مقالة منهجية

رامان الرنين المزودة بسطح نثر راتيوميتري نانوبروبي للكشف عن سرطان المبيض المجهرية عن طريق مستقبلات حمض الفوليك استهداف

7.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58389

⸱

مارس 25, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Chemistry, The Graduate Center of the City University of New York, 3Molecular Pharmacology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT), Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 5Gerstner Sloan Kettering Graduate School of Biomedical Sciences, 6Department of Radiology, Weill Cornell Medical College of Cornell University, 7Dana-Farber Cancer Institute and Harvard Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

ويشكل سرطان المبيض الانبثاث في جميع أنحاء التجويف الصفاقى. هنا، فإننا نقدم بروتوكولا لجعل واستخدام حمض الفوليك مستقبلات تستهدف تعزيز سطح الرنين نانوبروبيس تشتت رامان التي تكشف عن هذه الآفات مع خصوصية عالية عن طريق التصوير راتيوميتريك. وتدار في نانوبروبيس إينترابيريتونيلي للفئران الحية، والصور المشتقة ترتبط أيضا بعلم الأنسجة.

الملخص

ويمثل سرطان المبيض خبيثة أمراض دموية. تعرض معظم المرضى في مرحلة متقدمة (فيغو المرحلة الثالثة أو الرابعة)، عندما حدث المنتشر المحلية تنتشر بالفعل. ومع ذلك، قد سرطان المبيض نمطاً فريداً لانتشار المنتشر، حيث يزرع الورم ترد في البداية داخل التجويف الصفاقى. يمكن تمكين هذه الميزة، من حيث المبدأ، استئصال كامل الورم يزرع بقصد العلاج. كثير من هذه الآفات المنتشر المجهرية، مما يجعل من الصعب تحديد وعلاج. ويعتقد تحييد هذه ميكروميتاستاسيس أن يكون هدفا رئيسيا للقضاء على تكرار الورم وتحقيق البقاء الطويل الأجل. رامان التصوير بالرنين المحسن السطحية نانوبروبيس تشتت رامان يمكن استخدامها لتحديد الأورام المجهرية مع حساسية عالية، بسبب ما مشرق وبصمات طيفية بيورثوجونال. هنا، يمكننا وصف تركيب اثنين من 'النكهات' من هذا القبيل نانوبروبيس: أحد فونكتيوناليزيد الأجسام المضادة التي تستهدف مستقبلات حمض الفوليك – overexpressed في كثير من أنواع السرطان المبيض – ومن نانوبروبي عنصر تحكم غير المستهدفة، مع الأطياف المتميزة. نانوبروبيس تدار المشترك إينترابيريتونيلي للماوس نماذج غدية المبيض البشرية المنتشر. وافق جميع الدراسات الحيوانية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة للنصب التذكاري مركز سلون كيترينج للسرطان. تجويف البريتوني من الحيوانات هو جراحيا مكشوف وغسلها والممسوحة ضوئياً مع ميكروفوتوسبيكتروميتير رامان. في وقت لاحق، تواقيع رامان نانوبروبيس اثنين decoupled باستخدام خوارزمية "المربعات الكلاسيكي" مناسب، وتقسيم نتائجهم الخاصة بكل منها لتوفير إشارة راتيوميتريك المستهدفة لحمض الفوليك على تحقيقات غير المستهدفة. وبهذه الطريقة، يتم تصور الانبثاث المجهري مع خصوصية عالية. الميزة الرئيسية لهذا النهج هو أن التطبيق المحلي في التجويف الصفاقى — الذي يمكن إنجازه مريح أثناء العملية الجراحية-يمكن تمييز الأورام دون إخضاع المريض للتعرض نانوحبيبات النظامية. الإشارات الإيجابية الكاذبة الناجمة عن الربط غير محددة من نانوبروبيس على الأسطح الحشوي يمكن القضاء عليها باتباع نهج راتيوميتريك حيث يتم تطبيق نانوبروبيس المستهدفة وغير المستهدفة مع التوقيعات رامان متميزة كخليط. الإجراء حاليا لا يزال محدود بعدم رامان واسع المجال التجاري نظام الكاميرا، التي تتوفر مرة سيسمح لتطبيق هذه التقنية في المسرح التشغيل التصوير.

المقدمة

رامان التصوير مع 'نثر رامان السطحي المحسن' جسيمات نانوية (SERS) قد أظهرت وعدا كبيرا في تحديد الآفات في مجموعة متنوعة من الإعدادات وورم مختلفة كثيرة بأنواع1،2،3،4 . والميزة الرئيسية لجسيمات نانوية SERS هو التوقيع الطيفي مثل بصمات الأصابع، إتاحة الكشف لا يرقى إليه الشك أن هو مرتبك لا ب الإشارات الخلفية البيولوجية5. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضخيمه كثافة الإشارات المنبعثة المزيد باستخدام جزيئات مراسل (الأصباغ) مع ماكسيما امتصاص تمشيا مع الليزر الإثارة، مما يؤدي إلى 'تعزيز السطحية الرنين رامان نثر' (سيرس) جسيمات نانوية مع أكبر حساسية6،7،،من89،10،،من1112.

أحد الحواجز التي تحتاج إلى معالجتها باعتماد SE(R)RS جسيمات نانوية13 وكثيرة أخرى نانوحبيبات ثوابت14،15 للاستخدام السريري هو أسلوب الإدارة، كما يؤدي الحقن الوريدية الجهازية التعرض للعامل، ويستلزم اختبارات مكثفة لاستبعاد الآثار الضارة المحتملة. في هذه المقالة، نحن نقدم نموذجا مختلفاً استناداً إلى تطبيق جسيمات نانوية محلياً في فيفو، مباشرة في التجويف الصفاقى أثناء الجراحة، تليها خطوة غسيل لإزالة أي جسيمات نانوية غير منضم1. هذا النهج ينسجم مع رواية النهج العلاجية التي حاليا قيد التحقيق كما تجعل استخدام تقطير محلية من وكلاء في التجويف الصفاقى، يسمى العلاج الكيميائي داخل هايبرثيرميك (هيبيك). ومن ثم، ينبغي أن تكون المبدأ ذاته سهلة نسبيا للاندماج في سير عمل السريري. لقد درسنا في بيوديستريبوشن جسيمات نانوية بعد داخل التطبيق، ولاحظنا عدم استيعاب أي قابلة للكشف في الدوران الجهازي1. بالإضافة إلى ذلك، نهج التطبيق المحلي تلتف عزل جسيمات نانوية بنظام شبكي، حتى ملحوظة يتم خفض عدد جسيمات نانوية المطلوبة. ومع ذلك، عندما يطبق موضعياً، جسيمات نانوية فونكتيوناليزيد جسم تميل إلى الالتزام على السطوح الحشوي حتى في غياب الهدف. من أجل تقليل إشارات إيجابية كاذبة بسبب التصاق نانوحبيبات غير محددة، نواصل اتباع نهج راتيوميتريك، التي ينص فيها نانوبروبي جزيئيا مستهدفة إشارة محددة، ومن نانوبروبي عنصر تحكم غير المستهدفة، مع مختلف رامان الطيف، حسابات للخلفية غير محددة16،17. وقد أثبتنا هذه المنهجية المطبقة موضعياً المحسن السطحية الرنين رامان الطيفي راتيوميتريك مؤخرا في نموذج الفأر من سرطان المبيض منتشر1.

والهدف العام لهذا الأسلوب وضع اثنين سيرس نانوبروبيس، واحدة استهدفت وواحدة غير محددة، تطبق محلياً في نماذج الماوس، من أجل صورة الانتشار/overexpression من السرطان المتصلة بالعلامات البيولوجية باستخدام الكشف عن راتيوميتريك من المسابر اثنين عن طريق رامان التصوير. في هذا العمل، اختير مستقبلات حمض الفوليك (FR) كالهدف، وهذا أوبريجولاتيد ماركر في العديد من سرطانات المبيض18،19. ولقد أظهر رامان ميكرويماجينج مع جسيمات نانوية المستندة إلى SERS أيضا سرطان الخلية تحديد20. يتم توليف اثنين متميزة "النكهات" من جسيمات نانوية رامان، كل المستمدة بصمات الأصابع من صبغة عضوية مختلفة. جسيمات نانوية تتألف من نواة الذهب على شكل نجمة محاطة بقذيفة السيليكا وإثبات الرنين السطحية مأكل مثل الطحين في حوالي 710 شمال البحر الأبيض المتوسط. وتودع المراسل رامان (صبغ العضوية) تزامن مع تشكيل شل السليكا. وأخيراً، نانوبروبيس المستهدفة للأب (αFR-NPs) هو شل السليكا مترافق مع الأجسام المضادة، بينما هي تخميل نانوبروبيس غير المستهدفة (nt-NPs) مع أحادي الطبقة من البولي إيثيلين غليكول (شماعة).

استخدمت هذه التقنية بنجاح لخريطة الأورام المجهرية في نموذج xenograft ماوس منتشر النقيلي سرطان المبيض (سكوف-3)، مما يدل على قابليته للاستخدام في الحية. يمكن أن تشمل أيضا للاستخدام في الأنسجة، وقصت للورم فينوتيبينج، أو تحديد الهامش بعد ديبولكينج كما هو موضح في دراسة المشابهة21.

نانوبروبيس سيررس توفير منصة قوية لإنشاء عدة علامات المستهدفة للمؤشرات الحيوية، توليفها مع التفاعلات الكيميائية مباشرة كما هو مبين تخطيطياً في الشكل 1. وهنا، يقدم البروتوكول المتعلق بتوليف لهذين النوعين من سيررس نانوبروبيس (الأجزاء 1-3)، وتطوير نموذج الماوس سرطان المبيض مناسبة (المادة 4)، إدارة نانوبروبيس وتصوير (القسم 5)، وأخيراً تحليل البيانات و التصور (المادة 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافق جميع الدراسات الحيوانية برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة للنصب التذكاري مركز سلون كيترينج للسرطان (# 07/06/11).

1-الذهب نانوستار الأساسية التوليف

ملاحظة: نانوستارس الذهب تستخدم النوى النكهات كلا من نانوبروبيس سيررس المستخدمة في هذه التجربة.

  1. إعداد 800 مل من 60 ملم حمض الأسكوربيك (ج6ح8س6) الحل في المياه (DI) و 8 مل من 20 مم (حوكل4) حمض تيتراتشلورووريك الحل في المياه دي. كول إلى 4 درجات مئوية.
  2. تنفيذ هذه الخطوة رد فعل عند 4 درجة مئوية. ضع قارورة مخروطية الشكل الذي يحتوي على 800 مل من حمض الأسكوربيك الحل على طبق من إثارة مغناطيسية والحث على دوامة مطرد. إضافة 8 مل من حمض تيتراتشلورووريك الحل بسرعة في الدوامة. في غضون ثوان، وستشكل نانوستارس والحل سوف تحمل لون أزرق داكن. في حالة اللون في أي وقت يصبح الوردي أو الأرجواني، مما يدل على تشكيل نانوسفيريس، يجب أن يتم تجاهل التعليق وتركيب رياتيمبتيد.
  3. من أجل تعليق نانوستار إلى 50 مل الأنابيب المخروطية، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة (4 درجة مئوية، 3,220 س ز). نضح المادة طافية تاركة ميليلتر 200 التقريبي للحل في كل أنبوبة. دفع تنبيه ليس الإزعاج بيليه من جسيمات نانوية في الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: ينبغي أن تكون المادة طافية صبغة زرقاء بسبب نانوستارس المعلقة المتبقية.
  4. استخدام ميكروبيبيتي، تحرض الحل لتعليق وجمع جسيمات نانوية من كل أنبوبة. قد يكون ضغط على الجزء السفلي من الأنبوب جزءا من بيليه وسوف لا ريسوسبيند حتى مع القوى بيبيتينج--تجاهل هذا الجزء.
  5. نقل تعليق نانوحبيبات إلى كاسيت الغسيل الكلوي (3.5 موكو كاتشين) ودياليزي على الأقل ثلاثة أيام ضد 2 لتر مياه دي، تغيير الماء يوميا. تخزين نانوستارس في الغسيل الكلوي عند 4 درجة مئوية لتصل إلى شهر مع تغيير الماء كل 3-4 أيام.
    ملاحظة: ينبغي أن يوضع نانوستارس في الغسيل الكلوي حتى المطلوبة لرد فعل سيليكاتيون، كما هو موضح في المقطع 2.

2-تشكيل شل السليكا

ملاحظة: يتم توليف نكهات اثنين من نانوبروبيس رامان. الإجراء التوليف هو نفسه على حد سواء، مع الفرق الوحيد هو جزيء مراسل رامان (صبغ) المستخدمة. وتستخدم في هذه التجربة، IR780 فوق كلورات و IR140. يجب أن تقوم رد فعل دائماً في حاويات بلاستيكية. التوليف تدرجية عالية ويمكن تعديلها للمبلغ المطلوب من إينجيكتاتي المطلوبة. هنا، توليفة متوسطة الحجم دفعي هو وصف، الذي يمكن قياسه بكميات أقل أو أعلى خطيا حسب الحاجة، مع نفس التركيزات وأوقات رد الفعل. يمكن أن يؤديها ردود فعل نوعي نانوبروبي سيرس بالتوازي. تولي اهتماما لتجنب التلوث المتبادل. ينبغي إجراء سونيكيشن ريديسبيرسيون الكريات نانوحبيبات بعد الطرد المركزي أثناء الغسيل الخطوات، أو بعد أن كانت مخزنة جسيمات نانوية لأكثر من ساعة واحدة. سونيكاتيون ينبغي أن يقوم حتى جسيمات نانوية وضوح تعلق في الحل، عادة ل 1 s.

  1. في أنبوب A (50 مل مخروطية أنبوب)، خلط 10 مل من الايزوبروبانول، 500 ميليلتر من تيوس، 200 ميليلتر من الماء دي، و 60 ميليلتر من صبغة (بيركلورات IR780 أو IR140، 20 ملم في DMF (ديميثيلفورماميدي)).
  2. في "الأنبوب ب" (15 مل الأنبوبة المخروطية)، مزيج من 3 مل إيثانول و 200 ميليلتر من هيدروكسيد الأمونيوم. Sonicate نانوستارس من 1.4 خطوة لتفريق أي تجمعات في الحل وإضافة 1.2 مل نانوستارس إلى الأنبوب.
    ملاحظة: حل هيدروكسيد الأمونيوم متقلبة للغاية ومن الصعب "الماصة؛" بدقة. تخزينها في 4 درجات مئوية، حتى يلزم، لتسهيل بيبيتينج.
  3. ضع الأنبوب A في دوامة خلاط والحث على دوامة مطرد. سرعة إضافة محتويات "الأنبوبة ب" في الدوامة والاحتفاظ بخلط لحوالي 5 س. نقل على الفور إلى رد شاكر وترك لمدة 15 دقيقة بينما تهز 300 لفة في الدقيقة، في درجة حرارة الغرفة.
  4. وبعد تفريخ 15 دقيقة، إخماد رد فعل عن طريق إضافة الإيثانول ملء أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 3,220 س ز و 4 درجة مئوية.
  5. نضح المادة طافية، ترك حوالي 0.5 مل من محلول، مع الحرص على عدم تعكير بيليه. أضف 1 مل إيثانول وتحرض مع ماصة ريسوسبيند جسيمات نانوية. نقل إلى أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل ويغسل 4 مرات مع الإيثانول سينتريفوجينج في س 11,000 ز لمدة 4 دقائق ويسفط المادة طافية ريسوسبيندينج بيليه ب ultrasonication لما يقرب من 1 ثانية.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، جسيمات نانوية سيليكاتيد يمكن فونكتيوناليزيد، كما هو موصوف في المادة 3، أو حراكه في المياه دي مع خطوة غسيل إضافي للتخزين في 4 درجات مئوية لتصل إلى أسبوع.

3-سطح الروغان

ملاحظة: نانوبروبيس سيرس IR780 سوف يكون مترافق مع الفولات استهداف مستقبلات الأجسام المضادة عن طريق كروسلينكير شماعة للنموذج αFR-مصادر القدرة النووية؛ وسوف مترافق سيرس IR140 تحكم نانوبروبيس مع أحادي الطبقة شماعة باسيفاتينج، للإقليم الشمالي-مصادر القدرة النووية. وتشكل كل النكهات عبر فعل ثيول-ماليميدي في ردود منفصلة ولكنها موازية.

  1. أغسل جسيمات نانوية مرتين من قبل سينتريفوجينج في 11,000 س ز لمدة 4 دقائق ويسفط المادة طافية ريسوسبيندينج بيليه في 1 مل إيثانول ب ultrasonication. كرر الخطوة الغسل مرة أخرى، ولكن ريديسبيرسي في 1 مل من الإيثانول 85%، 10% 3-مبتمس (3-ميركابتوبروبيلتريميثوكسيسيلاني)، و 5% المياه دي. احتضان في درجة حرارة الغرفة ح 1-2 إدخال ثيولس على سطح الجسيمات.
  2. أغسل جسيمات نانوية ثيول فونكتيوناليزيد سينتريفوجينج في س 11,000 ز لمدة دقيقة 4، يسفط المادة طافية وريسوسبيندينج بيليه ب ultrasonication، مرتين في الإيثانول، مرتين في دي، وأخيراً في حبيس (4-(2-هيدروكسيثيل)-1- المخزن المؤقت لحمض بيبيرازينيثانيسولفونيك) (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1)، وتوضع جانبا.
    ملاحظة: مس (2-(ن-morpholino) حمض اثانيسولفونيك) ينبغي استخدام المخزن المؤقت أو حبيس. المخازن المؤقتة مع ارتفاع الملوحة، مثل برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة)، قد حمل نانوحبيبات التجميع.
  3. لجسم فونكتيوناليزيد αFR-مصادر القدرة النووية، تتفاعل 200 ميكروغرام من الأجسام المضادة (ملزمة الفولات المضادة البروتين استنساخ جسم [LK26]) مع فائض المولى عشرة إضعاف من شماعة crosslinker (أثير البروم ثنائي الفينيل poly(ethylene glycol) (N-هيدروكسيسوكسينيميدي 5-بينتانواتي) N′-(3- ماليميدوبروبيونيل) أمينوثاني (CAS: 851040-94-3)، في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) في 500 ميليلتر من مس المخزن المؤقت (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1) لمدة 30 دقيقة.
  4. إزالة crosslinker الزائدة وتركز الأجسام المضادة التي سينتريفوجينج الحل جسم الوتد في عامل تصفية الطرد مركزي (100 موكو كاتشين). لمرشحات الطرد المركزي المستخدمة في هذه الدراسة، إجراء الطرد المركزي عن 10 دقيقة في 14,000 س ز و 23 درجة مئوية. استرداد الأجسام المضادة مترافق في أنبوب جديد بعكس عامل التصفية وسينتريفوجينج في 1,000 س ز 2 دقيقة.
  5. "الماصة؛" nanoparticles IR780 من 3.2 خطوة في الأنبوب مع الأجسام المضادة وتحرض مع الماصة المزيج. احتضان هذا الخليط لمدة 30 دقيقة على الأقل في غرفة درجة الحرارة، أو، بدلاً من ذلك في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها إلى نموذج αFR-مصادر القدرة النووية.
  6. نموذج nt-مصادر القدرة النووية، وإضافة 1% w/v ميثوكس منتهية (m) PEG5000-ماليميدي (CAS: 99126-64-4) حله في [دمس] لجسيمات نانوية سيررس IR140 من 3.2 خطوة والرد اسمحوا في 500 ميليلتر مس المخزن المؤقت (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1) على الأقل 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، أو، بدلاً من ذلك عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  7. للإدارة للفئران (القسم 5)، تدور أسفل كل النكهات نانوبروبي في س 11,000 ز لمدة دقيقة 4، نضح المادة طافية إزالة الحل مع الأجسام المضادة الممتص مجاناً/شماعة، وريديسبيرسي كل نكهة في مس المخزن المؤقت (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1) 600 م تركيز . عندما ريسوسبيندينج جسيمات نانوية، تقليل التعرض لا لزوم لها بالموجات فوق الصوتية، لمنع تمسخ الضد.

4-الفأر نموذج التنمية

  1. إرساء ثقافة ثابتة من خط خلية غدية المبيض البشري (سكوف-3). بشكل اختياري، لتمكين الرصد عن طريق الإضاءة الحيوية/الأسفار، استخدم transfected الخلايا/GFP "لوك" سكوف-3++ . خلايا الثقافة في المتوسط ربمي (معهد ميموريال بارك روزويل) مع 10% مصل العجل الجنين والممر مرتين في أسبوع. للحقن، احتضان الخلايا مع trypsin/0.05% 0.25% يدتا لمدة 3 دقائق فصل، وبعد ذلك تغسل وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني في 2 × 106 خلايا/100 ميليلتر.
  2. لإنشاء نموذج ميكروميتاستاسيس المبيض، حقن 200 ميليلتر من تعليق سكوف-3 خلايا إينترابيريتونيلي في الفئران athymic الإناث (FOXn1nu/FOXn1nu الفئران، 6-8 أسابيع من العمر). سوف يحدث انتشار البريتوني نشرها في 4 أسابيع تقريبا. في حالة استخدام الخلايا "لوك" سكوف-3+ ، يمكن رصد نمو الورم مع الإضاءة الحيوية بإدارة 2 مغ من خنفساء لوسيفرين في برنامج تلفزيوني ميليلتر 50 عن طريق الحقن ريتروربيتال.

5-نانوبروبي حقن والتصوير

  1. إعداد نانوبروبيس (αFR-NPs و nt-NPs) كما هو موضح في المقاطع 1-3 ومزيج بنسبة 1:1، لتركيز نهائية من 300 م من كل نوع في المخزن المؤقت مس (10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.1). بشكل اختياري، إعداد معايير مرجعية من 30 م لكل من النكهات نانوبروبي في الأنابيب المخروطية (100 ميليلتر) الصغيرة.
  2. حقن إينترابيريتونيلي 1 مل تعليق نانوحبيبات في كل الماوس و بلطف تدليك البطن توزيعها جسيمات نانوية داخل التجويف البريتوني. العودة الماوس في السكن. وبعد دقائق 25 أو أكثر، euthanize الماوس عن طريق الخنق2 CO.
  3. ربط الماوس على منصة جراحية، في موقف ضعيف (للبطن كله التصوير، واحتياجات النظام الأساسي أن يكون قابل للتركيب على الساحة مجهر تستقيم).
    1. باستخدام ملقط مسنن ومقص التشريح، إزالة الجلد لفضح الصفاق وتنفيذ شق السهمي كبير (بين 2 و 3 سم في الطول) لفضح البطن كله. إرفاق اللوحات البريتوني على النظام الأساسي. يغسل داخل التجويف البريتوني مع مالا يقل عن 60 مل من برنامج تلفزيوني باستخدام زجاجة بلاستيكية بخ.
      ملاحظة: لتمكين التصوير دون عائق من البطن كله، الأمعاء تحتاج إلى تعبئة أو اقتطعت. للختان، الالتئام مع ربط الأوعية المساريقي العلوي بغية الحد من نزيف في تجويف البطن.
    2. وبدلاً من ذلك، صورة محددة من الأجهزة والمكوس لهم بعد الغسيل برنامج تلفزيوني ووضعها على شريحة مجهر.
  4. نقل منصة أو الشريحة إلى ميكروسبيكتروفوتوميتير رامان مع التكوين البصري تستقيم ومرحلة يجهز للتصوير؛ استخدام نظام تجاري مع 300 ميغاواط 785 نانومتر صمام ثنائي ليزر، مع [غرتينغ] الأخاديد 1,200 الواحد مم، تركزت في سم 1,115-1.
    1. التركيز على مجال الاهتمام باستخدام البصريات الضوء الأبيض، بارفوكال مع الليزر رامان. قم بتحديد المساحة التي يتم تصويرها والدقة المطلوبة؛ واستخدمت في هذا التقرير وضع اقتناء عالية السرعة (أطياف المكتسبة في إطار الإضاءة الليزر المستمر مع مرحلة مجهر تتحرك باستمرار، مع فعالية القرار المكانية 14.2 ميكرومتر من 200 ميكرون؛ وفي التكبير x 5، 100 ميغاواط السلطة في الهدف، و < 100 مللي ثانية التعرض لكل نقطة).
      ملاحظة: يمكن أن توضع هذه الأنابيب مع نانوبروبيس إشارة من 5.1 خطوة داخل منطقة المصورة إذا رغبت، لتوفير معايير مرجعية داخلية للتحليل اللاحق. تأكد من لا مصادر الضوء دخيلة خلاف الليزر تصل إلى الهدف.
  5. بشكل اختياري، إعداد العينة لتجهيز غذائها والتحقق من الصحة بالتثبيت في بارافورمالدهيد 4% في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. شطف مع برنامج تلفزيوني في 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل مرتين. تبقى العينة في الإيثانول 70% في الماء حتى القياسية تجهيز غذائها وتضمينها البارافين. للتحقق من صحة غذائها من الأورام، يمكن ملطخة المقاطع (سميك 5 ميكرومتر) من أعماق مختلفة من كتلة البارافين الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E).

6-معالجة البيانات والتصور

ملاحظة: وأجرى جميع البيانات المعالجة مع واجهة مستخدم رسومية تطويره داخليا، استخدام البرمجيات التجارية. جميع الوظائف التي تستخدم لها مكافئات العامة المتاحة في بيئات الحوسبة الأخرى.

  1. الحصول على الأطياف المرجعية لاثنين من النكهات، باستجواب المعلقات نقية من كل. الأطياف المرجعية يمكن أن يستمد من مسح نقطة من نانوبروبيس، التصوير من نانوبروبيس في لوحات جيدا، أو بما في ذلك المراجع الداخلي في فحص تجريبي في أنابيب مرجع (راجع الخطوة 5، 1).
  2. Preprocess الأطياف المرجعية، باستخدام الطرح خط الأساس (تصفية ويتاكر، λ = 200)، التطبيع بالمنطقة تحت المنحنى، وتصفية المشتقات Savitzky غولي (متعدد الحدود الدرجة الثانية تلائم، عرض مشتقة، الدرجة الأولى = 15 خطوات). هذه الأطياف معالجة سيكون بمثابة مراجع للنموذج الكلاسيكي لمجموع المربعات (CLS).
  3. Preprocess نموذج البيانات من الصورة بنفس الطريقة الأطياف المرجعية. الحصول على عشرات CLS لكل نقطة عينة باستخدام خوارزمية CLS متاحة. عشرات CLS (DCLS) المباشرة هي ببساطة إحداثيات الإسقاط من طائفة عينة على مساحة الخطية التي يحددها المعمم معكوس المصفوفة (معكوس مور-بنروز) الأطياف المرجعية. تركيب أخرى يمكن أن تكون الخوارزميات المستخدمة (المربعات غير سالب أو المربعات الجزئية، أو غيرهم).
    ملاحظة: بعض الخوارزميات المناسب يمكن أن تؤدي إلى عشرات السلبية، التي غير المادية في هذا السياق. إذا كان هذا هو الحال، يمكن تحديد عتبة لاستبعاد عشرات السلبية، أو تكون خوارزمية مربعات الصغرى سالبة مقيدة استخدمت بدلاً من ذلك.
  4. حساب نسبة توافق على الإشارة للجسيمات النانوية مستهدفة العشرات (عشراتαFR) على مدى عشرات على المرجع لجسيمات نانوية غير المستهدفة (عشراتnt). إذا كانت النقاط غير سالبة، النسبة يمكن التعبير عنها بطريقة لوغاريتمية:
    R = سجل10(عشراتαFR/عشراتnt).
    يتم عرض نسبة R أفضل في نطاق ألوان متباينة تركزت على الصفر، للتعبير عن الوفرة النسبية للتحقيقات في أوامر من حجم. يمكن تراكب الصورة الناتجة على الصورة الضوء الأبيض من العينة، للكشف عن مجالات overexpression مستقبلات حمض الفوليك.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن أن توصف جسيمات نانوية لأغراض مراقبة الجودة، باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب أثناء عملية التوليف، بما في ذلك تيم ودائرة الأراضي والمساحة، نانوحبيبات تتبع تحليل وطيف امتصاص الأشعة فوق البنفسجية/Vis، كما هو مبين في الشكل 2.

وبهذه الطريقة، حجم الأساسية نانوستار الذهب (هو موضح في القسم 1) وتشكيل شل السليكا (القسم 2) الروغان السطحية اللاحقة (الفرع 3) يمكن التحقق منها (الشكل 2<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

ينص البروتوكول على وصف هنا تعليمات لتركيب اثنين من "النكهات" من سيرس نانوبروبيس، وعملهم في الفئران رامان التصوير ورم في المبيض overexpressing "مستقبلات حمض الفوليك"، باستخدام خوارزمية راتيوميتريك. والميزة الرئيسية رامان التصوير عبر سائر تقنيات التصوير الضوئي (مثل الأسفار) هو خصوصية عالية للإشارة نانوبروبي التي لا يمكن أن تكون مرتبك مع أي إشارات من أصل بيولوجي. في هذا تجسيد رامان التصوير، تدار جسيمات نانوية ليس عن طريق الوريد، ولكن محلياً، عن طريق حقنه داخل تليها خطوة واحدة غسيل. وهذه المنهجية، تترجم مرة واحدة إلى الساحة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

• M.F.K. يتم سرد مخترع عدة صدرت أو انتظار طلبات البراءات المتصلة بهذا العمل. M.F.K. هو أحد مؤسسي ريو التصوير، شركة، والتي تهدف إلى ترجمة جسيمات نانوية سيرس إلى العيادات.

• الكتاب يعلن أن لديهم أية مصالح مالية الأخرى المتنافسة.

شكر وتقدير

يتم الاعتراف بمصادر التمويل التالية (إلى M.F.K.): EB017748 R01 المعاهد الوطنية للصحة و R01 CA222836 CA16396 K08؛ ديمون رونين-راتشليف الابتكار جائزة الحد من إخطار الكوارث--29-14، ساحة برشينغ سوهن جائزة تحالف بحوث السرطان سوهن ساحة برشينغ، مركز MSKCC للتصوير الجزيئي وتكنولوجيا النانو (كمينت) وتطوير التكنولوجيا والمنح. يتم توسيع الاعترافات أيضا إلى دعم تمويل المنح المقدمة من "المنحة الأساسية MSKCC المعاهد الوطنية للصحة" (P30-CA008748).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>اسم الكاشف
حمض الأسكوربيكسيجما-ألدريتشA5960
3-MPTMSسيجما ألدريتش175617
هيدروكسيد الأمونيوم (28٪)سيجما ألدريتش338818
الجسم المضاد لمستقبلات حمض الفوليك [LK26] AbCamab3361
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش276855
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (لا مائي)سيجما ألدريتش276855
الإيثانولسيجما ألدريتش792780
IR140سيجما ألدريتش260932
IR780 بيركلورات *سيجما ألدريتش576409توقف *
إيزوبروبانولسيجما ألدريتش650447
N.N.DimethylformamideSigma-Aldrich227056
PEG CrosslinkerSigma-Aldrich757853
PEG-maleimideSigma-Aldrich900339
حمض رباعي كلورو أوريكسيجما ألدريتش244597
رباعي إيثيل أورثوسيليكاتسيجما ألدريتش86578
* IR792سيجما ألدريتش425982* بديل
<قوي> اسم المعدات< / قوي >
كاسيت غسيل الكلى (3،500 MWCO) مرشحاتالطرد المركزي ThermoFIsher87724
MilliporeUFC510096
فيVia مجهر رامان متحد البؤرRenishaw
MATLAB (v2014b)Mathworks
PLS Toolbox (v8.0)بحث
Eigenvector

المراجع

  1. Oseledchyk, A., Andreou, C., Wall, M. A., Kircher, M. F. Folate-Targeted Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detection of Microscopic Ovarian Cancer. ACS Nano. 11 (2), 1488-1497 (2017).
  2. Andreou, C., et al. Imaging of Liver Tumors Using Surface-Enhanced Raman Scattering Nanoparticles. ACS Nano. 10 (5), 5015-5026 (2016).
  3. Karabeber, H., et al. Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner. ACS Nano. 8 (10), 9755-9766 (2014).
  4. Kircher, M. F., et al. A brain tumor molecular imaging strategy using a new triple-modality MRI-photoacoustic-Raman nanoparticle. Nature Medicine. 18 (5), 829-834 (2012).
  5. Andreou, C., Kishore, S. A., Kircher, M. F. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy: A New Modality for Cancer Imaging. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1295-1299 (2015).
  6. Harmsen, S., et al. Rational design of a chalcogenopyrylium-based surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobe with attomolar sensitivity. Nature Communications. 6, 6570(2015).
  7. Harmsen, S., et al. Surface-enhanced resonance Raman scattering nanostars for high-precision cancer imaging. Science Translational Medicine. 7 (271), 271ra277(2015).
  8. Harmsen, S., Wall, M. A., Huang, R., Kircher, M. F. Cancer imaging using surface-enhanced resonance Raman scattering nanoparticles. Nature Protocols. 12 (7), 1400-1414 (2017).
  9. Huang, R., et al. High Precision Imaging of Microscopic Spread of Glioblastoma with a Targeted Ultrasensitive SERRS Molecular Imaging Probe. Theranostics. 6 (8), 1075-1084 (2016).
  10. Iacono, P., Karabeber, H., Kircher, M. F. A "schizophotonic" all-in-one nanoparticle coating for multiplexed SE(R)RS biomedical imaging. Angewandte Chemie, International Edition in English. 53 (44), 11756-11761 (2014).
  11. Spaliviero, M., et al. Detection of Lymph Node Metastases with SERRS Nanoparticles. Molecular Imaging and Biology. 18 (5), 677-685 (2016).
  12. Nayak, T. R., et al. Tissue factor-specific ultra-bright SERRS nanostars for Raman detection of pulmonary micrometastases. Nanoscale. 9 (3), 1110-1119 (2017).
  13. Thakor, A. S., et al. The fate and toxicity of Raman-active silica-gold nanoparticles in mice. Science Translational Medicine. 3 (79), 79ra33(2011).
  14. Liu, J., et al. Effects of Cd-based Quantum Dot Exposure on the Reproduction and Offspring of Kunming Mice over Multiple Generations. Nanotheranostics. 1 (1), 23-37 (2017).
  15. Wu, N., et al. The biocompatibility studies of polymer dots on pregnant mice and fetuses. Nanotheranostics. 1 (3), 261-271 (2017).
  16. Garai, E., et al. High-sensitivity real-time, ratiometric imaging of surface-enhanced Raman scattering nanoparticles with a clinically translatable Raman endoscope device. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 096008(2013).
  17. Wang, Y. W., et al. Rapid ratiometric biomarker detection with topically applied SERS nanoparticles. Technology (Singap World Sci). 2 (2), 118-132 (2014).
  18. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
  19. Vergote, I. B., Marth, C., Coleman, R. L. Role of the folate receptor in ovarian cancer treatment: evidence, mechanism, and clinical implications. Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 41-52 (2015).
  20. Fasolato, C., et al. Folate-based single cell screening using surface enhanced Raman microimaging. Nanoscale. 8 (39), 17304-17313 (2016).
  21. Wang, Y. W., et al. Raman-Encoded Molecular Imaging with Topically Applied SERS Nanoparticles for Intraoperative Guidance of Lumpectomy. Cancer Research. 77 (16), 4506-4516 (2017).
  22. Andreou, C., Pal, S., Rotter, L., Yang, J., Kircher, M. F. Molecular Imaging in Nanotechnology and Theranostics. Molecular Imaging and Biology. 19 (3), 363-372 (2017).
  23. Chitgupi, U., Qin, Y., Lovell, J. F. Targeted Nanomaterials for Phototherapy. Nanotheranostics. 1 (1), 38-58 (2017).
  24. Choi, D., et al. Iodinated Echogenic Glycol Chitosan Nanoparticles for X-ray CT/US Dual Imaging of Tumor. Nanotheranostics. 2 (2), 117-127 (2018).
  25. Dubey, R. D., et al. Novel Hyaluronic Acid Conjugates for Dual Nuclear Imaging and Therapy in CD44-Expressing Tumors in Mice In Vivo. Nanotheranostics. 1 (1), 59-79 (2017).
  26. Gupta, M. K., et al. Recent strategies to design vascular theranostic nanoparticles. Nanotheranostics. 1 (2), 166-177 (2017).
  27. Huang, Y. J., Hsu, S. H. TRAIL-functionalized gold nanoparticles selectively trigger apoptosis in polarized macrophages. Nanotheranostics. 1 (3), 326-337 (2017).
  28. Pal, S., Harmsen, S., Oseledchyk, A., Hsu, H. T., Kircher, M. F. MUC1 Aptamer Targeted SERS Nanoprobes. Advanced Functional Materials. 27 (32), (2017).
  29. Zanganeh, S., et al. Iron oxide nanoparticles inhibit tumour growth by inducing pro-inflammatory macrophage polarization in tumour tissues. Nat Nanotechnol. 11 (11), 986-994 (2016).
  30. Lee, J., Lee, Y. M., Kim, J., Kim, W. J. Doxorubicin/Ce6-Loaded Nanoparticle Coated with Polymer via Singlet Oxygen-Sensitive Linker for Photodynamically Assisted Chemotherapy. Nanotheranostics. 1 (2), 196-207 (2017).
  31. Li, R., Zheng, K., Yuan, C., Chen, Z., Huang, M. Be Active or Not: the Relative Contribution of Active and Passive Tumor Targeting of Nanomaterials. Nanotheranostics. 1 (4), 346-357 (2017).
  32. Lin, S. Y., Huang, R. Y., Liao, W. C., Chuang, C. C., Chang, C. W. Multifunctional PEGylated Albumin/IR780/Iron Oxide Nanocomplexes for Cancer Photothermal Therapy and MR Imaging. Nanotheranostics. 2 (2), 106-116 (2018).
  33. Roberts, S., et al. Sonophore-enhanced nanoemulsions for optoacoustic imaging of cancer. Chemical Science (Royal Society of Chemistry: 2010). 9 (25), 5646-5657 (2018).
  34. Liu, L., Ruan, Z., Yuan, P., Li, T., Yan, L. Oxygen Self-Sufficient Amphiphilic Polypeptide Nanoparticles Encapsulating BODIPY for Potential Near Infrared Imaging-guided Photodynamic Therapy at Low Energy. Nanotheranostics. 2 (1), 59-69 (2018).
  35. Liu, R., Tang, J., Xu, Y., Zhou, Y., Dai, Z. Nano-sized Indocyanine Green J-aggregate as a One-component Theranostic Agent. Nanotheranostics. 1 (4), 430-439 (2017).
  36. Sneider, A., VanDyke, D., Paliwal, S., Rai, P. Remotely Triggered Nano-Theranostics For Cancer Applications. Nanotheranostics. 1 (1), 1-22 (2017).
  37. Wall, M. A., et al. Surfactant-Free Shape Control of Gold Nanoparticles Enabled by Unified Theoretical Framework of Nanocrystal Synthesis. Advanced Materials. 29 (21), (2017).
  38. Sonali,, et al. Nanotheranostics: Emerging Strategies for Early Diagnosis and Therapy of Brain Cancer. Nanotheranostics. 2 (1), 70-86 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SERRS

مقالات ذات صلة