يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل لغزو خلايا السرطان والمنتشر لمكافحة المخدرات فحص استخدام صفيف المائية الصغيرة-الدائرة (همكا)-على أساس لوحات

8.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/58359

⸱

أكتوبر 25, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Physics Department, Bar-Ilan University

في هذه المقالة

ملخص

صفيحة تصوير على أساس همكا تعرض للغزو مقايسة الأداء. وتيسر هذه اللوحة تشكيل الماغنيسيوم الورم (3D) ثلاثي الأبعاد والقياس من غزو خلايا السرطان في المصفوفة خارج الخلية (ECM). التحديد الكمي المقايسة غزو يتحقق عن طريق تحليل شبه التلقائي.

الملخص

من المعروف أن يسبب 90% فتك السرطان سرطان خبيث. ورم خبيث هو عملية متعددة المراحل الذي يبدأ مع الاختراق/غزو الخلايا السرطانية إلى الأنسجة المجاورة. وهكذا، الغزو خطوة حاسمة في ورم خبيث، مما يجعل الغزو عملية البحث والتطوير المتنقل لمكافحة المخدرات، هامة للغاية. ولمعالجة هذا الطلب، هناك حاجة إلى وضع نماذج ثلاثية الأبعاد في المختبر الذي تقليد الهندسة المعمارية للأورام الصلبة وبهم المكروية أوثق إلى في فيفو الدولة من جهة، ولكن في نفس الوقت يمكن استنساخه وقوية ومناسبة قياسات المحتوى عالية وعالية الغلة. حاليا، معظم غزو فحوصات الانكفاء على التكنولوجيات المتطورة موائع جزيئية وكافية للبحث ولكن ليس لفحص المخدرات كبيرة الحجم. فحوصات أخرى باستخدام الأجهزة المستندة إلى اللوحة مع الماغنيسيوم فردية منعزلة في كل بئر المواد المستهلكة وحجم العينة منخفضة لكل شرط. وهدف البروتوكول الحالي توفير نظام يستند إلى الخلية 3D المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. قمنا بتطوير نموذج ثلاثي الأبعاد للمقايسة غزو استناداً إلى لوحة التصوير همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم واكتشاف الأدوية المضادة المنتشر. ويتيح هذا الجهاز إنتاج الماغنيسيوم موحدة عديدة كل بئر (حجم العينة عالية كل شرط) محاطة بمكونات إدارة المحتوى في المؤسسة، بينما بشكل مستمر وفي نفس الوقت مراقبة وقياس الماغنيسيوم في القرار عنصر مفرد للمتوسطة فحص الإنتاجية المنتشر لمكافحة المخدرات. هذا المنهاج يرد هنا بإنتاج الماغنيسيوم هيلا و MCF7 لتجسد خلية مفردة والغزو الجماعي. نحن مقارنة تأثير حمض الهيالورونيك المكون إدارة المحتوى في المؤسسة (ها) على قدرة الكولاجين المحيطة الماغنيسيوم الحلة الغازية. وأخيراً، نقدم فيسيتين (غزو المانع) هيلا الماغنيسيوم وأكسيد النيتريك (لا) (غزو المنشط) الماغنيسيوم MCF7. ويتم تحليل النتائج بالبرامج الداخلية التي تمكن من تحليل شبه التلقائي وبسيطة وسريعة مما يسهل فحص المعلمة متعددة.

المقدمة

السرطان الموت تعزى أساسا إلى نشر خلايا المنتشر إلى أماكن بعيدة. الكثير من الجهود في معالجة السرطان التركيز على استهداف أو منع تشكيل المستعمرات المنتشر وتطور المرض المنتشر النظامية1. سرطان الخلية الهجرة خطوة حاسمة في عملية استئصال ورم خبيث، وبالتالي، من البحوث المتعلقة بتتالي غزو السرطان مهم جداً وشرط أساسي لإيجاد العلاجات المضادة المنتشر.

قد تم العثور على استخدام نماذج حيوانية كأدوات لدراسة المرض المنتشر لتكون مكلفة للغاية وليس دائماً ممثلة للورم في البشر. وعلاوة على ذلك، طبولوجيا المكروية خارج الخلية والميكانيكا وتكوينها بشدة يؤثر سرطان الخلية السلوك2. نظراً لطبيعتها في فيفو نماذج عدم القدرة على فصل والسيطرة على هذه المعلمات المحددة التي تسهم في غزو السرطان وورم خبيث، هناك حاجة للمحاكاة البيولوجية يمكن السيطرة عليها في المختبر نماذج.

أجل السرطاني على الأجهزة البعيدة، يجب أن يحمل الخلايا السرطانية السمات المظهرية المهاجرة والغازية التي يمكن أن تكون هدفا للعلاج. ومع ذلك، منذ تقليد نماذج السرطان في المختبر معظم الميزات الفعلية من الأورام الصلبة3، أنها صعبة للغاية لكشف تعمل فسيولوجيا ذات الصلة. وبالإضافة إلى ذلك، عدم تجانس المظهرية التي توجد داخل الورم، يملي الحاجة إلى تحليل الهجرة ورم في القرار عنصر مفرد من أجل اكتشاف العلاجات الموجهة النمط الظاهري، على سبيل المثال، عن طريق استهداف الخلية الشروع في ورم خبيث السكان داخل الأورام غير متجانسة4.

ويجري دراسة حركية الخلية والهجرة الجماعية أساسا في ثقافات أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية على الأسطح المستوية متجانسة. هذه النماذج الخلوية التقليدية لسرطان الخلية الهجرة تستند إلى تحليل السكان من الخلايا الفردية الغازية من خلال الأغشية وإدارة المحتوى في المؤسسة مكونات5، ولكن في مثل هذه الأنظمة، لا يمكن أن تكون الاختلافات الجوهرية بين خلايا فردية درس. توليد الماغنيسيوم 3D أما عبر السقالات أو في هياكل صغيرة خالية من السقالة تعتبر متفوقة يعني بدراسة الورم الخلية النمو والسرطان غزو6،،من78. بيد أن معظم النظم 3D ليست مناسبة لتنسيقات عالية الإنتاجية والتفاعل بين الوكالات كروي عادة لا يمكن أن يتحقق منذ الماغنيسيوم فردية منعزلة يتم إنشاؤها في كل الدقيقة، حسنا9. الدراسات الحديثة المتعلقة بهجرة سرطان تستند إلى موائع جزيئية الأجهزة3،10،،من1112، ولكن هذه متطورة موائع جزيئية صعبة لإنتاج أدوات ولا تستخدم لارتفاع الإنتاجية الفحص (HTS) الغازية لمكافحة المخدرات.

اثنين الرئيسية تعمل، الهجرة الخلية الجماعية والفردية، والتي تلعب دوراً في التغلب على الحاجز ECM الخلايا السرطانية وغزو الأنسجة المجاورة، وقد تم إثبات13،14، كل عرض متميزة المورفولوجية الخصائص والآليات البيوكيميائية والجزيئية والوراثية. وباﻹضافة إلى ذلك، لوحظت شكلين لترحيل الخلايا السرطانية، مثل تنتجها الخلايا الليفية واميبيه، في كل النمط الظاهري. منذ على حد سواء، تعمل الغزو وطرق الهجرة، تتحدد أساسا بالخصائص المورفولوجية، هناك حاجة الخلوية نماذج هذا الكشف على أساس تصوير تمكين وفحص جميع أشكال الغزو الورم وتهاجر الخلايا.

والهدف العام للطريقة الحالية تقديم المحاكاة البيولوجية البسيطة واستنساخه 3D في المختبر نظام يستند إلى الخلية لتحليل القدرات الغزو في إعداد كبيرة من السكان من الماغنيسيوم الورم. هنا، نحن نقدم لوحة 6-جيدا التصوير على أساس همكا للبحوث المتعلقة بغزو الورم والعلاج المضادة المنتشر. التكنولوجيا تمكن تشكيل عدد كبير من الماغنيسيوم الورم 3D موحدة (450 كل بئر) في بنية مايكرو-دوائر (MC) المائية. مختلف مكونات ECM تضاف إلى الصفيف كروي لتمكين غزو الخلايا في البيئة المحيطة. ويرصد باستمرار المراقبة القصيرة الأجل والطويلة الأجل لنفس الخلايا الفردية الماغنيسيوم/الغازية عملية الغزو ويسهل توصيف الخصائص المورفولوجية وتلطيخ الفلورسنت واسترجاع الماغنيسيوم محددة عند أي نقطة. منذ الماغنيسيوم عديدة مشاركة مساحة والمتوسطة، من الممكن التفاعل عن طريق الجزيئات القابلة للذوبان بين الماغنيسيوم الفردية وتأثيرها على بعضها البعض. يتم إجراء تحليل صورة شبه تلقائية باستخدام MATLAB شفرة داخلية تمكن من جمع كمية كبيرة من البيانات أسرع وأكثر كفاءة. المنهاج يسهل قياس دقيقة وفورية لخلايا عديدة الماغنيسيوم/الغازية بطريقة فعالة من حيث وقت، السماح بفحص الإنتاجية المتوسطة لغزو لمكافحة المخدرات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-همكا لوحة النقش

ملاحظة: يتم وصف العملية الكاملة لتصميم وتصنيع ختم بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) ولوحة همكا التصوير المستخدمة في هذا البروتوكول بالتفصيل في أعمالنا السابقة المادتين15،16. ختم PDMS (الشكل السلبي) يستخدم للنقش همكا (الشكل الإيجابي) الذي يتكون من حوالي 450 MCs كل بئر (الشكل 1A). كما هو موضح في الشكل 1 باء، كل الإشراف على شكل هرمي مربع الشكل رأسا مبتوراً (الارتفاع: 190 ميكرون، ومساحة قاعدة صغيرة: 90 ميكرون x 90 ميكرومتر، ومساحة قاعدة كبيرة: 370 مكم x 370 ميكرومتر). يتم استخدام لوحة همكا للإعداد واستزراع من الماغنيسيوم الورم 3D وبعد ذلك، لغزو المقايسة. وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام طابع تجاري لإنتاج همكا.

  1. تعد حلاً من 6% انخفاض ذوبان [اغروس] (LMA). إدراج مسحوق والفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) (0.6 جم كل 10 مل من برنامج تلفزيوني) في زجاجة زجاج مع محرض مغناطيسية. ضع الزجاجة على لوحة تدفئة وآثاره الحل أثناء التدفئة إلى 80 درجة مئوية لعدة ساعات حتى يتم التوصل إلى حل موحد. يبقى الحل في 70 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. قبل الحرارة الختم PDMS إلى 70 درجة مئوية في الفرن. يبقيه دافئ حتى الاستخدام. وبدلاً من ذلك، استخدم طابع تجاري، واتبع التعليمات.
  3. وضع لوحات تجارية أسفل الزجاج 6-جيدا في حمام جافة ساخنة مسبقاً إلى 75 درجة مئوية. انتظر لبضع دقائق حتى تصبح اللوحة دافئة تماما.
  4. من أجل قطره (400 ميليلتر) لما قبل ساخنة على أسفل الزجاج لكل واحدة من الآبار في اللوحة. بلطف ضع ختم PDMS قبل ساخنة على الإسقاط [اغروس]. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 – 10 دقيقة التبلور مسبقاً وقبل التبريد. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لتحقيق كامل [اغروس] جيليشن. ثم، بلطف تقشر PDMS, ترك [اغروس] هلام منقوشة مع الإشراف.
    ملاحظة: يتم إجراء هذه الخطوة في وقت واحد في جميع الآبار.
  5. ضع لوحة منقوشة في ضوء علاج نظام مجهزة بالأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) مصباح، واحتضان لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: الآن هو لوحة همكا الأشعة فوق البنفسجية للتعقيم.
  6. ملء الماكرو-الآبار مع PBS العقيمة ضمان إبقاء الرطب، ثم تغطية اللوحة، التفاف مع بارافيلم وتخزينه في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  7. قبل الاستخدام، قم بإفراغ مخلفات برنامج تلفزيوني من لوحة همكا. ضعه في هود البيولوجية.

2-تحميل الخلايا وتشكيل كروي

  1. جمع الخلايا كما يلي: إزالة المتوسطة كل من 10 سم ثقافة لوحة خلية أحادي الطبقة، وتغسل مرتين مع 10 مل من برنامج تلفزيوني التخلص من المخلفات من المصل، وإضافة 5 مل التربسين (استعد مسبقاً إلى 37 درجة مئوية)، واحتضان لمدة 3 دقائق في الحضانة عند 37 درجة مئوية. ثم، اهتز لوحة بلطف لضمان انفصال أحادي الطبقة، وإضافة 10 مل من إكمال المتوسطة (مرحلة ما قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) وماصة صعودا وهبوطاً حتى يتحقق تعليق خلية متجانسة. الطرد المركزي وتغسل تعليق خلية مع 15 مل متوسطة جديدة، ثم تعلق بتركيزات مناسبة في المتوسط كاملة جديدة.
  2. تحميل تعليق خلية بلطف (~ 16 – 40 50 ميليلتر، 150 – 360 × 103 خلايا/مل في المتوسط، الخلايا الواحدة MC) على رأس همكا وتسمح للخلايا بتسوية بالجاذبية لمدة 15 دقيقة.
  3. بلطف إضافة مختبرين 6 – 8 من 500 ميليلتر الطازجة المتوسطة (مجموع 3 – 4 مل) إلى حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا خارج الصفيف خاتم والمائية.
  4. احتضان خلايا هيلا ح 72 وخلايا MCF7 ح 48 في 37 درجة مئوية و 5% CO2، في جو هوميديفيد لتشكيل الماغنيسيوم.

3-إمكانية الكشف بواسطة يوديد Propidium (PI) تلطيخ

  1. إعداد حل أسهم بي (500 ميكروغرام بي كل 1 مل من برنامج تلفزيوني). يبقيه في 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر. طازجة إعداد إضعاف 1:2,000 (0.25 ميكروغرام/مل)، بإضافة 6 ميليلتر من الأسهم إلى 12 مل متوسطة كاملة دون الأحمر الفينول، لوحة همكا 6-جيدا (2 مل في البئر).
  2. نقل لوحة همكا مع الماغنيسيوم ح 48-72، من الحاضنة إلى هود البيولوجية. إزالة المتوسطة جميع من همكا واسطة يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا بجوار الصفيف المائية، ترك الدبابة الصفيف مليئة بالمتوسطة.
  3. بلطف إضافة 2 مل لتمييع PI من 3.1 الخطوة لكل بئر، يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو، حسنا. احتضان لوحة همكا ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2، في جو هوميديفيد. تابع إلى الخطوة 7.
    ملاحظة: الأصباغ الأخرى يمكن استخدامها هنا كذلك، على سبيل المثال، هويشت لتلطيخ نواة، إستر الميثيل تيتراميثيلرهوداميني (تمرم) لإمكانات غشاء الميتوكوندريا تلطيخ، اسيتات فلوريسسين (FDA) للكشف عن الخلايا الحية، "أنيكسين الخامس" للمبرمج الكشف وغيرها.

4-إعداد الخليط الكولاجين

  1. تحضير الماء المقطر مزدوجة العقيمة (دو) اﻷوتوكﻻف ومخزون من 100 مل حل تصفية تعقيم هيدروكسيد الصوديوم 1 م. الحفاظ على المواد في RT، ونصائح المستخدمة لإعداد مزيج الكولاجين المجمدة في-20 درجة مئوية، حتى الاستخدام.
  2. 10 – 20 دقيقة قبل الاستخدام، ضع جميع إينتيرجراديس بما في ذلك: دو العقيمة، حل عقيم M هيدروكسيد الصوديوم 1، 10 العقيمة x برنامج تلفزيوني، النوع الأول من الكولاجين من ذيل الفئران (المخزنة في 4 درجات مئوية لمدة 3 – أشهر) وأنبوب عقيمة في دلو الثلج حتى يبرد تماما. مكان دلو الجليد داخل غطاء البيولوجية.
  3. إعداد 1,800 ميليلتر من مزيج الكولاجين بتركيز نهائي 3 ملغ/مل، 6-بئر همكا غزو المقايسة لوحة (300 ميليلتر للبئر الواحد) على النحو التالي. إضافة إينتيرجراديس في أنبوب تبريد بالترتيب التالي: 515 ميليلتر من دو، 24.8 ميليلتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم و 180 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 10 x. مزيج جيد من دوامة ومكان العودة إلى الجليد. وأخيراً، إضافة ميليلتر 1080 الكولاجين إلى الخليط، دوامة مرة أخرى ووضع مرة أخرى في الجليد.

5-ها وإعداد مزيج الكولاجين

  1. حل 10 مغ هكتار في 2 مل دو العقيمة. احتضان هذا الخليط في RT لبضع دقائق ودوامه برفق حتى يذوب المسحوق تماما. تخزين حل الأسهم عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنتين.
  2. حق قبل الاستخدام، وضع الحل الأسهم هكتار في دلو الجليد داخل غطاء البيولوجية.
  3. إعداد 3 مغ/مل مزيج الكولاجين كما هو موضح في الخطوة 4. إضافة 36 ميكروغرام (7.2 ميليلتر) من هكتار في 1,800 ميكروليتر من استعداد لاستخدام مزيج الكولاجين، لتركيز نهائي من 20 ميكروغرام/مل. ثم، من دوامة مرة أخرى بإيجاز ووضعها مرة أخرى في الثلج.

6-إضافة خليط إدارة المحتوى في المؤسسة

  1. نقل لوحة همكا، مع الماغنيسيوم ح 48 – 72، من الحضانة إلى هود البيولوجية ووضعه على الجليد. احتضان لمدة 10 دقائق حتى يتم تبريد اللوحة. الحرارة قبل التوصل إلى حل 1% لما إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. إزالة المتوسطة كل من حولها همكا، يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو-جيدا بجوار الصفيف المائية. ثم إزالة بعناية فائقة، المتوسطة كل من خزان الصفيف مع غرامة نصيحة/هلام تحميل تلميح، التي يميل في نهاية الحافة على حافة الصفيف، بلطف وبطء امتصاص جميع المتوسطة خارج.
    ملاحظة: بعد إزالة المتوسطة كل من حول الصفيف المائية، خزان الصفيف لا تزال مليئة بالمتوسطة. وقد هذه الوسيلة المراد إزالتها بلطف جداً من أجل تجنب تدمير المائية MC والتفكك من الماغنيسيوم.
  3. تأخذ 150 ميليلتر مزيج الكولاجين أو خليط هكتار والكولاجين (خليط ECM) مع طرف ما يرام قبل المجمدة وإضافة إلى الخزان الصفيف بإرفاق الحافة إلى الحافة الصفيف. الإفراج عن هذا الخليط ببطء لتجنب التفكك كروي. كرر هذه الخطوة مع قاسمة آخر من 150 ميليلتر، ميليلتر 300 مجموع كل بئر. اتبع نفس الإجراء لكل بئر حتى يتم ملء جميع الآبار. ثم ضع اللوحة في الحاضنة ح 1 جيليشن الكاملة لإدارة المحتوى في المؤسسة.
  4. بعد أن أنجز جيلاتيون الكاملة لإدارة المحتوى في المؤسسة، "الماصة؛" 400 ميليلتر من قبل حرارة 1% لما فوق هلام إدارة المحتوى في المؤسسة. تغطية اللوحة مع غطاء لها، واحتضان اللوحة على RT لمدة 5 – 7 دقائق، ومن ثم لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية، جيلاتيون [اغروس]. وأخيراً، بلطف إضافة 2 مل متوسطة كاملة يميل في نهاية الحافة على حافة أسفل البلاستيك الماكرو، حسنا.
    ملاحظة: يمنع الطبقة [اغروس] مفرزة المصفوفة جل الكولاجين من همكا.

7-غزو المقايسة اقتناء وتحليل

  1. تحميل لوحة همكا على محركات مقلوب مرحلة مجهر مجهزة حاضنة، قبل تعديلها إلى 37 درجة مئوية، 5% CO2 وجو هوميديفيد.
  2. قبل تحديد المواقف للحصول على الصور في كل جيدا حتى تغطي منطقة الصفيف بالكامل، واستخدام 10 X أو 4 X أهداف (هذه الخطوة غير مطلوبة من أجل البرنامج اقتناء الصورة المستخدمة هنا، انظر الجدول المواد أدناه للحصول على التفاصيل). بدلاً من ذلك، استخدم أي برنامج اقتناء الصورة لتسهيل المسح التلقائي للمنطقة المطلوبة بأكملها، باختيار "ستيتش" الخيار.
  3. اقتناء الصور الميدانية مشرق (BF) كل ح 2 – 4 لفترة مجموعها 24 – 72 ساعة كي تتبع غزو الخلايا من جسم كروي إلى ECM المحيطة بها.
  4. الحصول على الصور الفلورية لكشف بي باستخدام مكعب فلورسنت مخصصة (الإثارة تصفية 530-550 نانومتر، مرآة مزدوج اللون 565 نانومتر طويلة تمرير والانبعاثات تصفية 600-660 nm).
  5. تصدير الوقت الفاصل بين فرنك بلجيكي/فلوري الصور من خلال البرنامج الحصول على الصورة وحفظها في تنسيق ملف صور ذي علامات (TIFF) إلى مجلد مخصص باستخدام علامة التبويب "قاعدة البيانات" في شريط الأدوات، ومن ثم الزر "تصدير ملفات السجل" .
    ملاحظة: قمنا بتطوير مدونة تحليل داخلي خاص ببرنامج MATLAB يحتوي على واجهة مستخدم الرسومية مصممة (GUI) في الغزو الذي يمكن أن ينفذ تحليل أسرع وأسهل. في هذه التعليمة البرمجية التحليل، يتم تجزئة الماغنيسيوم وغزو المنطقة شبه تلقائياً باستخدام عامل تصفية سوبيل تليها العوامل المورفولوجية تآكل وتمدد. بعد التلقائي تقسيم المناطق، قدمت التصحيحات اليدوية حيث تدعو الحاجة لدقة أفضل. تلقائياً بعد انتهاء الانقسام، مجموعة من معلمات تحسب البرمجيات وتصديرها إلى ملف excel لمزيد من التلاعب. قائمة المعلمات: مجال كروي الأساسية الأقسام في وقت = 0، مجال غزو خلايا متصلة بجسم كروي = الغزو الرئيسي, منطقة الخلايا المفصولة من منطقة الغزو الرئيسي، وعدد الخلايا المفصولة من منطقة الغزو الرئيسي، ومتوسط المسافة من غزو من الدمار لمركز كروي الأساسية إلى المحيط المنطقة الغزو الرئيسي والخلايا المنفصلة والمعلمة بعد الغزو الجماعي = د (د = √ ((س2 -س1)2 + (ص2 -ص1)2) من كتلة من مركز كروي X و Y تنسق، من قبل (س1، ص1) وبعد (س2، ص2) عملية الغزو الجماعي). وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم تحليل الصور مع غيرها من البرامج المتخصصة.
  6. فتح واجهة المستخدم الرسومية وتضغط على الزر "تحميل فرنك بلجيكي" . بعد فتح الصورة، ضبط معايير تجزئة (الحد الأدنى للحجم: > 1 ونصف قطرها إغلاق: > 1) تحقيقا لتجزئة دقيقة كروي ومنطقة الغزو، ثم اضغط الزر "المنطقة للفائدة (ROI) تجزئة" للتنفيذ و سوف تظهر حدود حول كل كروي. إذا كانت التجزئة التلقائية غير صحيحة، اضغط على الزر "حذف" أو "إضافة" وإجراء التصحيحات المطلوبة يدوياً. كرر نفس الخطوات للصور اللاحقة.
  7. اضغط على زر "تتبع" لعدد الماغنيسيوم والبرنامج سيقوم بتعيين نفس العدد لكل كروي في كل الصور انقضاء الوقت. ثم، اضغط الزر "القياس" ، الذي سيقوم بإنشاء جدول بيانات مع كافة المعلمات. حفظ جدول البيانات هذا كملف excel لاستخدام إضافية في معالجة النتائج والإحصاءات في برنامج أكسل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

همكا فريد التصوير لوحة يستخدم للمقايسة غزو من الماغنيسيوم الورم 3D. يتم إجراء فحص كامل، بدءاً بتشكيل كروي وتنتهي بعملية غزو والتلاعب إضافية، ضمن نفس لوحة. تشكيل كروي، خلايا هيلا يتم تحميلها في حوض الصفيف وتسوية في المائية الإشراف بالجاذبية. المائية الإشراف، التي لها خصائص المرفق تمسكا/منخفضة، وتيسير التفاعل خلية خلية وتشكيل الورم 3D الماغنيسيوم. يوضح الشكل 2 ألف الخلايا استقر في الإشراف، عقب استخدام 150 × 103 خلايا/مل تحميل الحل (أي.، ~ 16...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أنه تم توثيقه جيدا أن الكائنات الحية، تتميز بمنظمتهم متعددة الخلايا ثلاثي الأبعاد المعقدة متميزة تماما عن الخلايا أحادي الطبقة 2D استخداماً مثقف، وإذ تشدد على الحاجة الماسة إلى استخدام النماذج الخلوية التي تحاكي الوظائف أفضل وفحص عمليات الحي للمخدرات. ، الماغنيسيوم متعددة الثقافات أورجانوتيبيك وأورجانويدس وأجهزة على رقاقة في الآونة الأخيرة أدخلت8 لاستخدامها في اكتشاف الأدوية الموحدة. ومع ذلك، يهدد بالغة التعقيد نموذجية متعددة الخلايا 3D كثيرا متانة والموازاة وتحليل البيانات التي تعتبر حاسمة بالنسب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل وصية شمعون موشي وجوديث ويسبرودت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6 ألواح سفلية زجاجية صغيرة مع زجاج بئر صغير مقاس 14 مم # 1.5 غطاءزجاجي CellvisP06-14-1.5-Nألواح سفلية زجاجية تجارية تستخدم في نقش HMCA
نقطة انصهار منخفضة للغاية AgaroseInvitrogen16520100يتم تسخين محلول 6٪ agarose حتى 80 درجة ؛ C قبل الاستخدام ، يتم تسخين محلول 1٪ agarose إلى 37 درجة ؛ C
محلول التربسين EDTA Bالصناعات البيولوجية03-052-1Aتم تسخينه إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
DMEM المتوسط ، ارتفاع الجلوكوزالصناعات البيولوجية01-055-1Aدافئ إلى 37 درجة ؛ C قبل الاستخدام
مصل العجل الخاص لحديثي الولادة (NBCS)الصناعات البيولوجية04-122-1ADPBS معطل بالحرارة
(10x) ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيومالصناعات البيولوجية02-023-5Aيحفظ على الجليد قبل الاستخدام
هيدروكسيد الصوديوم ، اللامائيSigma-AldrichS5881-500Gيستخدم لتحضير محلول 1 M NaOH
Cultrex Type I الكولاجين من ذيل الفئران ، 5 مجم / ملTrevigen3440-100-01يحفظ على الجليد قبل الاستخدام
ملح الصوديوم بحمض الهيالورونيكSigma-AldrichH5542-10MGيحفظ على الجليد قبل الاستخدام
FisetinSigma-AldrichF505-100MGيضاف إلى وسط الاستزراع ، مثبط الغزو
DETA / NOEnzo Life Sciencesalx-430-014-m005يضاف إلى وسط الاستزراع ، المتبرع بأكسيد النيتريك
PISigma-AldrichP4170تستخدم بتركيز منخفض جدا دون الحاجة إلى غسل
كامل لمصباح الفيضانات Dymax 5000-EC مع درع خفيف و Dymax 400 Watt EC مزود الطاقةDymax CorporationPN 39823يستخدم لتعقيم لوحة HMCA بواسطة
مجهر IX81 المقلوبأوليمبوسيستخدم للحصول على الصور تلقائيا
حاضنة لخدماتتصوير الحياةالمجهرية ضرورية لتجارب الفاصل الزمني مع الحصول على الصور ، معدلة مسبقا إلى 37 درجة ؛ C ، 5٪ CO2< / sub> والحفاظ على جو رطب
المرحلة الآلية Sub-micron SCAN-IMMarzhauser Wetzlar GmbHتستخدم لتحديد مناطق الحصول على الصور مسبقا ، للحصول على الصور تلقائيا
14 بت ، ORCA II C4742-98 كاميرا مبردةHamamatsu Photonicsحساسة للغاية ، تستخدم لتصوير
مكعب مرشح الفلورسنت للكشف عن PIشركة Chroma Technologyمواصفات مكعب المرشح: مرشح الإثارة 530-550 نانومتر ، مرآة ثنائية اللون بطول 565 نانومتر ومرشح انبعاث 600-660 نانومتر
برنامج التشغيل Olympus Cell ^ Pبرنامج أوليمبوسالمستخدم للتحكم في المجهر والمرحلة الآلية والكاميرا والحصول على الصور
التحليل Matlab R2014BMathworksيستخدم لتطوير واجهة مستخدم رسومية داخلية لتحليل
الصور برنامج ExcelMicrosoftتستخدم لإدارة البيانات والحساب وإنشاء المؤامرة والإحصائيات
نظام للأشعة فوق البنفسجية نوع Corporation برنامج

المراجع

  1. Guan, X. Cancer metastases: challenges and opportunities. Acta pharmaceutica Sinica. B. 5 (5), 402-418 (2015).
  2. Sapudom, J., et al. The phenotype of cancer cell invasion controlled by fibril diameter and pore size of 3D collagen networks. Biomaterials. 52, 367-375 (2015).
  3. Portillo-Lara, R., Annabi, N. Microengineered cancer-on-a-chip platforms to study the metastatic microenvironment. Lab on a chip. 16 (21), 4063-4081 (2016).
  4. Gkountela, S., Aceto, N. Stem-like features of cancer cells on their way to metastasis. Biology Direct. 11 (1), 33(2016).
  5. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 752 (1), 10-24 (2013).
  6. Guzman, A., Sánchez Alemany, V., Nguyen, Y., Zhang, C. R., Kaufman, L. J. A novel 3D in vitro metastasis model elucidates differential invasive strategies during and after breaching basement membrane. Biomaterials. 115, 19-29 (2017).
  7. Lee, E., Song, H. -H. G., Chen, C. S. Biomimetic on-a-chip platforms for studying cancer metastasis. Current opinion in chemical engineering. 11, 20-27 (2016).
  8. Mittler, F., Obeïd, P., Rulina, A. V., Haguet, V., Gidrol, X., Balakirev, M. Y. High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  9. Evensen, N. A., et al. Development of a High-Throughput Three-Dimensional Invasion Assay for Anti-Cancer Drug Discovery. PLoS ONE. 8 (12), e82811(2013).
  10. Aw Yong, K. M., Li, Z., Merajver, S. D., Fu, J. Tracking the tumor invasion front using long-term fluidic tumoroid culture. Scientific Reports. 7 (1), 10784(2017).
  11. Mi, S., et al. Microfluidic co-culture system for cancer migratory analysis and anti-metastatic drugs screening. Scientific Reports. 6 (1), 35544(2016).
  12. Chung, S., Sudo, R., Mack, P. J., Wan, C. -R., Vickerman, V., Kamm, R. D. Cell migration into scaffolds under co-culture conditions in a microfluidic platform. Lab on a chip. 9 (2), 269-275 (2009).
  13. Krakhmal, N. V., Zavyalova, M. V., Denisov, E. V., Vtorushin, S. V., Perelmuter, V. M. Cancer Invasion: Patterns and Mechanisms. Acta naturae. 7 (2), 17-28 (2015).
  14. Lintz, M., Muñoz, A., Reinhart-King, C. A. The Mechanics of Single Cell and Collective Migration of Tumor Cells. Journal of Biomechanical Engineering. 139 (2), 21005(2017).
  15. Afrimzon, E., et al. Hydrogel microstructure live-cell array for multiplexed analyses of cancer stem cells, tumor heterogeneity and differential drug response at single-element resolution. Lab on a Chip. 16 (6), 1047-1062 (2016).
  16. Shafran, Y., et al. Nitric oxide is cytoprotective to breast cancer spheroids vulnerable to estrogen-induced apoptosis. Oncotarget. 8 (65), 108890-108911 (2017).
  17. Sato, H., Idiris, A., Miwa, T., Kumagai, H. Microfabric Vessels for Embryoid Body Formation and Rapid Differentiation of Pluripotent Stem Cells. Scientific Reports. 6 (1), 31063(2016).
  18. Lee, K., et al. Gravity-oriented microfluidic device for uniform and massive cell spheroid formation. Biomicrofluidics. 6 (1), 14114(2012).
  19. Zaretsky, I., et al. Monitoring the dynamics of primary T cell activation and differentiation using long term live cell imaging in microwell arrays. Lab on a Chip. 12 (23), 5007(2012).
  20. Khan, N., Syed, D. N., Ahmad, N., Mukhtar, H. Fisetin: a dietary antioxidant for health promotion. Antioxidants & redox signaling. 19 (2), 151-162 (2013).
  21. Lee, G. H., et al. Networked concave microwell arrays for constructing 3D cell spheroids. Biofabrication. 10 (1), 15001(2017).
  22. Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. Journal of visualized experiments: JoVE. (99), e52686(2015).
  23. Toh, Y. -C., Raja, A., Yu, H., van Noort, D. A 3D Microfluidic Model to Recapitulate Cancer Cell Migration and Invasion. Bioengineering. 5 (2), 29(2018).
  24. Sugimoto, M., Kitagawa, Y., Yamada, M., Yajima, Y., Utoh, R., Seki, M. Micropassage-embedding composite hydrogel fibers enable quantitative evaluation of cancer cell invasion under 3D coculture conditions. Lab on a Chip. 18 (9), 1378-1387 (2018).
  25. Yamamoto, S., Hotta, M. M., Okochi, M., Honda, H. Effect of Vascular Formed Endothelial Cell Network on the Invasive Capacity of Melanoma Using the In Vitro 3D Co-Culture Patterning Model. PLoS ONE. 9 (7), e103502(2014).
  26. Lee, S. -H., Moon, J. J., West, J. L. Three-dimensional micropatterning of bioactive hydrogels via two-photon laser scanning photolithography for guided 3D cell migration. Biomaterials. 29 (20), 2962-2968 (2008).
  27. Gschwind, A., Zwick, E., Prenzel, N., Leserer, M., Ullrich, A. Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene. 20 (13), 1594-1600 (2001).
  28. Jiang, K., Dong, C., Xu, Y., Wang, L. Microfluidic-based biomimetic models for life science research. RSC Advances. 6 (32), 26863-26873 (2016).
  29. Mason, B. N., Starchenko, A., Williams, R. M., Bonassar, L. J., Reinhart-King, C. A. Tuning three-dimensional collagen matrix stiffness independently of collagen concentration modulates endothelial cell behavior. Acta biomaterialia. 9 (1), 4635-4644 (2013).
  30. Raub, C. B., Putnam, A. J., Tromberg, B. J., George, S. C. Predicting bulk mechanical properties of cellularized collagen gels using multiphoton microscopy. Acta Biomaterialia. 6 (12), 4657-4665 (2010).
  31. Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
  32. Rao, S. S., DeJesus, J., Short, A. R., Otero, J. J., Sarkar, A., Winter, J. O. Glioblastoma Behaviors in Three-Dimensional Collagen-Hyaluronan Composite Hydrogels. ACS Applied Materials & Interfaces. 5 (19), 9276-9284 (2013).
  33. Kreger, S. T., Voytik-Harbin, S. L. Hyaluronan concentration within a 3D collagen matrix modulates matrix viscoelasticity, but not fibroblast response. Matrix Biology. 28 (6), 336-346 (2009).
  34. Chanmee, T., Ontong, P., Itano, N. Hyaluronan: A modulator of the tumor microenvironment. Cancer Letters. 375 (1), 20-30 (2016).
  35. Zhao, Y., et al. Modulating Three-Dimensional Microenvironment with Hyaluronan of Different Molecular Weights Alters Breast Cancer Cell Invasion Behavior. ACS Applied Materials & Interfaces. 9 (11), 9327-9338 (2017).
  36. Wu, M., et al. A novel role of low molecular weight hyaluronan in breast cancer metastasis. The FASEB Journal. 29 (4), 1290-1298 (2015).
  37. Fisher, G. J. Cancer resistance, high molecular weight hyaluronic acid, and longevity. Journal of cell communication and signaling. 9 (1), 91-92 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تكوين الكريات الورميةتحليل المصفوفة خارج الخلويةتأثير حمض الهيالورونيكالمعالجة بالفيسيتينتنشيط أكسيد النيتريكالتصوير بالفاصل الزمنيدقة العنصر الواحد
تحليل لغزو خلايا السرطان والمنتشر لمكافحة المخدرات فحص استخدام صفيف المائية الصغيرة-الدائرة (همكا)-على أساس لوحات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.