Method Article

والرمات التدفق الخلوي مع الخلية الفلورسنت المتوازية لخلية واحدة فقط مما يشير إلى تحليل واكتشاف العلامات البيولوجية

DOI:

10.3791/58386

⸱

October 4th, 2018

1Centre for Molecular Medicine Norway (NCMM), Nordic EMBL Partnership, University of Oslo, 2K. G. Jebsen Centre for B cell malignancies and K. G. Jebsen Centre for Cancer Immunotherapy, University of Oslo

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد هنا، بروتوكولا لتحليل الإنتاجية متوسطة إلى عالية البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي. والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مما يشير إلى الخلية الشاذة يلعب دوراً محوريا في تطوير السرطان والتقدم. العلاجات المستهدفة الأكثر رواية الواقع توجه البروتينات ووظائف البروتين، والانحرافات مما يشير إلى الخلية قد ذلك بمثابة المؤشرات الحيوية للإشارة إلى خيارات العلاج شخصية. بدلاً من إجراء تحليلات الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، تقييم التغيرات في نشاط البروتين يمكن أكثر كفاءة الآليات الكامنة وراء حساسية العقاقير والمقاومة. والرمات التدفق الخلوي هو تقنية قوية أن التدابير البروتين الفسفرة الأحداث على المستوى الخلوي، من السمات هامة التي تميز هذا الأسلوب من النهج القائم على جسم الأخرى. يسمح الأسلوب التحليل المتزامن للبروتينات إشارات متعددة. في تركيبة مع الخلية الفلورسنت المتوازية، أكبر مجموعات البيانات متوسطة إلى عالية الإنتاجية يمكن اكتسابها من خلال الأجهزة سيتوميتير قياسية في وقت قصير. وقد والرمات التدفق الخلوي التطبيقات في دراسات البيولوجيا الأساسية والبحوث السريرية، بما في ذلك إشارات العلامات البيولوجية اكتشاف وتحليل وتقييم الدوائية. هنا، يتم توفيرها بروتوكول تجريبي مفصلة لتحليل تدفق والرمات الخلايا وحيدات النوى تنقية الدم المحيطي، واستخدام خلايا اللوكيميا اللمفاوية المزمنة كمثال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والرمات التدفق الخلوي تستخدم لتحليل مستويات البروتين الفسفرة في القرار خلية واحدة. والهدف العام للأسلوب لتعيين أنماط الإشارات الخلوية تحت شروط محددة. باستغلال قدرة التدفق الخلوي مولتيباراميتير، يمكن تحليل مسارات إشارات عديدة في نفس الوقت في مجموعات فرعية مختلفة من السكان خلية غير المتجانسة مثل الدم المحيطي. هذه الصفات توفر مزايا أكثر من غيرها من التكنولوجيات المستندة إلى جسم مثل إيمونوهيستوتشيميستري والمرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم (ELISA)، ومصفوفة البروتين والمرحلة عكس البروتين الصفيف (ربا)1. والرمات التدفق الخلوي يمكن دمجها مع خلية الفلورسنت المتوازية (FCB)، مما يعني أن عينات الخلايا الفردية المسماة توقيعاً فريداً من الأصباغ الفلورية حيث أنه يمكن مختلطة معا والملون وتحليلها ك عينة واحدة2. هذا يقلل من استهلاك جسم ويزيد من متانة البيانات من خلال المزيج من عينات المعالجة والمراقبة، ويعزز سرعة اكتساب. يمكن تقسيم عينات أصغر السكان FCB مجتمعة وملطخة بأجسام محددة والرمات متميزة تصل إلى 35، اعتماداً على مقدار ابتداء من المواد. يمكن، وبالتالي، تشغيل التجارب التنميط كبيرة مع الأجهزة سيتوميتير القياسية. وطبق والرمات التدفق الخلوي للشخصية مما يشير إلى مسارات في عينات المرضى من عدة سرطانات الدم، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL)3،،من45، سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) 6 وغير هودجكين الأورام الليمفاوية7. وهكذا والرمات التدفق الخلوي نهج قوية لتميز إشارات الانحرافات وتحديد والتحقق من صحة المؤشرات الحيوية، وتقييم الدوائية.

هنا، يتم توفيرها في بروتوكول الأمثل لتحليل عينات المرضى CLL حسب والرمات التدفق الخلوي (الشكل 1A). وترد أمثلة لتوصيف إشارات القاعدية، وتحفيز مستقبلات الخلية المضادة IgM/ب واضطراب المخدرات. ويرد وصف مفصل لمصفوفة FCB. البروتوكول يمكن بسهولة أن تتكيف مع سائر أنواع الخلايا تعليق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وردت عينات الدم بعد الموافقة الخطية من جميع الجهات المانحة. تمت الموافقة على الدراسة من "اللجنة الإقليمية" للطب وأخلاقيات البحوث الصحية في النرويج جنوب شرق، وقد أجريت بحوث على دم الإنسان وفقا "إعلان هلسنكي"8.

ملاحظة: ينبغي إجراء الخطوات من 1 إلى 3 تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة.

1-عزل خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) من عينات دم المريض CLL

تنبيه: ينبغي التعامل معها الدم البشري وفقا للأنظمة المتعلقة بالسلامة الأحيائية المستوى 2.

  1. تمييع الدم 1:1 مع الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني: 136.9 ملم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، 10.1 ملم Na2هبو4 x 2 ح2س، 1.8 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة 7.4) ونقل إلى أنابيب 50 مل (30 مل في الأنبوب).
  2. عناية طبقة 10 مل من كثافة متوسطة متدرجة (مثلاً، ليمفوبريب) إلى الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام ماصة 10 مل.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. الآن مرئية ببمكس على رأس الطبقة المتوسطة الكثافة التدرج.
  4. استخدام ماصة باستور نقل الخلايا إلى اثنين من أنابيب 50 مل جديدة. تغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني (ملء الأنابيب).
  5. الطرد المركزي في 350 x ز عن 15 دقيقة تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 3 مل من برنامج تلفزيوني.
  6. عد الخلايا باستخدام أسلوب مفضل.
  7. الطرد المركزي الخلايا في ز 350 x لأدنى 5 تجاهل المادة طافية. ملاحظة: خطوات 1.8 إلى 3.2 اختيارية. فمن الممكن الانتقال مباشرة إلى الخطوة 3، 3.
  8. ريسوسبيند الخلايا في الجنين المصل البقري (FBS) وتستكمل مع 10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) وتجميد لأسفل في مختبرين مناسبة باستخدام أنابيب البرد.
    ملاحظة: [دمس] السامة للخلايا. العمل السريع بمجرد الخلايا مختلطة مع FBS/[دمس]. يمكن أن تكون الخلايا المخزنة طويلة الأجل في النتروجين السائل.

2-ذوبان الجليد من الخلايا

  1. سرعة ذوبان الخلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: [دمس] السامة للخلايا. العمل بسرعة للحد من التعرض إلى [دمس].
  2. تغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من البرد روزويل بارك التذكاري المعهد المتوسطة (1640 RPMI مع جلوتاماكس تكميلية، انظر الجدول للمواد).
  3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  4. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع بيروفات الصوديوم، الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM والبنسلين/ستربتوميسين (أضيف في تمييع 1 x وفقا لتعليمات) و 10% FBS. نقل الخلايا إلى قارورة ثقافة زنزانة صغيرة وترك في حاضنة في 5% CO2, 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح للخلايا لمعايرة.

3-إعداد الخلايا

  1. عد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام أسلوب مفضل.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  3. ريسوسبيند الخلايا في المتوسط RPMI 1640 (الخطوة 2، 2) وتستكمل مع 1% FBS أن لا يزيد عن 50 × 106 خلايا/مل.
  4. تحويل المبلغ المطلوب من تعليق خلية للآبار في صفيحة الخامس-أسفل جيدا 96.
    ملاحظة: يتوافق مع عدد من الآبار لعدد الشروط لفحصها. عينات لدورة وقت تحفيز مستمدة من بئر واحدة. حساب 50 ميليلتر عينة كل الوقت-نقطة + 50 ميليلتر من حجم القتلى. حفظ العينات لضوابط التعويض (عينة واحدة أونستاينيد + عينة واحدة كل صبغ المتوازية).
  5. نقل لوحة جيدا 96 إلى حمام مائي ساخن قبل 37 درجة مئوية. بقية الخلايا لمدة 10 دقائق.

4-التحفيز والتثبيت للخلايا

ملاحظة: نفذ الخطوات 4-8 على مقاعد البدلاء المختبر (أي غير معقمة).

تنبيه: المكون الرئيسي "إصلاح المخزن المؤقت" هو بارافورمالدهيد، سمية (الاتصال بالاستنشاق والجلد). التعامل مع الرعاية.

  1. إعداد لوحة الخامس-أسفل جيدا 96 مع 60 ميليلتر من "المخزن المؤقت لإصلاح" أنا كل بئر كل عينة. ترك في حمام الماء 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الخلايا: وينبغي إصلاح المخزن المؤقت 1:1. من أجل السماح للتبخر في 37 درجة مئوية، المخزن المؤقت الإصلاح في البداية بوفرة.
  2. بشكل اختياري، علاج الخلايا مع المخدرات قبل التحفيز.
  3. نقل عينة مراقبة 50 ميليلتر للوحة الإصلاح. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  4. اختيارياً، ابدأ تحفيز الوقت-الدورة بإضافة 10 ميكروغرام/مل المضادة-IgM للخلايا. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
  5. نقل عينة ميليلتر 50 لوحة الإصلاح في كل وقت نقطة. مزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: مكافحة--IgM الناجمين عن إشارة يتم عادة البدء المبكر (بالدقائق).
  6. اترك لوحة الإصلاح في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد إضافة النموذج الأخير.

5. الخلية فلوري المتوازية (FCB)

ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على قائمة الكواشف المتوازية.

  1. تغسل الخلايا الثابتة 3 x مع برنامج تلفزيوني (ملء الآبار).
  2. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  3. إعداد لوحة الخامس-أسفل جيدا 96 مع الكواشف المتوازية. بيبيت 5 ميليلتر لكل كاشف المتوازية الواحدة وكذلك في عدد التركيبات اللازمة لوصمة عار جميع العينات بعد المصفوفة المصبوغة، مثلاً، في الشكل 1B. وسيكون كل عينة بمزيج فريد من تركيزات مختلفة المتوازية.
  4. ريسوسبيند الخلايا في 190 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل إلى لوحة المتوازية. مزيج دقيق.
    ملاحظة: وصمة عار عينة التعويض واحدة مع أعلى تركيز النهائية المستخدمة لكل كاشف المتوازية وحفظ عينة أونستينيد واحدة.
  5. ترك الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
  6. تغسل الخلايا الملون 2 x مع تدفق يغسل (برنامج تلفزيوني، 1% FBS، أزيد الصوديوم 0.09 في المائة) (تملأ الآبار).
  7. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  8. إضافة ميليلتر 190 من تدفق المياه والصرف الصحي إلى الخلايا والجمع بين العينات المراقب في أنبوب 15 مل واحد. نقل كل عنصر تحكم التعويض إلى أنبوب مل 1.7 منفصلة.
  9. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.

6-خلية Permeabilization لتلطيخ مستضد داخل الخلايا

تنبيه: هو المكون الرئيسي الثالث المخزن المؤقت بيرم الميثانول السامة (الاتصال بالاستنشاق والجلد) والقابلة للاشتعال. التعامل مع الرعاية.

  1. نقل 2 مل بيرم المخزن المؤقت الثالث إلى أنبوب 15 مل. ترك في-20 درجة مئوية حيث يكون الجليد عند الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن أن يترك "المخزن المؤقت بيرم" في-20 درجة مئوية من البدء التجربة.
  2. إضافة 1.5 مل من "المخزن المؤقت بيرم" المثلج للسكان خلية المراقب (في أنبوب 15 مل) و 100 ميليلتر لكل عنصر تحكم التعويض (في أنابيب 1.7 مل) دروبويسي أثناء فورتيكسينج لتجنب أن الخلايا تتجمع معا.
  3. نقل الخلايا مباشرة إلى-80 درجة مئوية. إجازة لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: ومن الطبيعي أن إيقاف التجربة في هذه المرحلة. يمكن أن تكون الخلايا الموجودة في "المخزن المؤقت بيرم" المدى البعيد المخزنة في-80 درجة مئوية.

7-جسم تلطيخ

ملاحظة: انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة من الأجسام المضادة والرمات محددة المبلغ عنها.

  1. نقل الخلايا من-80 درجة مئوية إلى مربع من الجليد.
  2. أغسل 3 x مع تدفق المياه والصرف الصحي.
    ملاحظة: من المهم إضافة تدفق المياه والصرف الصحي في الزائدة لرؤية بيليه الخلية، مثلاً، أضف 3 مل يغسل تدفق السكان خلية المراقب و 1 مل لكل عنصر تحكم التعويض.
  3. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
  4. ريسوسبيند السكان خلية المراقب في حجم تدفق المياه والصرف الصحي، مما يسمح 25 ميليلتر من تعليق خلية في جسم والرمات وصمة عار. ريسوسبيند ضوابط التعويض في 200 ميليلتر من تدفق المياه والصرف الصحي.
  5. إعداد الأجسام المضادة لتلطيخ في صفيحة الخامس-أسفل جيدا 96. ستكون وحدة التخزين النهائي 50 ميليلتر/جيدا. كل بئر، إضافة جسم والرمات محددة تضعف في تدفق المياه والصرف الصحي إلى وحدة تخزين نهائي من 10 ميليلتر، علامة السطحية المخفف في تدفق المياه والصرف الصحي إلى وحدة تخزين نهائي من 15 ميليلتر، و 25 ميليلتر من تعليق خلية.
    ملاحظة: وينبغي أن تكون تيتراتيد تخفيف جسم قبل التجربة. وتشمل مراقبة ايستب.
  6. ترك الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، في الظلام.
  7. تغسل الخلايا الملون 2 x مع تدفق المياه والصرف الصحي (ملء الآبار).
  8. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ز للحد الأدنى 5 تجاهل المادة طافية.
  9. ريسوسبيند الخلايا في 150 ميليلتر من تدفق المياه والصرف الصحي.

8-إعداد ضوابط التعويض

  1. إعداد ضوابط التعويض عن فلوروتشروميس جسم مترافق بالتوازي مع تلطيخ جسم. استخدم الخرز التعويض وفقا للإرشادات الخاصة بالمورد.

9. التدفق الخلوي التحليل

ملاحظة: يمكن تشغيل هذه التجربة على سيتوميتير تدفق مع العينات الإنتاجية العالية (HTS).

  1. تحسين الجهد (PMT) أنبوب ضوئي مع عنصر التحكم أونستاينيد.
  2. تشغيل عناصر التعويض وحساب مصفوفة التعويض.
  3. تشغيل عينات. ينبغي أن يكون معدل الأحداث وفقا لمواصفات الصك.

10-النابضة الاستراتيجية وتحليل البيانات

  1. استيراد ملفات FCS من التجربة لبرمجيات تحليل تدفق الخلوي مثل فلووجو أو سيتوبانك (https://cellmass.cytobank.org).
  2. استراتيجية النابضة
    1. حدد الخلايا الليمفاوية بالتآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل منتدى التعاون الأمني-A في مؤامرة دوت كثافة.
    2. عرض الخلايا الليمفاوية وحدد نوع من التآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل منتدى التعاون الأمني-جورج
    3. عرض الخلايا المفردة وبوابة نوع الخلية بالتآمر بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل علامة السطحية.
    4. عرض السكان نوع الخلية في "المحيط الهادئ الأزرق" مقابل مؤامرة كثافة SSC-أ وحدد استناداً على "المحيط الهادئ الأزرق" تلطيخ كثافة السكان FCB مختلفة (انظر الشكل 1A).
    5. ارسم القناة جسم والرمات ضد القناة FCB، أو heatmap (انظر الشكل 1A) لعرض أحداث الفسفرة.
  3. حساب معكوس الجيب الزائدي (أركسينه) لمؤسسة مونتانيار (متوسط شدة الفلورسنت) إشارة والرمات مقابل ايستب عنصر التحكم باستخدام إشارات والرمات (المستويات القاعدية الفسفرة، انظر الشكل 1)، أو لحفز مقابل خلية أونستيمولاتيد السكان (انظر الشكل 1E).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الرئيسية للبروتوكول والرمات التدفق الخلوي موضحة في الشكل 1A. في المثال المقدم، كانت ملطخة الخلايا CLL الكاشف المتوازية "الأزرق المحيط الهادئ" في تخفيف الأربعة. يمكن أن يؤديها ثلاثي الأبعاد المتوازية من خلال الجمع بين الثلاثة المتوازية الأصباغ، كما هو مبين في الشكل 1 باء. ثم يتم ديكونفولوتيد العينات الفردية التي النابضة اللاحقة على كل المتوازية كاشف مقابل SSC-A (الشكل 1). وترد معلومات...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والرمات التدفق الخلوي تقنية قوية لقياس مستويات البروتين الفسفرة في الخلايا المفردة. نظراً للأسلوب يعتمد على تلطيخ مع الأجسام المضادة، والرمات التدفق الخلوي يحد من توافر الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، بغية الحصول على نتائج موثوقة، جميع الأجسام المضادة معاير وينبغي التحقق منها قبل الاستخدام. بروتوكول مفصل لمعايرة الأضداد الخاصة والرمات وقد وصفت في مكان آخر من12. أثناء تصميم لوحة، النظر في نسبة الإشارة إلى الضوضاء أمر بالغ الأهمية. في المثال المقدم، كانت مترافق أجسام والرمات كافة إلى 647 فلور أليكس...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل أجرى في المختبر للبروفيسور كيتيل Taskén، وأيدته الجمعية النرويجية لمكافحة السرطان، وكريستيان ستيفتيلسين جيرهارد Jebsen. يوهانس لاندسكرون وانجار ماريان معترف بها لقراءة نقدية من المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 GlutaMAXThermoFisher Scientific61870-010زراعة الخلايا المتوسطة
مصل الأبقار الجنينيةThermoFisher Scientific10270169المضاف إلى وسط زراعة
بيروفات الصوديومThermoFisher Scientific11360-039مادة مضافة لزراعة الخلايا
المتوسطة MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةThermoFisher Scientific11140-035مادة مضافة لوسط زراعة الخلايا
LymphoprepAlere Technologies AS1114547كثافة التدرج المتوسط
المضادة ل IgMSouthern Biotech2022-01لتحفيز مستقبلات الخلايا البائية
BD Phosflow Fix Buffer IBD557870Tتثبيت
Buffer BD Phosflow Perm Buffer IIIBD558050النفاذية عازلة
Alexa Fluor 488 5-TFPThermoFisher ScientificA30005كاشف الترميز الشريطي
المحيط الهادئ الأزرق Succinimidyl EsterThermoFisher ScientificP10163كاشف الترميز الشريطي
Orange Succinimidyl Ester ، ملح ثلاثي إيثيل الأمونيومThermoFisher ScientificP30253كاشف الترميز الشريطي
تعويضالخرزمحدد من قبل المستخدم < / em>الأنواع الصحيحة أنابيب الصقر التفاعلية
< م > محددة من قبل المستخدم < / م >
أنابيب إيبندورف<م > محددة من قبل المستخدم < / em>
96 جيدا V-bottomلوحات < م > محددة من قبل المستخدم < / em >متوافق مع
أجهزة الطرد المركزيالخلوي < م > معرفها المستخدم < / em >لأنابيب Eppendorf وأنابيب وألواح Falcon
حمام مائيمحدد بواسطة المستخدم < / em>الخلوي المنظم لدرجة
الحرارة المحدد من قبل المستخدم < / em>مع جهاز أخذ العينات عالي الإنتاجية (HTS)
nameCompanyCatalog NumberComments
< قوية > مستضد < / قوي >
AKT (pS473) تقنياتإشارات الخلية4075< قوي > استنساخ: < / قوي> D9E
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al. ، 2016 ، مثبطات الطحال التيروزين كيناز تقلل من & Haematologica, 101(2): e59-62
Skå nland et al., 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الوضع الطبيعي والمحول ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
ATF-2 (pT71)سانتا كروز للتكنولوجيا الحيويةsc-8398clone: < / strong> F-1
المرجع: < / قوي> Skå nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 بطانة مسببة للالتهابات ؛ hellip ؛ ، Arterioscler Thromb Vasc Biol ، 33 (2): e47-55
BLNK (pY84) BecktonDickinson Pharmingen558443Clone: < / strong> J117-1278
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al. ، 2016 ، مثبطات الطحال التيروزين كيناز تقلل &hellip ؛ ، Haematologica ، 101 (2): e59-62
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الحالة الطبيعية والمحولة ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ ، الدم ، 129 (6): 759-770
Btk (pY223) / Itk (pY180)بيكتون ديكنسون فارمينجن564846clone: < / strong> N35-86
المرجع: < / قوي> Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ الدم ، 129 (6): 759-770
Btk (pY551) بيكتونديكنسون فارمينجن558129<قوي>استنساخ: < / قوي> 24a / BTK (Y551)  
المرجع: < / قوي> كالاند وآخرون ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الوضع الطبيعي والمحول ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
Btk (pY551) / Itk (pY511) بيكتونديكنسون فارمينجن558134clone: < / strong> 24a / BTK (Y551)  
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al. ، 2016 ، مثبطات الطحال التيروزين كيناز تقلل &hellip ؛ ، Haematologica ، 101 (2): e59-62
CD3 & zeta. (ص 142)بيكتون ديكنسون فارمينجن558489<قوي>استنساخ: < / قوي> K25-407.69
المرجع: < / قوي> Skå nland et al., 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Histone H3 (pS10)إشارات الخلية9716Clone: < / strong> D2C8
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، توصيف الخلية المفردة لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
I & kappa. ب & ألفاتقنيات إشارات الخلية5743clone: < / strong> L35A5
المرجع: < / قوي> Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ ، الدم ، 129 (6): 759-770
LAT (pY171)بيكتون ديكنسون فارمينجن558518استنساخ: < / قوي> I58-1169
المرجع: < / قوي> Skå nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through CD2 و CD28 …, Biochem J, 460(3):399-410
Lck (pY505)BecktonDickinson Pharmingen558577Clone: 4/LCK-Y505 
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، توصيف الخلية المفردة لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
MEK1 (pS298) بيكتونديكنسون فارمينجن560043<قوي>استنساخ: < / قوي> J114-64
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، توصيف الخلية المفردة لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Skå ؛ nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through the CD2 و CD28…, Biochem J, 460(3):399-410
NF-κ ب ص 65 (pS529)بيكتون ديكنسون فارمينجن558422<قوي>استنساخ: < / قوي> K10-895.12.50
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Skå ؛ nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & hellip ؛ ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الوضع الطبيعي والمحول ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 البطانة المسببة للالتهابات ؛ 33 (2): e47-55
NF- & kappa ؛ B p65 (pS536)تقنيات إشارات الخلية4887clone: < / strong> 93H1
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Skå ؛ nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & hellip ؛ ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الوضع الطبيعي والمحول ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
p38 MAPK (pT180 / Y182) تقنياتإشارات الخلية4552Clone: < / قوي> 28B10
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، توصيف الخلية المفردة لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget، 9 (10): 9273-9284
Skå. nland et al., 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 &hellip ؛ ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 البطانة المسببة للالتهابات ؛ hellip ؛ ، Arterioscler Thromb Vasc Biol ، 33 (2): e47-55
p44 / 42 MAPK (pT202 / Y204) تقنياتإشارات الخلية4375< قوي > استنساخ: < / قوي> E10
<قوي>المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al. ، 2016 ، مثبطات الطحال التيروزين كيناز تقلل &hellip ؛ ، Haematologica ، 101 (2): e59-62
Skå nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & hellip ؛ ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الوضع الطبيعي والمحول ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 البطانة المسببة للالتهابات ؛ 33 (2): e47-55
p53 (pS15) تقنياتإشارات الخليةNNClone: < / قوي> 16G8
المرجع: < / قوي> الأيرلندية وآخرون ، 2007 ، تكرار Flt3 Y591 والإفراط في التعبير Bcl-2 ؛ hellip ؛ ، الدم ، 109 (6): 2589-96
p53 (pS20) تقنياتإشارات الخليةNNclone: < / strong> متعدد النسيلة
المرجع: < / قوي> الأيرلندية وآخرون ، 2007 ، ازدواجية Flt3 Y591 و Bcl-2 overexpression &hellip ؛ ، الدم ، 109 (6): 2589-96
p53 (pS37) تقنياتإشارات الخليةNNClone: < / قوي> متعدد النسيلة
المرجع: < / قوي> الأيرلندية وآخرون ، 2007 ، ازدواجية Flt3 Y591 والإفراط في التعبير Bcl-2 &hellip ؛ ، الدم ، 109 (6): 2589-96
p53 (pS46) تقنياتإشارات الخليةNNاستنساخ: < / قوي> متعدد النسيلة
المرجع: < / قوي> الأيرلندية وآخرون ، 2007 ، ازدواجية Flt3 Y591 و Bcl-2 overexpression &hellip ؛ ، الدم ، 109 (6): 2589-96
p53 (pS392) تقنياتإشارات الخليةNN<قوي>استنساخ: < / قوي> متعدد النسيلة
<قوي>المرجع: < / قوي> الأيرلندية وآخرون ، 2007 ، ازدواجية Flt3 Y591 و Bcl-2 overexpression &hellip ؛ ، الدم ، 109 (6): 2589-96
PLC & gamma ؛ 2 (pY759)بيكتون ديكنسون فارمينجن558498<قوي>استنساخ: < / قوي> K86-689.37
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ ، الدم ، 129 (6): 759-770
Rb (pS807 / pS811) بيكتونديكنسون فارمينجن558590<قوي > استنساخ: < / قوي> J112-906
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 البطانة المسببة للالتهابات ؛ الشرايين كلبر الجمد الوعائي Biol ، 33 (2): e47-55
S6-Ribos. Prot. (pS235 / 236)تقنيات إشارات الخلية4851Clone: < / قوي> D57.2.2E
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
SAPK / JNK (pT183 / Y185) تقنياتإشارات الخلية9257clone: < / strong> G9
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Pollheimer et al. ، 2013 ، يقود Interleukin-33 البطانة المسببة للالتهابات & hellip ؛ ، Arterioscler Thromb Vasc Biol ، 33 (2): e47-55
SLP76 (pY128) بيكتونديكنسون فارمينجن558438clone: < / قوي> J141-668.36.58 
المرجع: < / قوي> Skå ؛ nland et al., 2014, T-cell co-stimulation through CD2 و CD28 & hellip;, Biochem J, 460(3):399-410
STAT1 (pY701)Beckton Dickinson Pharmingen612597Clone: 4a 
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ ، الدم ، 129 (6): 759-770
STAT3 (pY705) بيكتونديكنسون فارمينجن557815<قوي>استنساخ: < / قوي> 4 / P-STAT3
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
STAT4 (pY693) Zymed/ ThermoFisher Scientific71-7900Clone: < / قوي> متعدد النسيلة
المرجع: < / قوي> Uzel وآخرون ، 2001 ، الكشف عن STAT-4 الفسفوري داخل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، Clin Immunol ، 100 (3): 270-6
STAT5 (pY694)بيكتون ديكنسون فارمينجن612599Clone: < / قوي> 47 / Stat5 (pY694)
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Skå. nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ ، الدم ، 129 (6): 759-770
STAT6 (pY641) بيكتونديكنسون فارمينجن612601clone: < / قوي> 18 / P-Stat6
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
SYK (pY525 / Y526)إشارات الخلية12081clone: < / strong> C87C1
المرجع: < / قوي> Myhrvold et al. ، 2018 ، التنميط أحادي الخلية لمستويات بروتين الفوسفو في ..، Oncotarget ، 9 (10): 9273-9284
Parente-Ribes et al. ، 2016 ، مثبطات الطحال التيروزين كيناز تقلل &hellip ؛ ، Haematologica ، 101 (2): e59-62
ZAP70 / SYK (pY319 / Y352)بيكتون ديكنسون فارمينجن557817<قوي>استنساخ: < / قوي> 17A / P-ZAP70
المرجع: < / قوي> Skå nland et al. ، 2014 ، التحفيز المشترك للخلايا التائية من خلال CD2 و CD28 & hellip ؛ ، Biochem J ، 460 (3): 399-410
Kalland et al. ، 2012 ، تعديل الإشارات القريبة في الحالة الطبيعية والمحولة ؛ ، Exp Cell Res، 318 (14): 1611-9
Myklebust et al. ، 2017 ، أنماط مميزة لإشارات مستقبلات الخلايا البائية في & hellip ؛ الدم ، 129 (6): 759-770
الخلايا Pacific لمقياس التدفق مقياس التدفق تقنيات تقنيات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lu, Y., et al. Using reverse-phase protein arrays as pharmacodynamic assays for functional proteomics, biomarker discovery, and drug development in cancer. Seminars in Oncology. 43 (4), 476-483 (2016).
  2. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nature Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  3. Myhrvold, I. K., et al. Single cell profiling of phospho-protein levels in chronic lymphocytic leukemia. Oncotarget. 9 (10), 9273-9284 (2018).
  4. Parente-Ribes, A., et al. Spleen tyrosine kinase inhibitors reduce CD40L-induced proliferation of chronic lymphocytic leukemia cells but not normal B cells. Haematologica. 101 (2), e59-e62 (2016).
  5. Blix, E. S., et al. Phospho-specific flow cytometry identifies aberrant signaling in indolent B-cell lymphoma. BMC Cancer. 12, 478(2012).
  6. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  7. Myklebust, J. H., et al. Distinct patterns of B-cell receptor signaling in non-Hodgkin lymphomas identified by single-cell profiling. Blood. 129 (6), 759-770 (2017).
  8. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects. THE JOURNAL OF THE AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION. 310 (20), 2191-2194 (2013).
  9. Siveen, K. S., et al. Targeting the STAT3 signaling pathway in cancer: role of synthetic and natural inhibitors. Biochimica et Biophysica Acta. 1845 (2), 136-154 (2014).
  10. Fabbri, G., Dalla-Favera, R. The molecular pathogenesis of chronic lymphocytic leukaemia. Nature Reviews Cancer. 16 (3), 145-162 (2016).
  11. Arnason, J. E., Brown, J. R. Targeting B Cell Signaling in Chronic Lymphocytic Leukemia. Current Oncology Reports. 19 (9), 61(2017).
  12. Landskron, J., Tasken, K. Phosphoprotein Detection by High-Throughput Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1355, 275-290 (2016).
  13. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. Journal of Immunology. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  14. Pollheimer, J., et al. Interleukin-33 drives a proinflammatory endothelial activation that selectively targets nonquiescent cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), e47-e55 (2013).
  15. Ertsås, H. C., Nolan, G. P., LaBarge, M. A., Lorens, J. B. Microsphere cytometry to interrogate microenvironment-dependent cell signaling. Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 9 (2), 123-134 (2017).
  16. Lin, C. C., et al. Single cell phospho-specific flow cytometry can detect dynamic changes of phospho-Stat1 level in lung cancer cells. Cytometry A. 77 (11), 1008-1019 (2010).
  17. Simmons, A. J., et al. Cytometry-based single-cell analysis of intact epithelial signaling reveals MAPK activation divergent from TNF-alpha-induced apoptosis in vivo. Molecular Systems Biology. 11 (10), 835(2015).
  18. Simmons, A. J., et al. Impaired coordination between signaling pathways is revealed in human colorectal cancer using single-cell mass cytometry of archival tissue blocks. Science Signaling. 9 (449), rs11(2016).
  19. Friedman, A. A., Letai, A., Fisher, D. E., Flaherty, K. T. Precision medicine for cancer with next-generation functional diagnostics. Nature Reviews Cancer. 15 (12), 747-756 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phospho Flow CytometryFluorescent Cell BarcodingSingle Cell SignalingBiomarker DiscoveryPeripheral Blood Mononuclear CellsChronic Lymphocytic LeukemiaFlow Cytometry AnalysisCell StimulationAntibody StainingData Acquisition

Related Articles