نقدم هنا، بروتوكول بسرعة وتكاثر توليد مستضد أرتيسيفيكال القابلة للتحلل بيولوجيا من وحي، وعرض الخلايا (آبك) مع الانضباطي الحجم والشكل والعرض التقديمي البروتين السطحي للخلية T التوسع السابقين فيفو أو الحية .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تصنيع متباين مستضد الاصطناعية البوليمر عرض خلايا CD8 + تي خلية التنشيط
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) منصة واعدة للتحوير المناعي نظراً لقدرتها القوية لتحفيز خلايا تي. ركائز اللاخلوي توفر مزايا رئيسية على aAPC يستند إلى الخلية، بما في ذلك مراقبة دقيقة لمعلمات عرض الإشارات والخصائص الفيزيائية لسطح آبك تعدل تفاعلاته مع خلايا تي. آبك مصنوع من جسيمات متباين، جسيمات ارتفاعات خاصة، قد ثبت أن يكون أكثر فعالية من نظرائهم كروية في تحفيز خلايا تي بسبب زيادة الربط وأكبر من المساحة المتوفرة للخلية T الاتصال، كذلك كما أن انخفاض الإقبال غير محدد وتعزيز خصائص الحرائك الدوائية. وعلى الرغم من الاهتمام المتزايد بالجسيمات متباين، مقبولة على نطاق واسع حتى أساليب توليد جسيمات متباين مثل تمتد غشاء رقيق يمكن أن يكون تحديا لتنفيذ واستخدام تكاثر.
وتحقيقا لهذه الغاية، وصف بروتوكول لتصنيع سريع وموحد للتحلل aAPC المستندة إلى الجسيمات متباين مع الانضباطي الحجم، الشكل، وإشارة العرض التقديمي لخلية تي توسع السابقين فيفو أو في فيفو، جنبا إلى جنب مع أساليب تميز حجمها ومورفولوجيا، والبروتين السطحي المحتوى، وتقييم الوظائف الخاصة بهم. هذا النهج إلى اختﻻق aAPC متباين للتحجيم واستنساخه، مما يجعله مثاليا لتوليد آبك إيمونوثيرابيس "الجاهزة للاستخدام".
المقدمة
مستضد الاصطناعي عرض الخلايا (آبك) أظهرت الوعد كوكلاء immunomodulatory نظراً لأنها يمكن أن تولد استجابة قوية محددة مستضد T خلية. الأساسية لهذه الأنظمة الأساسية هي قدرتها على كفاءة تقديم إشارات حاسمة لتنشيط الخلية T. AAPC اللاخلوي بديل جذاب ليستند إلى الخلية آبك لأنها أسهل وأقل تكلفة اختﻻق وتواجه تحديات أقل أثناء الصعود والترجمة، والتخفيف من المخاطر المرتبطة بالعلاجات المستندة إلى الخلية. AAPC اللاخلوي تسمح أيضا بدرجة عالية من السيطرة على إشارة عرض المعلمات والخصائص الفيزيائية للسطح التي سوف تتفاعل مع خلايا تي1.
يجب أن الخص آبك على الأقل ضرورية لتنشيط الخلية تي إشارتين. إشارة 1 يوفر الاعتراف مستضد ويحدث عندما تسلم مستقبلات خلية تي (تكر) ويشترك مع فئة MHC I أو II تحمل مستضد المشابهة لها، بلغت ذروتها في إشارة عن طريق تكر المعقدة. لتجاوز شرط التحديد مستضد، نظم aAPC غالباً ما تتحمل جسم [مونوكلونل] ناهضة ضد مستقبلات CD3، الذي يحفز المجمع تكر نونسبيسيفيكالي. المؤتلف أشكال MHC، لا سيما مولتيميرس MHC، استخدمت أيضا على سطح آبك لتوفير خصوصية مستضد2،3. هو إشارة 2 إشارة كوستيمولاتوري أن يوجه نشاط الخلايا T. توفير كوستيموليشن اللازمة لتنشيط الخلية T، هو حفز مستقبلات CD28 عموما مع جسم ناهضة عرضت على السطح آبك، على الرغم من أن مستقبلات كوستيمولاتوري أخرى مثل 4-1BB كانت مستهدفة بنجاح4. يتم عادة المعطل تداولها البروتينات إشارة 1 و 2 على سطح جسيمات صلبة توليف آبك. تاريخيا، وقد كانت ملفقة aAPC من مجموعة متنوعة من المواد، بما في ذلك البوليستيرين4،5 والحديد ديكستران6. استخدام أحدث أنظمة البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي مثل بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا) لتوليد آبك التي يمكن بسهولة إضافة إلى إشارة البروتينات وهي مناسبة للإدارة المباشرة في فيفو، ويمكن تسهيل الإفراج عن المطرد تغليف السيتوكينات أو العوامل القابلة للذوبان لزيادة تنشيط الخلية تي7،8.
بالإضافة إلى وجود بروتينات الإشارات الضرورية، مشاركة مستقبلات على مساحة كبيرة بما فيه الكفاية خلال التفاعل خلية آبك/T ضروري لتنشيط الخلية T. وهكذا، البارامترات الفيزيائية ل aAPC مثل الحجم والشكل جذريا يغير مجال الاتصال المتاحة ويؤثر على قدرتها على حفز خلايا تي. أظهرت aAPC ميكرون الحجم لتكون أكثر فعالية في تحفيز خلايا تي من9،النظراء النانو على10. ومع ذلك، يمكن أن يكون نانو-آبك بيوديستريبوشن متفوقة وأفضل الصرف إلى الغدد الليمفاوية التي يمكن أن تعزز بها الأداء في فيفو أكثر من الصغرى-آبك11. الشكل متغير آخر للفائدة في النظم المستندة إلى الجسيمات آبك. مؤخرا أظهرت aAPC متباين يكون أكثر فعالية من الجسيمات الخواص في تحفيز خلايا تي، يرجع ذلك أساسا إلى تعزيز التفاعل مع الخلايا الهدف مقترنا مع الخلية غير محددة انخفاض الإقبال. ربط خلايا تفضيلي المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات، وأكبر نصف قطر انحناء سطح تملق والسماح لمزيد من الاتصال بين أعبك وخلية T12. كما يثبط المحور الطويل للجسيمات ارتفاعات البلعمه، أسفر عن وقت التداول زيادة مقارنة بجسيمات كروية بعد في فيفو الإدارة12،13. وبسبب هذه المزايا، التوسط الجسيمات ارتفاعات أكبر توسع محددة مستضد تي الخلايا في المختبر و في فيفو مقارنة بجسيمات كروية، لاحظ تأثير في الجزئي ونانوسكاليس12، 13. وهناك استراتيجيات مختلفة لاختلاق الجسيمات متباين، ولكن تمتد غشاء رقيق أسلوب بسيط ومقبول على نطاق واسع تستخدم لتوليد مجموعة من الجسيمات المتنوعة الأشكال14. بعد التوليف، ويلقي في الأفلام الجسيمات وامتدت في أبعاد واحد أو اثنين في درجة حرارة فوق درجة حرارة التحول الزجاجي للمواد الجسيمات. ثم يتم حل الفيلم لاسترداد الجسيمات. وعلى الرغم من تزايد الاهتمام في جزيئات متباين، النهج الحالي لتصنيع آبك على أساس الجسيمات في معظمها تقتصر على نظم الخواص، وأساليب تغيير الشكل الجسيمات يمكن أن تكون صعبة التنفيذ، غير متوافقة مع بعض التوليف aAPC استراتيجيات، والافتقار إلى الدقة وإمكانية تكرار نتائج15. لدينا تقنية تمتد من غشاء رقيق يمكن تنفيذها يدوياً أو بطريقة إليه لسرعة توليد متباين الجزيئات توليفها من مجموعة متنوعة من البوليمرات القابلة للتحلل الحيوي، امتدت إلى نسبة العرض إلى الارتفاع المطلوب في واحد أو اثنين من أبعاد15.
يستند عملنا السابق، قمنا بتطوير نهج قائم على الجسيمات القابلة للتحلل الحيوي جنبا إلى جنب مع تقنية تمتد غشاء رقيق تحجيم سرعة توليد aAPC مع الانضباطي الحجم والشكل بطريقة موحدة للخلية T التوسع السابقين فيفو أو في فيفو. يمكن استخدام استراتيجيتنا تصريف البروتين لزوجين protein(s) أي اهتمام لمجموعات الكربوكسيل على سطح الجسيمات في كثافة المرجوة، يعطي هذا النظام آبك بدرجة عالية من المرونة. كما يصف لنا طرق لوصف حجم ومورفولوجيا، والمحتوى من آبك سطح البروتين، وتقييم تلك الوظائف في المختبر. هذا البروتوكول يمكن تكييفها بسهولة لتوسيع نطاق الخلايا المناعية السابقين فيفو أو في فيفو لمجموعة متنوعة من التطبيقات إيمونوثيرابيوتيك.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة جون هوبكنز.
1-تصنيع جسيمات كروية بلجا لحجم الانضباطي
- إعداد مواد تخليق الجسيمات
- إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل.
- إضافة 500 مل مياه (DI) إلى قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة مغناطيسية ووضع على صفيحة محرض في درجة حرارة 500 لفة في الدقيقة ومراقبة مع الحرارة. غطاء قارورة مع ورق ألمونيوم لمنع التبخر.
- عندما تصل درجة حرارة المياه إلى حوالي 70 درجة مئوية، إضافة إجمالي 25 جرام من بولي في دفعات صغيرة مع مرور الوقت، في انتظار بولي حل قبل إضافة المزيد.
- حالما يتم حل جميع بولي (عادة 30-60 دقيقة)، تتيح حل تصفية بارد وعقيمة. تخزين في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- إعداد الفيلم يلقي الحل من 10% w/w بولي ووالغليسيرول w/w 2%.
- إضافة 500 مل مياه دي قارورة Erlenmeyer مع شريط إثارة مغناطيسية. إضافة 8 مل الجلسرين في درجة حرارة الغرفة ومزيج من تريتوريشن.
- ضع قارورة على صفيحة محرض في درجة حرارة 500 لفة في الدقيقة ومراقبة مع الحرارة. غطاء قارورة مع ورق ألمونيوم لمنع التبخر.
- عندما حل درجة حرارة تصل إلى حوالي 70 درجة مئوية، إضافة إجمالي 50 جرام من بولي في دفعات صغيرة مع مرور الوقت، في انتظار بولي حل قبل إضافة المزيد.
- حالما يتم حل جميع بولي (عادة 60 دقيقة)، تتيح حل بارد والعقيمة تصفية باستخدام نظام تصفية فراغ أعلى زجاجة مع حجم مسام 0.22 ميكرومتر. تخزين في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في المستقبل.
- تعد حلاً بولي 50 مل 1% w/w. إضافة 40 مل من المياه دي و 10 مل من 5% بولي الحل (صنع في 1.1.1) كوب 100-150 مل.
- تعد حلاً بولي 100 مل 0.5% w/w. إضافة 90 مل من المياه دي و 10 مل من محلول بولي 5% إلى كوب 150-250 مل.
- إضافة شريط إثارة مغناطيسية إلى 0.5% بولي الحل والمكان في غطاء كيميائية على لوحة ضجة في درجة حرارة الغرفة 500 لفة في الدقيقة.
- إعداد 5% w/w البولي فينيل الكحول (PVA) الحل.
- يمثل التوليف
- وزنها إلى 100 مغ بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا) إلى القنينة التﻷلؤ وتذوب في 5 مل الميثان (DCM). دوامة بلجا حل.
- ضع الخالطون في الحل بولي 1% 50 مل حيث الخالطون أقرب إلى الجزء السفلي من الكأس ممكن دون لمسها. قم بتشغيل الخالطون وضبط بالسرعة المرجوة – دورة في الدقيقة 3,200 عن 5 ميكرومترات قطرها الجسيمات، 5,000 لفة في الدقيقة ل 3 ميكرومتر، 15000 لفة في الدقيقة ل 1 ميكرومتر (زيادة تجانس سرعة انخفاض حجم الجسيمات). مرة واحدة في السرعة المرجوة، إضافة حل بلجا للكأس ومجانسة لمدة 1 دقيقة.
- بعد التجانس، من أجل 1 ٪ بولي، بلجا يمثل الحل إلى الحل بولي 0.5% 100 مل على لوحة ضجة وآثاره لمدة 4 ساعات على الأقل لتبخر المذيبات في غطاء كيميائية.
- أغسل الجسيمات 3 مرات في المياه دي.
- صب الحل الجسيمات في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ز لمدة 5 دقائق. صب المادة طافية وإضافة حوالي 20 مل مياه دي.
- ريسوسبيند الجسيمات فورتيكسينج. وبمجرد حراكه، تملأ الأنابيب المخروطية إلى 50 مل مع المياه دي.
- أغسل مرة أخرى بنفس الطريقة مرتين أخريين.
- توليف نانوحبيبات
- تزن بملغ 200 من بلجا إلى قنينة التﻷلؤ وتذوب في 5 مل DCM. دوامة بلجا حل.
- ضع كوب مع محلول بولي 1% 50 مل في حاوية مليئة بالجليد. مكان التحقيق سونيكاتور في الكأس مقربة من أسفل قدر الإمكان دون لمس. تبدأ sonication وإضافة حل بلجا فورا إلى الكأس. Sonicate بقوة 12 ث لمدة دقيقتين لتوليد جسيمات نانوية مع قطرها تقريبي من 200 نانومتر.
- وبعد سونيكيشن، من أجل 1 ٪ بولي، بلجا نانوحبيبات الحل إلى حل بولي 0.5% 100 مل على لوحة ضجة وآثاره لمدة 4 ساعات على الأقل لتبخر المذيبات في غطاء كيميائية.
- من أجل الحل الجسيمات في أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3,000 س ز لمدة 5 دقائق لإزالة المجهرية الدقيقة. إزالة المادة طافية وتصب في أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة.
- أغسل الجسيمات 3 مرات مع المياه دي. الطرد المركزي في 40,000 س ز لمدة 15 دقيقة. صب المادة طافية وريسوسبيند في المياه دي قبل فورتيكسينج. أغسل مرة أخرى بنفس الطريقة مرتين أخريين.
2-تصنيع جزيئات البوليمر للشكل الانضباطي
- بعد الغسيل بلجا جسيمات ريسوسبيند ثلاث مرات، الجسيمات في حوالي 1 مل مياه دي. إضافة حل الصب الفيلم إلى جزيئات لتركيز الجسيمات النهائية للجسيمات 2.5 ملغ/مل.
- "الماصة؛" تعليق الجسيمات في مختبرين مل 10 إلى 75 × 50 مم أطباق بيتري مستطيلة تمتد أحادي البعد أو في مختبرين 15 مل في أطباق بتري مربعة 100 × 100 ملم لتمتد ثنائي الأبعاد. إزالة فقاعات ماصة أما أو فقاعات دفع إلى الجانب وترك الأفلام الجافة بين عشية وضحاها في غطاء كيميائية.
- أفلام مرة واحدة قد جفت وإزالة الأفلام من البلاستيك الأطباق بملاقط وقطع الحواف من الأفلام مع المقص. حفظ الحواف في أنبوب 50 مل مخروطية لاستخدامها كجسيمات كروية.
- تحميل فيلم على رقيقة الآلي تمتد الجهاز قبل تركيب فيلم على كتل الألومنيوم. لتمتد د 1، جبل الفيلم على كتل الألومنيوم من محور واحد من نقالة (الشكل 2) عن طريق وضع اثنين حواف قصيرة للفيلم ما بين قطعتين من مطاط النيوبرين. استخدام مفتاح ألن، المسمار قبضة معدنية على رأس مطاطية لعقد الفيلم في المكان. لتمتد 2D، جبل كافة الحواف الأربع على أربع كتل الألومنيوم لتمتد على كلا محاور (الشكل 2).
- قياس وتسجيل طول الفيلم ما بين كتل الألومنيوم في محور واحد لتمتد د 1 أو كل محاور لتمتد 2D. حساب المسافة المطلوبة على امتداد الفيلم في اتجاه واحد أو اثنين استناداً إلى امتداد إضعاف المطلوب.
- ضع الجهاز تمتد تحميل الفيلم في فرن عند 90 درجة مئوية وجلب الفيلم لدرجة حرارة أكثر من 10 دقائق. ضع كوب كبيرة في الفرن مع كمية صغيرة من الماء.
- تمتد الفيلم.
- عندما يتم الانتهاء من التمدد، إزالة الجهاز تمتد من الفرن والسماح لتبرد الفيلم إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- لتمتد د 1، قص الفيلم خارج الجهاز تمتد عند الحواف. لتمتد 2D، قص وحفظ مركز مربعة من الفيلم الذي صورة موحدة تمتد على كلا محاور. ضع الأفلام في أنابيب مخروطية الشكل مع الأفلام 2 كل أنبوب وتجاهل بقية الفيلم.
- إضافة حوالي 25 مل مياه دي كل الأنبوبة المخروطية ودوامه حتى يتم حل هذه الأفلام.
- حالما يتم حل الأفلام، يغسل الجسيمات 3 مرات مع المياه دي.
- المجهرية الدقيقة، تملأ الأنابيب المخروطية إلى 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 3000 x ز لمدة 5 دقائق، وصب المادة طافية، إضافة حوالي 20 مل من المياه دي، ودوامه الجسيمات ريسوسبيند.
- لجسيمات نانوية، جسيمات نقل أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة وأجهزة الطرد المركزي في س 40,000 ز لمدة 15 دقيقة، صب المادة طافية، إضافة حوالي 20 مل من المياه دي، ودوامه الجسيمات ريسوسبيند.
- بعد الغسيل الثالث، ريسوسبيند الجسيمات في حوالي 1 مل مياه دي. تسجيل وزن أنبوب ميكروسينتريفوجي وإضافة جسيمات إلى الأنبوب. تجميد الجزيئات في ثلاجة-80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة أو تجميد فلاش في نيتروجين سائل. بمجرد تجميد، ليوفيليزي الجزيئات بين عشية وضحاها.
- مرة واحدة المجففة بالتبريد، وزن جزيئات في أنبوب ميكروسينتريفوجي وطرح مسجل وزن الأنبوبة الفارغة لتحديد وزن جزيئات المجففة بالتبريد.
3-تصريف البروتين السطحية لإنشاء اصطناعية مستضد تقديم الخلايا
- تحضير 2-(ن-Morpholino) اثانيسولفونيك الحمضية (MES) المخزن المؤقت. جعل حل م 0.1 من مس في المياه وضبط درجة الحموضة إلى 6.0 بالمعايرة مع هيدروكسيد الصوديوم 1 م (هيدروكسيد الصوديوم).
- ريسوسبيند المجففة بالتبريد الجزئي بلجا/بب/جسيمات نانوية في 20 ميكروغرام/مل في مس المخزن المؤقت قبل فورتيكسينج. ملء أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبيلين مع ميكروليتر 900 مس المخزن المؤقت وإضافة 100 ميكروليتر من الحل الجسيمات للأنبوب.
- إعداد حل مؤسسة/دائرة الصحة الوطنية. حل 40 مغ 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) كاربودييميدي (EDC) و 48 ملغ N-هيدروكسيسولفوكسوكسينيميدي (NHS) في 1 مل مس المخزن المؤقت.
- إضافة 100 ميكروليتر تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية حل للجسيمات ودوامه لمزيج.
- احتضان الأنبوب في العاكس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- تدور أسفل المجهرية الدقيقة في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق، أو جسيمات نانوية في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 1 مل برنامج تلفزيوني فورتيكسينج (المجهرية الدقيقة) أو سونيكاتينج في 2-3 ث لمدة 5 ثوان (nanoparticles).
- المجهرية الدقيقة، إضافة 8 ميكروغرام من البروتين المطلوب إشارة 1، و 10 ميكروغرام لمكافحة الفأر CD28 (استنساخ 37.51) للجسيمات. لجسيمات نانوية، إضافة 16 ميكروغرام إشارة 1 و 20 ميكروغرام المضادة الماوس CD28. إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين في الأنبوب إلى 1.1 مل.
- احتضان الأنبوب في العاكس عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
- وفي اليوم التالي يغسل الجسيمات. تدور أسفل المجهرية الدقيقة في 5,000 س ز لمدة 5 دقائق، أو جسيمات نانوية في 17,000 س ز لمدة 5 دقائق. تجاهل المادة طافية، وريسوسبيند الجسيمات في 1 مل PBS العقيمة التي فورتيكسينج (المجهرية الدقيقة) أو سونيكيشن في 2-3 ث لمدة 5 ثوان (nanoparticles). كرر مرتين.
- ريسوسبيند الجسيمات في التركيز المطلوب في الثقافة المتوسطة للاستخدام الفوري. للتخزين على المدى الطويل، ريسوسبيند الجسيمات في 10 ملغ/مل في محلول سكروز 100 مم. تجميد، ليوفيليزي، وتخزين الجسيمات في-80 درجة مئوية.
4-توصيف وتقييم آبك
- وصف آبك الحجم والشكل (الشكل 3)
- وصف الشكل والحجم يمثل بالتصوير الجسيمات باستخدام المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM). لوزارة شؤون المرأة تلتزم الجسيمات المجففة بالتبريد التصوير، وانتشرت على الشريط الكربون ألومنيوم تك وتفل معطف مع البلاديوم الذهب.
- تحليل حجم ونسبة العرض إلى الارتفاع للجسيمات باستخدام برمجيات تحليل الصورة.
- لتحديد حجم الجسيمات، تعيين مقياس استخدام مقياس بار وقياس قطر الجسيمات. كرر للجسيمات حوالي 100 تحديد قطر متوسط من الجسيمات وإنشاء مدرج تكراري لأحجام الجسيمات.
- لتحديد نسبة العرض إلى الارتفاع، وقياس المسافة عبر المحور الطويل والمحور قصيرة من الجسيمات وتقسيم المحور الطويل بالمحور قصيرة. كرر للجسيمات حوالي 50 من كل شكل لتحديد نسبة العرض إلى الارتفاع المتوسط الجسيمات لكل شكل وتوليد الرسوم البيانية.
- وصف الشكل والحجم نانوحبيبات بالتصوير الجسيمات باستخدام مجهر إلكتروني (TEM). تحليل حجم ونسبة العرض إلى الارتفاع للجسيمات النانوية باستخدام برنامج تحليل الصور كما هو موضح في 5.1.2. بدلاً من ذلك، قياس حجم نانوحبيبات كروية استخدام تشتت الضوء الحيوي (DLS) أو نانوحبيبات تتبع تحليل (NTA).
- كفاءة تصريف البروتين
- إعداد أعبك وفقا لأساليب 1-3، ولكن في "الخطوة 3، 7" استخدام البروتين المسمى فلوريسسينتلي إشارة 1 و CD28 المضادة الماوس. بعد الاقتران والغسيل، ريسوسبيند آبك في 1 مل برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي آبك 2 ملغ/مل.
- إعداد مستويات البروتين في ميكروسكوبية 96-جيدا أسود البوليستيرين. إضافة 5 ميكروغرام من البروتين المسمى فلوريسسينتلي إشارة 1 لبرنامج تلفزيوني في البئر الأولى اللوحة وجعل تخفيف 1:2 10 في برنامج تلفزيوني عبر الصف الخاص باللوحة. ترك فارغاً جيدا آخر. كرر هذه الخطوة لإنشاء مجموعة أخرى من المعايير مع CD28 مكافحة المسمى فلوريسسينتلي.
- "الماصة؛" 100 ميكروليتر من الحل آبك في آبار نسخ متماثل من الميكروسكوبية البوليستيرين الأسود في ثلاث نسخ.
- قراءة الأسفار على قارئ لوحة fluorescence في الأطوال الموجية المناسبة. استخدام قراءات الأسفار من مستويات البروتين لتوليد المنحنيات القياسية لكل جسم الفلورسنت. استخدام المنحنى القياسي، حساب تركيزات إشارة 1 ومكافحة-CD28 في كل بئر عينة، وثم حساب مقدار البروتين السطحي وكفاءة التصريف (الشكل 4 أ، الشكل 5A).
- تقييم آبك للتحفيز في المختبر من خلايا CD8 + "تي"
- تعد وسائل الإعلام ب (ربمي المتوسطة وتستكمل مع الجلوتامين لام، 10% FBS، حل من الأحماض الأمينية الأساسية عدم 1%، بيروفات صوديوم 1%، 1% فيتامين MEM الحل، 92 ميكرومترات β-mercaptoethanol و 10 نانوغرام/مل السيبروفلوكساسين 30 U/mL إيل-2.
- التضحية بماوس 6 الأسود عبر التعرض لغاز ثاني أكسيد الكربون.
- حصاد الطحال من الماوس وفقا لبروتوكول المحددة سابقا16. جمع الطحال في أنبوب 50 مل مخروطية مع 10-15 مل برنامج تلفزيوني. استخدام مدقة، الهريس الطحال من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. خلال جرش، غسل المصفاة مع 40 مل برنامج تلفزيوني.
- تدور سبلينوسيتيس في 300 x ز لمدة 5 دقائق. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند في سبلينوسيتيس في 4 مل من Ack ليسينج المخزن المؤقت خلايا الدم الحمراء. يسمح الأنبوب للجلوس دون عائق لمدة 1 دقيقة، ثم إضافة برنامج تلفزيوني إحضار وحدة التخزين في الأنبوبة إلى 20 مل.
- تدور الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق. من أجل إيقاف المادة طافية وريسوسبيند الخلايا الموجودة في 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
- وتدور الخلايا في 300 x ز لمدة 5 دقائق ريسوسبيند في حجم الخلية فصل المخزن المؤقت المطلوب. عزل خلايا CD8 + "تي" من تعليق خلية مفردة باستخدام CD8 + سلبية تشكيلة طقم عزل خلية T، يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- بعد فصل المغناطيسية، تدور خلايا CD8 + "تي" في 300 x غ لمدة خمس دقائق وإزالة المخزن المؤقت فصل الخلية. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني وحساب الخلايا. قم بتسمية الخلايا مع إستر سوكسينيل كاربوكسيفلوريسسين (CFSE) وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
- احتضان 8,333 خلايا CD8 + "تي" وملغ 0.0833 (أو الجرعة المطلوبة) من آبك في وسائل الإعلام ب 150 ميكروليتر في كل بئر من 96 جيدا U-المعالجة بزراعة الأنسجة لوحة أسفل.
- احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام. بعد 3-4 أيام، تحديث المتوسط الثقافة عن طريق إضافة 75 ميكروليتر الطازجة المتوسطة لكل بئر.
- بعد 3 أيام حضانة، تحليل كفسي المسمى الخلايا في سيتوميتير تدفق لتقييم انتشار. يمثل كل ذروة في الرسم البياني التدفق الخلوي كفسي جيل خلايا بسبب تمييع كفسي مع كل انقسام الخلايا المتتابعة.
- بعد 7 أيام، استخدام هيموسيتوميتير لحساب عدد الخلايا في كل بئر. قبل العد، وصمة عار الخلايا الميتة مع حل تريبان الأزرق. استبعاد الخلايا الميتة من التهم الخلية الأخيرة. تطبيع تركيز الخلية النهائية إلى تركز الأولى حساب إضعاف-التوسع في(الشكل 4 و الشكل 5).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويرد في الشكل 1تخطيطي للألى 2D رقيقة تمتد الجهاز. ويرد في هو et al.17 نقالة يتكون من أجزاء الألومنيوم استخدام التفريز القياسية وتقنيات القطع التخطيطي، ووصف لطبقة رقيقة 1 د تمتد الجهاز. مماثلة على نقالة د 1، نقالة 2D يتكون من قبضة معدنية والقضبان دليل. وتستخدم مسامير الرصاص ثنائي الاتجاه لترجمة الخطية إلى حركة دورانية. مسامير الرائدة هي المرفقة عبر الصنابير الميكانيكية للمحركات السائر متطابقة مع العزم الكافي. يمكن ملحوم الأسلاك التحكم ف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تفاصيل هذا البروتوكول وسيلة مرنة لتوليد جزيئات البوليمر متباين دقيقة. رقيقة تمتد التقنية المذكورة هنا قابلة للتطوير وعالية استنساخه وغير مكلفة. تقنيات بديلة لتوليد جزيئات متباين يعاني من قيود كثيرة، بما في ذلك تكلفة عالية ومنخفضة الإنتاجية، وحجم الجسيمات محدودة. رقيقة تمتد النهج هو أيضا مفيد لأنه يتم تعديل الجسيمات يكون متباين بعد التوليف، ونتيجة لذلك وهو متوافق مع مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات وتقنيات التوليف. الشكل 1 تفاصيل برنامج إعداد الجهاز الآلي تمتد ثنائي الأبعاد. يمكن أيضا استخدام ه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ما عدا (DGE-1746891) وكر (DGE-1232825) شكرا برنامج "زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني" للدعم. ذاكرة الوصول العشوائي وذلك بفضل الوطنية البحوث جائزة المعاهد الوطنية للصحة خدمة F31 NCI (F31CA214147) و "مكافآت الإنجاز" "زمالة علماء الكلية" للدعم. يشكر المؤلفون المعاهد الوطنية للصحة (R01EB016721 و R01CA195503)، والبحوث لمنع العمى جيمس وجائزة محفز حرة كارول، ومعهد "السرطان العلاج المناعي" لدعم بلومبرغ-كيميل الرهبان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بولي (كحول فينيل) ، MW 25000 ، 88٪ متحللة | بالماء Polysciences، Inc. | 02975-500 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| حرارة رقمي | Fluke | N / A | اسم الموديل: Fluke 52 II |
| مسبار درجة حرارة الغمر | Fluke | N / A | اسم الموديل: Fluke 80PK 22 |
| لوح تسخين رقمي & Stirrer | Benchmark Scientific | H3760-HS | |
| Multipoint Thermal | Fisher Scientific | 50093538 | |
| Resomer RG 504 H ، Poly (D ، L-lactide-co-glycolide) | Sigma-Aldrich | 719900 | |
| ثنائي كلورو ميثان | سيجما-ألدريتش | D65100 | |
| الخالط | IKA | & nbsp ؛ 0003725001 | |
| سونيكاتور | سونيكس & أمبير المواد ، شركة | غير متاح | رقم الموديل: VC 505 |
| Sonicator حاوية تخفيف الصوت | Sonics & المواد ، شركة | N / A | رقم القطعة: 630-0427 |
| مسبار Sonicator | Sonics & المواد ، شركة | غير متاح | رقم القطعة: 630-0220 |
| Sonicator microtip | Sonics & المواد ، شركة | N / A | رقم الجزء: 630-0423 |
| جهاز طرد مركزي عالي السرعة | Beckman Coulter | N / A | رقم الموديل: J-20XP (متوقف) ، النموذج البديل: J-26XP |
| دوار الطرد المركزي عالي السرعة | Beckman Coulter | 369691 | رقم الموديل: JA-17 |
| أنابيب الطرد المركزي عالية السرعة من البولي كربونات | Thermo Fisher Scientific | 3118-0050 | 50 مل ، غطاء لولبي |
| مستطيل يمكن التخلص منه طبق | VWR International | 25384-322 | 75 × 50 × 10 مم |
| طبق بتري مربع يمكن التخلص | VWR International | 10799-140 | 100 مم × 100 مم |
| LEAF & nbsp ؛ تنقية مضادة للفأر CD3 & epsilon. الأجسام المضادة | Biolegend | 100314 | |
| InVivoMab المضادة للفأر CD28 ، استنساخ 37.51 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| N- (3-Dimethylaminopropyl) -N & Prime ؛ -ethylcarbodiimide هيدروكلوريد | Sigma-Aldrich | E6383 | |
| N-Hydroxysulfosuccinimide ملح الصوديوم | Sigma-Aldrich | 56485 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Alexa Fluor 488 المضاد للفأر CD3 الأجسام المضادة | Biolegend | 100212 | |
| APC المضاد للفأر CD28 الأجسام المضادة | Biolegend | 102109 | |
| Corning 96 بئر صلبة من البوليسترين Microplate | Sigma-Aldrich | CLS3915 | قاع مسطح ، |
| LoBind لبروتين البوليسترين الأسود ، 1.5 مل | Eppendorf | 22431081 | |
| RPMI 1640 متوسط (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma-Aldrich | F4135 | معطل بالحرارة ، مفلتر بالحرارة |
| Sigma-Aldrich | 17850 | ||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| مؤتلف بشري IL-2 (خال من الناقلات) | Biolegend | 589102 | |
| بيروفات الصوديوم (100 ملم) | ThermoFisher Scientific | ||
| MEM (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| MEM Vitamin الحل (100X) | ThermoFisher Scientific | 11120052 | |
| CD8a + طقم عزل الخلايا التائية ، الماوس | Miltenyi Biotech | 130-104-075 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFisher Scientific | C34554 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| MidiMACS فاصل | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| MACS Multistand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| مقياس التدفق الخلوي | Accuri C6 | ||
| Synergy 2 قارئ صفيحة دقيقة متعدد الكشف | BioTek | ||
| autoMACS تشغيل العازلة | Miltenyi BIotech | 130-091-221 | |
| مصفاة الخلية | ThermoFisher Scientific | 22363548 | معقمة ، 70 & m شبكة نايلون |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| C57BL / 6J (أسود 6) ماوس | مختبر جاكسون | 000664 | ذكر ، لا يقل عمره عن 7 أسابيع |
| من ألواح زراعة الأنسجة على شكل | حرف U السفلي VWR | 353227 | البوليسترين المعقمة ، 96 بئر لثقافة الأنسجة المعالجة ألواح البوليسترين |
| 40 فولت تيار مستمر مزود الطاقة | Probotix | LPSK-4010 | |
| PTFE ماوس الأسلاك المطلية | 602-5858-100-01 | هذا مخصص للبكرة التي يبلغ طولها 100 قدم ولكن سلك مكافئ سيعمل | |
| سائق محرك متدرج | Probotix | MondoStep5.6 | |
| IDC Connector | Kit Probotix | IDCM-10-12 | |
| متحكم | Probotix | PBX-RF | |
| 4A الصمامات | Radio Shack | 2701026 | ستعمل الصمامات المكافئة أيضا |
| DB25 كابل ذكر إلى ذكر | Probotix | DB25-6 | |
| USB-A إلى USB-B دبابيس الكابلات | 2094915 | سيعمل الكابل المكافئ أيضا بالإضافة | |
| موصلات Amphenol ذات 8 سنون من الماوس من الذكور والإناث | 654-97-3100A-20-7P و 654-97-3106A20-7S | ||
| محرك متدرج | Probotix | HT23-420-8 | |
| برغي الرصاص الأيمن | روتون | 60722 | |
| اليد اليسرى الرصاص المسمار | روتون | 60723 | |
| مسامير | ماكماستر كار | 92196A151 | |
| النيوبرين المطاط | ماكماستر كار | 8698K51 | |
| اليد اليمنى حواف الرصاص الجوز | روتون | 91962 | |
| اليد اليسرى حواف الرصاص الجوز | روتون | 91963 | |
| لينكس التحكم في الكمبيوتر | بروبوتيكس | LCNC-PC | سيعمل أي جهاز كمبيوتر بمواصفات مطابقة ونظام تشغيل Linux |
| تصفية الفراغ من Corning | Sigma-Aldrich | CLS431097 | |
| Trypan Blue Solution ، 0.4٪ | ThermoFisher Scientific | 15250061 |
المراجع
- Eggermont, L. J., Paulis, L. E., Tel, J., Figdor, C. G. Towards efficient cancer immunotherapy: Advances in developing artificial antigen-presenting cells. Trends in Biotechnology. 32 (9), 456-465 (2014).
- Maus, M. V., Riley, J. L., Kwok, W. W., Nepom, G. T., June, C. H. HLA tetramer-based artificial antigen-presenting cells for stimulation of CD4+ T cells. Clinical Immunology. 106 (1), 16-22 (2003).
- Oelke, M., et al. Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells. Nature Medicine. 9 (5), 619-624 (2003).
- Rudolf, D., et al. Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells. Cancer Immunology, Immunotherapy. 57 (2), 175-183 (2008).
- Tham, E. L., Jensen, P. L., Mescher, M. F. Activation of antigen-specific T cells by artificial cell constructs having immobilized multimeric peptide-class I complexes and recombinant B7-Fc proteins. Journal of Immunological Methods. 249 (1-2), 111-119 (2001).
- Perica, K., et al. Magnetic field-induced T cell receptor clustering by nanoparticles enhances T cell activation and stimulates antitumor activity. ACS Nano. 8 (3), 2252-2260 (2014).
- Steenblock, E. R., Fadel, T., Labowsky, M., Pober, J. S., Fahmy, T. M. An artificial antigen-presenting cell with paracrine delivery of IL-2 impacts the magnitude and direction of the T cell response. The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34883-34892 (2011).
- Zhang, L., et al. Paracrine release of IL-2 and anti-CTLA-4 enhances the ability of artificial polymer antigen-presenting cells to expand antigen-specific T cells and inhibit tumor growth in a mouse model. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (9), 1229-1241 (2017).
- Mescher, M. F. Surface contact requirements for activation of cytotoxic T lymphocytes. The Journal of Immunology. 149 (7), 2402-2405 (1992).
- Steenblock, E. R., Fahmy, T. M. A comprehensive platform for ex vivo T-cell expansion based on biodegradable polymeric artificial antigen-presenting cells. Molecular Therapy. 16 (4), 765-772 (2008).
- Fifis, T., et al. Size-dependent immunogenicity: therapeutic and protective properties of nano-vaccines against tumors. The Journal of Immunology. 173 (5), 3148-3154 (2004).
- Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells. Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2014).
- Meyer, R. A., et al. Biodegradable nanoellipsoidal artificial antigen presenting cells for antigen specific T-cell activation. Small. 11 (13), 1519-1525 (2015).
- Champion, J. A., Katare, Y. K., Mitragotri, S. Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release. 121 (1-2), 3-9 (2007).
- Meyer, R. A., Meyer, R. S., Green, J. J. An automated multidimensional thin film stretching device for the generation of anisotropic polymeric micro- and nanoparticles. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (8), 2747-2757 (2015).
- Ho, C. C., Keller, A., Odell, J. A., Ottewill, R. H. Preparation of monodisperse ellipsoidal polystyrene particles. Colloid and Polymer Science. 271 (5), 469-479 (1993).
- Shum, H. C., et al. Droplet microfluidics for fabrication of non-spherical particles. Macromolecular Rapid Communications. 31 (2), 108-118 (2010).
- Lan, W., Li, S., Xu, J., Luo, G. Controllable preparation of nanoparticle-coated chitosan microspheres in a co-axial microfluidic device. Lab on a Chip. 11 (4), 652-657 (2011).
- Yang, S., et al. Microfluidic synthesis of multifunctional Janus particles for biomedical applications. Lab on a Chip. 12 (12), 2097-2102 (2012).
- Zhou, Z., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Synthesis of protein-based, rod-shaped particles from spherical templates using layer-by-layer assembly. Advanced Materials. 25 (19), 2723-2727 (2013).
- Jang, S. G., et al. Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers. Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).
- Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers. Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).
- Rolland, J. P., et al. Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials. Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).
- Meyer, R. A., et al. Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation. Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
