أزيد الصوديوم بتركيز 0.02% (1 ميليلتر من الأسهم 20 في المائة إلى 1 مل من محلول جسم) نهائي. يمكن إعادة استخدامها في الجسم ~ 10 مرات. شطف الأجنة مرتين مع PBSTr وثم غسلها ثلاث مرات عن 30 دقيقة في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.
  7. يستعاض عن الغسيل بجسم ثانوي مترافق الأسفار، ضد الأنواع المضيفة جسم الأولية، تضعف في ~ 1: 1000 بين عشية وضحاها (أو أكثر) في نوتاتور عند 4 درجة مئوية.
  8. إزالة الأجسام المضادة الثانوية وشطف مرتين مع PBSTr، ثم يغسل ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة مع PBSTr.
  9. محل الغسيل الأخير مع PBSTr التي تحتوي على فالويدين مترافق الأسفار 1: 500، وصمة عار واكتين، و 1: 1000 DAPI، وصمة عار النوى، ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف مرتين في PBSTr ويغسل مرة واحدة مع PBSTr لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  11. استبدال PBSTr ببرنامج تلفزيوني وتترك الأجنة في الجليد. إعداد شرائح نظيفة مشحونة إيجابيا (60 x 24 مم) وكوفيرسليبس (24 × 24 مم) والمتصاعدة على أساس والغليسيرول مائي وسائط الإعلام، على سبيل المثال، والغليسيرول 90% في 1xPBS وكاشف أنتيفادي، جبل الأجنة.
  12. وضع قطعتين من الشريط واضحة على مسافة من ~ 15 ملم من بعضهما البعض في جزء واضح من الشريحة. وهذا خلق مساحة ثلاثية الأبعاد (في البعد Z) تتيح التسوية الأجنة ولكن ليس تماما سكويشينج لهم.
  13. تحت مجهر تشريح، بعناية نقل الأجنة باستخدام ماصة P200 قطع (مساحة كافية للسماح للجنين إلى نقل ولا أضرار) إلى الشريحة.
  14. استخدام الملقط غرامة، إجراء تخفيضات كامل اثنين على الجانبين الأفقي من كيس ألمح تطور الجنين. وضع الجنين مع الجانب البطني (العقدة ولوحة نوتوتشوردال) حتى (الظهرية من الأنبوب العصبي لأسفل على الشريحة).
  15. إضافة 50 ميليلتر من تركيب وسائط على الجنين. ضع 4-5 أجنة كل شريحة. إضافة لمسة من تركيب وسائط إلى جانب ساترة أولاً اللمس الشريحة (الجانب العلوي أو السفلي)، ثم وضعه على المتداخلة قطعتين من الشريط، وخفضه ببطء على الأجنة باستخدام الملقط غرامة أو إبرة الجميلة بنت مع تجنب خلق فقاعات الهواء.
  16. تنظيف وسائل الإعلام تصاعد الزائدة باستخدام مسح ماصة. كن حذراً لا للانتقال ساترة في العملية.
  17. استخدام كمية سخية من طلاء الأظافر، ختم على جانبي ساترة دون نقله.
  18. مراقبة تحت مجهر [كنفوكل] المسح ضوئي.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل بحث تشكيل العقدة في الأجنة متحولة WT و Strip1 في ~ E7.5، استخدمنا SEM كما هو موضح في الخطوة 1 وهو مبين في الشكل 18. تفاصيل الطبولوجيا خارج استخدام SEM ultrastructural كانت مفيدة جداً، وكان من الواضح فورا أن الأجنة المسخ كان خلافا للعقدة على شكل حفرة في وزن الأجنة، عقده مسطح وغير النظامية. وأظهرت أعلى التكبير من الأجنة أهداب مميزة في خلايا العقدة التي حددت لهم لا لبس فيه. قد يكون الظاهر أقل كثافة من أهداب في المسخ يعزى إلى فقدان الهيكل حفرة العقدة وانحناء أو عددا أقل من خلايا العقدة. لوحة نوتوتشوردال الذي يظهر المنبثقة من العقدة كان أيضا غير النظامية في الأجنة المسخ. وكانت شخصية مع أهداب أقصر. ولذلك، من المهم SEM تكشف عيوب morphogenesis العقدة في طفرات Strip1 8. كما أننا استخدمنا وزارة شؤون المرأة في الدراسات السابقة لإظهار عدم وجود أهداب في العقدة الجنينية طفرات التي تفتقر إلى centrioles، التي تقدم القالب لأهداب9.

دراسة العيوب تشكيل mesoderm المحوري في الأجنة Strip1 المسخ على المستوى الخلوي، استخدمنا ومف كما هو موضح في الخطوة 2 وهو مبين في الشكل 2. باستخدام هذا الأسلوب، بعقدة ولوحة نوتوتشوردال بسهولة حددت واكتين وتلطيخ T. العقدة WT ولوحة نوتوتشوردال الخلايا يكون مقيدة المجالات قمي حيث اثريت واكتين، وتلطيخ تي النووية كان واضحا. لوحة نوتوتشوردال الموسعة روسترالي في الوزن ولكن كانت قصيرة وغير النظامية في المسخ. وأظهرت البيانات أن المنظمة أكتين و غير طبيعي في الطبقات الجرثومية مختلفة من الأجنة متحولة بما في ذلك mesoderm محوري8. وهكذا، ومف كان مفيداً لدراسة العيوب في العقدة وتشكيل لوحة نوتوتشوردال في Strip1 الأجنة المسخ.

figure-results-1
الشكل 1 . المسح الضوئي المجهر الإلكتروني يكشف العيوب في morphogenesis العقدة في الأجنة الماوس متحولة Strip1 . (أعلى) وزارة شؤون المرأة تحليلات WT و Strip1 متحولة البطني الجنينية العقد ولوحات نوتوتشوردال (نوتو)8. ويرد مثال لصورة تضخم منخفضة جنينا WT على اليسار. (أسفل) تكبير أعلى من مركز العقد سيظهر في أعلى كشف مونوسيليا طويلة إسقاط من خلايا العقدة. أمامي أعلى في كل اللوحات. تغيير حجم أشرطة: 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
الشكل 2 . جبل كاملة الفلورة ويبين العقدة غير طبيعي ولوحة نوتوتشوردال على المستوى الخلوي في الأجنة متحولة Strip1 . (أعلى) البطني عرض ثلاثي الأبعاد (برنامج فولوسيتي) ومف على الأجنة متحولة WT و Strip1 باستخدام مزيج من فالويدين fluorescence مترافق (F-أكتين، أحمر) وتلطيخ جسم (الأخضر) T. (أسفل) المزيد من الأمثلة لتلطيخ هو مبين أعلاه مع التركيز على العقدة مع تكبير أعلى، بما في ذلك DAPI. أمامي أعلى في كل اللوحات. تغيير حجم أشرطة: 30 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، نحن لشرح كيفية أداء أمانة شؤون المرأة، ومف تصور العقدة الجنينية الماوس ولوحة نوتوتشوردال. صغر حجم الأجنة الماوس جاسترولاتينج ~ E7.5 ووجود هذه الهياكل على السطح تجعلها مثالية لدراسة استخدام تقنيات وصف2،،من78. توافر أجسام جيدة، مثل علامات T واهداب، يعطي معلومات ثلاثية الأبعاد ممتازة استخدام ومف على هيكل وتنظيم وتشكيل هذه المنظمين الجنينية الأساسية8.

لأن عائدات التنمية الجنينية الماوس بوتيرة سريعة جداً، وعقده ولوحة نوتوتشوردال موجودة فقط عابر على السطح للجنين، توقيت أمر ضروري لنجاح هذه التجارب2،3. على سبيل المثال، الأجنة سميط 2-4 جيدة لتحليل SEM من حفرة العقدة ناضجة بأهداب طويلة. في الأجنة كثيرا في وقت سابق أو لاحق (على سبيل المثال، ح 12 قبل أو بعد)، قد لا تكون العقدة الحالية على السطح. ومف قليلاً أكثر مرونة في هذا الصدد ولكن الهياكل نفسها أيضا عابرة أثناء التطوير والتوقيت يعتمد في هذه الحالة على المصالح الباحثين.

نقاء الكواشف أمر ضروري لنجاح هذه التقنيات، لا سيما في التدقيق في أولتراستروكتوري بشوائب صغيرة sem. أن تتمسك بالأجنة وعادة ما يسفر عن التحف الضخمة.

لدينا اختبار اثنين من أساليب مختلفة لتثبيت الجنين لوزارة شؤون المرأة واحد باستخدام مثبت نصف كارنوفسكي (2.5 ٪ glutaraldehyde، المخزن كاكوديلاتي بارافورمالدهيد و 0.1 M 2%) وأبسط 2.5 ٪ glutaraldehyde في برنامج تلفزيوني 1 x. نحن نفضل استخدام glutaraldehyde وبرنامج تلفزيوني مثبت كما هو موضح في الخطوة 1، ومع ذلك، نحن وآخرون أيضا استخدمت مثبت في كارنوفسكي نصف بنجاح لوزارة شؤون المرأة.

لدينا أيضا مقارنة طريقتين لتجفيف الأجنة لوزارة شؤون المرأة، والعثور على أي اختلاف في نوعية العينة باستخدام نقطة حرجة مجفف أو همدس كما هو موضح في الخطوة 1 وذكرت في مكان آخر من14.

لخطوة 2، نحن اختبار التضمين الأجنة بعد خطوات الغسيل النهائي في 1% [اغروس] منخفضة ذوبان محمل على طبق أسفل زجاج 35 ملم وثم تحتل المرتبة الأولى مع ~ 10 ميليلتر من تصاعد المتوسطة. يعمل هذا الأسلوب التضمين ويحافظ على هيكل ثلاثي الأبعاد الأصلية للجنين والهياكل المرتبطة بها؛ مع ذلك، مطلوب مجهر مولتيفوتون صورة العينة لأنه لا يمكن التوصل إلى مجهر عادية [كنفوكل] كبالغ إلى أجنة سليمة (~ 1 مم).

ونحن نعتقد أن استخدام هذه التقنيات اثنين يعطي معلومات تكميلية عن بنية العقدة ولوحة نوتوتشوردال خلال التطور الطبيعي وفي المسوخ التي تظهر العيوب في تشكيل هذه الهياكل.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

غبطة معتمد من قبل بدء التمويل من كلية الطب و SFB829 من جامعة كولونيا. C.X. معتمد من قبل DFG منح با 5810/1-1. نود أن نشكر "مرافق التصوير" في مركز أبحاث سكاد والنصب التذكاري مركز سلون كيترينج للسرطان (نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية). ونحن نشكر خواكين غريغو-بيسا (الإسبانية المركز الوطني "أبحاث القلب والأوعية الدموية"، مدريد، إسبانيا) لبصيرته في تصاعد الأجنة ومف.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1،1،1،3،3،3 Hexamethyldisilazane (HMDS)Carl Roth3840
الأجسام المضادة المضادة TR & D SystemsAF2058
Critical Point DryerBlazers UnionCPD 020
DAPIAppliChemA4099،0005
محلول Glutardialdehyde 25٪Merck1042390250
Triton X-100Sigma AldrichX100-100ML
Tween 20AppliChemA4974،0500
وحدة طلاء SEM PS3Agar Aids للفحص المجهريالإلكتروني PS3
مجهر SEM Quantum FEG 250ThermoFisher Scientific (FEI)Quantum FEG 250

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rivera-Pérez, J. A., Hadjantonakis, A. K. The dynamics of morphogenesis in the early mouse embryo. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2015).
  2. Lee, J. D., Anderson, K. V. Morphogenesis of the node and notochord: The cellular basis for the establishment and maintenance of left-right asymmetry in the mouse. Developmental Dynamics. 237 (12), 3464-3476 (2008).
  3. Balmer, S., Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. Notochord morphogenesis in mice: Current understanding and open questions. Developmental Dynamics. 245 (5), 547-557 (2016).
  4. Yoshiba, S., et al. Cilia at the node of mouse embryos sense fluid flow for left-right determination via Pkd2. Science. , (2012).
  5. Jurand, A. Some aspects of the development of the notochord in mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morpholog. 32 (1), 1-33 (1974).
  6. Poelmann, R. E. The head-process and the formation of the definitive endoderm in the mouse embryo. Anatomy and Embryology (Berl). , 41-49 (1981).
  7. Sulik, K., et al. Morphogenesis of the murine node and notochordal plate. Developmental Dynamics. 201 (3), 260-278 (1994).
  8. Bazzi, H., Soroka, E., Alcorn, H. L., Anderson, K. V. STRIP1, a core component of STRIPAK complexes, is essential for normal mesoderm migration in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 10928-10936 (2017).
  9. Bazzi, H., Anderson, K. V. Acentriolar mitosis activates a p53-dependent apoptosis pathway in the mouse embryo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 1491-1500 (2014).
  10. Huangfu, D., Liu, A., Rakeman, A. S., Murcia, N. S., Niswander, L., Anderson, K. V. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  11. McMullan, D. Scanning electron microscopy 1928-1965. Scanning. 17 (3), 175-185 (2006).
  12. Bai, S. W., et al. Identification and characterization of a set of conserved and new regulators of cytoskeletal organization, cell morphology and migration. BMC Biology. 9, (2011).
  13. Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Fourth Edition. Cold Harb Lab Press. , (2014).
  14. Braet, F., De Zanger, R., Wisse, E. Drying cells for SEM, AFM and TEM by hexamethyldisilazane: a study on hepatic endothelial cells. Journal of Microscopy. 186, Pt 1 84-87 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Node Notochordal PlateScanning Electron MicroscopyWhole Mount ImmunofluorescenceMouse Embryo DevelopmentGastrulation E7 75Cilia VisualizationEmbryo Handling ProtocolFixative PreparationEthanol DehydrationHMDS Treatment

Related Articles