نقدم هنا، بروتوكول بسرعة وتكاثر توليد مستضد أرتيسيفيكال القابلة للتحلل بيولوجيا من وحي، وعرض الخلايا (آبك) مع الانضباطي الحجم والشكل والعرض التقديمي البروتين السطحي للخلية T التوسع السابقين فيفو أو الحية .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصنيع متباين مستضد الاصطناعية البوليمر عرض خلايا CD8 + تي خلية التنشيط
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) منصة واعدة للتحوير المناعي نظراً لقدرتها القوية لتحفيز خلايا تي. ركائز اللاخلوي توفر مزايا رئيسية على aAPC يستند إلى الخلية، بما في ذلك مراقبة دقيقة لمعلمات عرض الإشارات والخصائص الفيزيائية لسطح آبك تعدل تفاعلاته مع خلايا تي. آبك مصنوع من جسيمات متباين، جسيمات ارتفاعات خاصة، قد ثبت أن يكون أكثر فعالية من نظرائهم كروية في تحفيز خلايا تي بسبب زيادة الربط وأكبر من المساحة المتوفرة للخلية T الاتصال، كذلك كما أن انخفاض الإقبال غير محدد وتعزيز خصائص الحرائك الدوائية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بالجسيمات متباين، مقبولة على نطاق واسع حتى أساليب توليد جسيمات متباين مثل تمتد غشاء رقيق يمكن أن يكون تحديا لتنفيذ واستخدام تكاثر.
وتحقيقا لهذه الغاية، وصف بروتوكول لتصنيع سريع وموحد للتحلل aAPC المستندة إلى الجسيمات متباين مع الانضباطي الحجم، الشكل، وإشارة العرض التقديمي لخلية تي توسع السابقين فيفو أو في فيفو، جنبا إلى جنب مع أساليب تميز حجمها ومورفولوجيا، والبروتين السطحي المحتوى، وتقييم الوظائف الخاصة بهم. هذا النهج إلى اختﻻق aAPC متباين للتحجيم واستنساخه، مما يجعله مثاليا لتوليد آبك إيمونوثيرابيس "الجاهزة للاستخدام".
المقدمة
مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) أظهرت الوعد كوكلاء immunomodulatory نظراً لأنها يمكن أن تولد استجابة قوية محددة مستضد T خلية. الأساسية لهذه الأنظمة الأساسية هي قدرتها على كفاءة تقديم إشارات حاسمة لتنشيط الخلية T. AAPC اللاخلوي بديل جذاب ليستند إلى الخلية آبك لأنها أسهل وأقل تكلفة اختﻻق وتواجه تحديات أقل أثناء الصعود والترجمة، والتخفيف من المخاطر المرتبطة بالعلاجات المستندة إلى الخلية. AAPC اللاخلوي تسمح أيضا بدرجة عالية من السيطرة على إشارة عرض المعلمات والخصائص الفيزيائية للسطح التي سوف تتفاعل مع خلايا تي1.
يجب أن الخص آبك على الأقل ضرورية لتنشيط الخلية تي إشارتين. إشارة 1 يوفر الاعتراف مستضد ويحدث عندما تسلم مستق....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز.
1-تصنيع جسيمات كروية بلجا لحجم الانضباطي
- إعداد مواد تخليق الجسيمات
- إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل.
- إضافة 500 مل مياه (DI) إلى قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة مغناطيسية ووضع على صفيحة محرض في درجة حرارة 500 لفة في الدقيقة ومراقبة مع الحرارة. غطاء قارورة مع ورق ألمونيوم لمنع التبخر.
- عندما تصل درجة حرارة المياه إلى حوالي 70 درجة مئوية، إضافة إجمالي 25 جرام من بولي في دفعات صغيرة مع مرور الوقت، في انتظار بولي حل قبل إضافة المزيد.
- حالما يتم حل جميع بولي (عادة 30-60 دقيقة)، تتيح حل ....
- إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1تخطيطي للألى 2D رقيقة تمتد الجهاز. ويرد في هو et al.17 نقالة يتكون من أجزاء الألومنيوم استخدام التفريز القياسية وتقنيات القطع التخطيطي، ووصف لطبقة رقيقة 1 د تمتد الجهاز. مماثلة على نقالة د 1، نقالة 2D يتكون من قبضة معدنية والقضبان دليل. وتستخدم مسامير الرصاص ثنائي الاتجاه لترجمة الخطية إلى حركة دورانية. مسامير الرائدة هي المرفقة عبر الصنابير الميكانيكية للمحركات السائر متطابقة مع العزم الكافي. يمكن ملحوم الأسلاك التحكم ف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تفاصيل هذا البروتوكول وسيلة مرنة لتوليد جزيئات البوليمر متباين دقيقة. رقيقة تمتد التقنية المذكورة هنا قابلة للتطوير وعالية استنساخه وغير مكلفة. تقنيات بديلة لتوليد جزيئات متباين يعاني من قيود كثيرة، بما في ذلك تكلفة عالية ومنخفضة الإنتاجية، وحجم الجسيمات محدودة. رقيقة تمتد النهج هو أيضا مفيد لأنه يتم تعديل الجسيمات يكون متباين بعد التوليف، ونتيجة لذلك وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات وتقنيات التوليف. الشكل 1 تفاصيل برنامج إعداد الجهاز الآلي تمتد ثنائي الأبعاد. يمكن أيضا استخدام ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ما عدا (DGE-1746891) وكر (DGE-1232825) شكرا برنامج "زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني" للدعم. ذاكرة الوصول العشوائي وذلك بفضل الوطنية البحوث جائزة المعاهد الوطنية للصحة خدمة F31 NCI (F31CA214147) و "مكافآت الإنجاز" "زمالة علماء الكلية" للدعم. يشكر المؤلفون المعاهد الوطنية للصحة (R01EB016721 و R01CA195503)، والبحوث لمنع العمى جيمس وجائزة محفز حرة كارول، ومعهد "السرطان العلاج المناعي" لدعم بلومبرغ-كيميل الرهبان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بولي (كحول فينيل) ، MW 25000 ، 88٪ متحللة | بالماء Polysciences، Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| حرارة رقمي | Fluke | N / A | اسم الموديل: Fluke 52 II |
| مسبار درجة حرارة الغمر | Fluke | N / A | اسم الموديل: Fluke 80PK 22 |
| لوح تسخين رقمي & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint Thermal | Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H ، Poly (D ، L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| ثنائي كلورو ميثان | سيجما-ألدريتش | D65100 | |
| الخالط | IKA | & nbsp ؛ 0003725001 | |
| سونيكاتور | سونيكس & أمبير المواد ، شركة | غير متاح | رقم الموديل: VC 505 |
| Sonicator حاوية تخفيف الصوت | Sonics & المواد ، شركة | N / A | رقم القطعة: 630-0427 |
| مسبار Sonicator | Sonics & المواد ، شركة | غير متاح | رقم القطعة: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & المواد ، شركة | N / A | رقم الجزء: 630-0423 |
| جهاز طرد مركزي عالي السرعة | Beckman Coulter | N / A | رقم الموديل: J-20XP (متوقف) ، النموذج البديل: J-26XP |
| دوار الطرد المركزي عالي السرعة | Beckman Coulter | 369691 | رقم الموديل: JA-17 |
| أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة من البولي كربونات | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 مل ، غطاء لولبي |
| مستطيل يمكن التخلص منه طبق | VWR International | 25384-322 | 75 × 50 × 10 مم |
| طبق بتري مربع يمكن التخلص | VWR International | 10799-140 | 100 مم × 100 مم |
| LEAF & nbsp ؛ تنقية مضادة للفأر CD3 & epsilon. الأجسام المضادة | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab المضادة للفأر CD28 ، استنساخ 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & Prime ؛ -ethylcarbodiimide هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 المضاد للفأر CD3 الأجسام المضادة | Biolegend | 100212 | |
| APC المضاد للفأر CD28 الأجسام المضادة | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 بئر صلبة من البوليسترين Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | قاع مسطح ، |
| LoBind لبروتين البوليسترين الأسود ، 1.5 مل | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 متوسط (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma-Aldrich | F4135 | معطل بالحرارة ، مفلتر بالحرارة |
| Sigma-Aldrich | 17850 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| مؤتلف بشري IL-2 (خال من الناقلات) | Biolegend | 589102 | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملم) | ThermoFisher Scientific | ||
| MEM (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin الحل (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a + طقم عزل الخلايا التائية ، الماوس | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS فاصل | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| مقياس التدفق الخلوي | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 قارئ صفيحة دقيقة متعدد الكشف | BioTek | ||
| autoMACS تشغيل العازلة | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| مصفاة الخلية | ThermoFisher Scientific | 22363548 | معقمة ، 70 & m شبكة نايلون |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL / 6J (أسود 6) ماوس | مختبر جاكسون | 000664 | ذكر ، لا يقل عمره عن 7 أسابيع |
| من ألواح زراعة الأنسجة على شكل | حرف U السفلي VWR | 353227 | البوليسترين المعقمة ، 96 بئر لثقافة الأنسجة المعالجة ألواح البوليسترين |
| 40 فولت تيار مستمر مزود الطاقة | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE ماوس الأسلاك المطلية | 602-5858-100-01 | هذا مخصص للبكرة التي يبلغ طولها 100 قدم ولكن سلك مكافئ سيعمل | |
| سائق محرك متدرج | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector | Kit Probotix | IDCM-10-12 | |
| متحكم | Probotix | PBX-RF | |
| 4A الصمامات | Radio Shack | 2701026 | ستعمل الصمامات المكافئة أيضا |
| DB25 كابل ذكر إلى ذكر | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A إلى USB-B دبابيس الكابلات | 2094915 | سيعمل الكابل المكافئ أيضا بالإضافة | |
| موصلات Amphenol ذات 8 سنون من الماوس من الذكور والإناث | 654-97-3100A-20-7P و 654-97-3106A20-7S | ||
| محرك متدرج | Probotix | HT23-420-8 | |
| برغي الرصاص الأيمن | روتون | 60722 | |
| اليد اليسرى الرصاص المسمار | روتون | 60723 | |
| مسامير | ماكماستر كار | 92196A151 | |
| النيوبرين المطاط | ماكماستر كار | 8698K51 | |
| اليد اليمنى حواف الرصاص الجوز | روتون | 91962 | |
| اليد اليسرى حواف الرصاص الجوز | روتون | 91963 | |
| لينكس التحكم في الكمبيوتر | بروبوتيكس | LCNC-PC | سيعمل أي جهاز كمبيوتر بمواصفات مطابقة ونظام تشغيل Linux |
| تصفية الفراغ من Corning | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution ، 0.4٪ | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
المراجع
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
