نقدم هنا، بروتوكولا لسرعة عزل نواة عالية الجودة من الأنسجة الطازجة أو المجمدة المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. نحن تشمل الأنسجة الميكانيكية والمنظفات الصناعية والميكانيكية وناقص التوتر تعطل وخلية تحلل الخيارات، التي يمكن أن تستخدم لعزل نواة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عزل نويات الحبل الشوكي الكبار لتسلسل الحمض النووي الريبي المفرد-نواة موازية على نطاق واسع
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
الملخص
سبر التعبير الجيني خلية واحدة يمكن التعرف على نوع الخلية والخلية الدولة. وقد ظهرت تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة كأداة قوية لدراسة الملامح النسخي للخلايا، ولا سيما في الأنسجة غير المتجانسة مثل الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، تفكك الأساليب المطلوبة لتسلسل وحيد الخلية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات تجريبية في وفاة خلية والتعبير الجيني. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب تقتصر عموما على أنسجة جديدة، مما يحد من دراسات بشأن المحفوظات والمواد البيولوجية-البنك. تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) هو بديل جذاب للدراسات النسخي، نظراً لأنه يحدد أنواع الخلايا بدقة، ويسمح بدراسة الأنسجة المجمدة أو يصعب فصل، ويقلل من فعل الانفصال النسخ. نقدم هنا، بروتوكول الفائق لعزل السريع من الأنوية للمتلقين للمعلومات سنرنا--ما يليها هذا الأسلوب يتيح عزل نواة من عينات النخاع الشوكي الطازجة أو المجمدة، ويمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع اثنين من منصات تغليف الحبرية موازية على نطاق واسع.
المقدمة
الجهاز العصبي يتكون من مجموعات مستمدة من الخلايا التي تعرض مجموعة متنوعة من الخصائص المورفولوجية والبيوكيميائية والكهربية. أثناء تسلسل الحمض النووي الريبي السائبة كانت مفيدة لتحديد التغيرات على صعيد الأنسجة في التعبير الجيني في ظروف مختلفة، فإنه يحول دون الكشف عن التغييرات النسخي على مستوى خلية واحدة. التقدم الذي أحرز مؤخرا في تحليل النسخي خلية واحدة قد مكنت تصنيف الخلايا ايربان إلى المجموعات الوظيفية استناداً إلى ذخيرتهم الجزيئية ويمكن حتى أن تكون الاستدانة للكشف عن مجموعات من الخلايا العصبية التي نشطت مؤخرا. 1 , 2 , 3 , 4 على مدى السنوات العشر الماضية، قد مكن تطوير الجيش الملكي النيبالي خلية مفردة التسلسل (سكرنا-Seq) دراسة التعبير الجيني في الخلايا الفردية، وتقديم وجهة نظر إلى تنوع من نوع الخلية. 5
وقدمت ظهور نهج قابلة للتطوير مثل سرنا موازية على نطاق واسع-Seq، منصات لتسلسل أنسجة غير متجانسة، بما في ذلك مناطق عديدة في الجهاز العصبي المركزي. 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 ومع ذلك، أساليب تفكك خلية مفردة يمكن أن يؤدي إلى موت الخلية، فضلا عن التغييرات التجريبية في التعبير الجيني. 16 العمل مؤخرا بتكييف أساليب تسلسل خلية واحدة لتمكين المحافظة على الملامح النسخي الذاتية. 1 , 3 , 4 , 17 , 18 , 19 وكانت هذه الاستراتيجيات ملائمة بصفة خاصة للكشف عن التعبير الجيني (IEG) المبكر الفوري عقب التحفيز الحسي أو السلوك. 3 , 4 في المستقبل، هذه الاستراتيجية أيضا يمكن لدراسة التغيرات الدينامية في الأنسجة في الحالات المرضية أو استجابة للتأكيد. من هذه الأساليب، هو تسلسل واحد نواة الجيش الملكي النيبالي (سنرنا-Seq) نهج واعدة التي لا تنطوي على الإجهاد يحفز تفكك الخلية ويمكن استخدامها على صعوبة أن تنأى بالانسجة (مثل الحبل الشوكي)، فضلا عن تجميد الأنسجة. 4 , 17 , 18 , 19 مواءمة من أساليب العزلة نويات السابقة،20،،من2122،،من2325 سنرنا Seq عادة يستخدم التقويض السريع الأنسجة والخلية تحلل تحت الظروف الباردة والطرد المركزي، وفصل النوى عن الحطام الخلوية. 4 نواة يمكن أن تكون معزولة لتسلسل الجيل المتلقين للمعلومات على منصات متعددة في تغليف الحبرية موائع جزيئية. 4 , 7 , 24 , 25 يسمح هذا الأسلوب للقطة من النشاط الترانسكربتي الآلاف من الخلايا في لحظة من الزمن.
وهناك استراتيجيات متعددة للإفراج عن نواة من الخلايا قبل عزلة والتسلسل، كل منها بمزاياها وعيوبها. هنا، يمكننا وصف ومقارنة البروتوكولين الملحقين بتمكين عزل نواة من الحبل الشوكي الكبار لكثافة موازية المتلقين للمعلومات سنرنا-Seq: تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية وتحلل ناقص التوتر والميكانيكية. ويوفر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية اختلال الأنسجة كاملة وارتفاع عائد نهائي من الأنوية. ناقص التوتر الميكانيكية-تحلل يتضمن درجة السيطرة عليها من اختلال الأنسجة، مما أتاح فرصة لتحديد توازن بين الكمية ونقاء الغلة النووي نهائياً. وتوفر هذه النهج مقارنة الحمض النووي الريبي الغلة، أرقام تم اكتشاف الجينات كل نواة، والتنميط نوع الخلية وأيضا على حد سواء استخدامها بنجاح لما يليها سنرنا
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع الحيوانات الأعمال قد أنجزت وفقا لبروتوكول أقرها المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة. متوازنة في عينات من ذكور وإناث الفئران الممثل المدني الدولي/مؤتمر نزع السلاح-1 البرية من نوع، بين 8 وأسابيع 12 القديمة، كانت تستخدم لجميع التجارب. وينبغي التعامل مع الفئران وفقا للمبادئ التوجيهية لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية المحلية.
1-إعداد المواد والمخازن المؤقتة
- تجهيز المخازن المؤقتة لكل يوم الاستخدام والبرد مسبقاً على الجليد (انظر الجدول 1).
- إذا كان استخدام تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية، إعداد المخزن المؤقت تحلل المنظفات (> 500 ميكروليتر كل عينة) والمخزن المؤقت السكروز منخفضة (> 6 مل كل عينة)، السكروز كثافة المخزن المؤقت (> 12.5 مل كل عينة) والحل استثارة (> 1 مل).
- في حالة استخدام تحلل ناقص التوتر والميكانيكية، إعداد تحلل ناقص التوتر المخزن المؤقت (> 5 مل كل عينة)، عب المتوسطة (> 5 مل كل عينة)، المخزن المؤقت السكروز منخفضة (> 3 مل كل عينة)، السكروز كثافة المخزن المؤقت (> 12.5 مل كل عينة)، واستثارة الحل (> 1 مل).
- إضافة 25 ميكروليتر من ديثيوثريتول (DTT) إلى 25 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة وآخر ميكروليتر 25 من DTT إلى 25 مل من السكروز الكثافة المتدرجة المخزن المؤقت فقط قبل بدء تشغيل البروتوكول.
- وتغطي سطح تشريح مع رقائق الألومنيوم للتقليل من تلوث العينة بألياف من المناشف الورقية أو مقاعد البدلاء حماة، التي يمكن أن تسد موائع جزيئية القنوات المستخدمة لالتقاط نواة واحدة.
- رذاذ أدوات تشريح والفضاء مقاعد البدلاء مع حلاً تطهير رناسي. بالإضافة إلى ذلك، رش داخل أنبوب الخالطون دونس (في حالة استخدام تحلل الخلية المنظفات الصناعية والميكانيكية) وأنبوب أوك ريدج مع حلاً تطهير رناسي. شطف من أنبوب دونس واوك ريدج بالماء عالي النقاوة وخالية من رناسي.
- قبل chill جميع أنابيب جمع (50 مل المخروطية، والبلوط ريدج) وأنابيب الخالطون دونس على الجليد.
- البولندية النار سلسلة من الماصات باستور (في حالة استخدام تحلل الخلية الميكانيكية وناقص التوتر).
2-إعداد الحبل الشوكي
- في حالة استخدام أنسجة جديدة، euthanize الماوس باستنشاق أول أكسيد الكربون2 . في أعقاب القتل الرحيم، رش معطف الماوس مع الإيثانول 70% لتقليل التلوث الشعر في العينة.
- قطع رأس الماوس مع المقص جراحية حادة وخالية من رناسي. بعد ذلك، رفع بلطف البطن الجلد بالملقط وجعل شق بطول الجسم للكشف عن أجهزة الداخلية.
- افيسسيراتي الماوس عن طريق سحب الأجهزة الداخلية من تجويف الجسم باستخدام الملقط. عدم استخدام المناشف الورقية لتنظيف المنطقة أو إزالة الأجهزة، وهذا قد يعرض الملوثات. باستخدام مقص، قص العمود الفقري بين فقرات العمود الفقري L2 و L3.
ملاحظة: للممارسة، ويمكن تحقيق هذه الخطوة في أقل من 30 ثانية.- لإخراج الحبل الشوكي، تناسب 3 مل حقنه تحتوي على برنامج تلفزيوني المثلج بإبرة ¼ بوصة 25 جرام. ضع طرف الإبرة في نهاية العمود الفقري المقدسة. استخدام اصبعين لقرصة فقرات لإنشاء ختم ضيق حول غيض الإبرة واضغط على المكبس لإخراج الحبل الشوكي روسترالي. ضع الحبل الشوكي في طبق بتري مع برنامج تلفزيوني المثلج.
- عند هذه النقطة، تجميد الأنسجة وتخزينها في-80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور للمنظفات الصناعية والميكانيكية (الخطوة 3) أو ناقص التوتر والميكانيكية (الخطوة 4) تحلل.
- في حالة استخدام الأنسجة المجمدة، والحفاظ على الأنسجة في الثلج الجاف، تشرع في المنظفات الصناعية والميكانيكية (الخطوة 3) أو ناقص التوتر والميكانيكية (الخطوة 4) تحلل.
3-تحلل الخلية المنظفات الصناعية والميكانيكية
- وضع الحبل الشوكي القطني في الخالطون دونسي مبردة مسبقاً وإضافة 500 مل يبرد قبل تحلل المنظفات المخزن المؤقت.
ملاحظة: حبل الشوكي قطني ماوس هو مغ 325.5 ± مغ 63.9 الخطأ المعياري للوسط (وزارة شؤون المرأة، N = 4). 50 ملغ – 1.5 غرام أنسجة يمكن أن تستخدم بنجاح. - دونس مع 5 ضربات المدقة (مدقة 'فضفاض')، ثم 5-10 ضربات المدقة ب (المدقة 'مشددة'). تجنب رفع الخالطون خارج الحل تحلل ما بين السكتات الدماغية، وتجنب إدخال الفقاعات.
- ضع مصفاة 40 مم أكثر من أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل وبرويت مع 1 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة.
- إضافة 1 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة إلى الخالطون دونس التي تحتوي على نواة النفط الخام في المخزن المؤقت لتحلل وتخلط بلطف قبل بيبيتينج 2 – 3 مرات.
- تمرير الإعدادية نوى الخام عبر مصفاة 40 مم في أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل.
- تمرير مؤقت سكروز منخفضة 1 مل إضافية عبر مصفاة 40 مم، يصل الحجم النهائي إلى 3 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة و 500 مل من المخزن المؤقت تحلل.
- كرر الخطوات من 3.1 – 3.6 إذا كان الجمع بين الحبال متعددة، تجمع في أنبوب مخروطي الشكل نفسه.
- الطرد المركزي العينة في 3,200 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، صب المادة طافية. انتقل إلى الخطوة 5.
4-تحلل الخلية ناقص التوتر الميكانيكية
- مكان الحبل الشوكي القطني في 5 مل من المخزن المؤقت تحلل ناقص التوتر في طبق استنبات الأنسجة. استخدام نهاية حادة مقص الربيع لتقسم الحبل الشوكي، ثم استخدام مقص الربيع لقطع الحبل السري إلى قطع 3 – 4 مم، ولكن لم تخطر.
ملاحظة: 50 ملغ – 1.5 غرام أنسجة يمكن أن تستخدم بنجاح. - تبني على الجليد لمدة 15 دقيقة، يحوم 2 – 3 مرات.
- إضافة 5 مل عب المتوسطة إلى تمييع المخزن المؤقت تحلل ناقص التوتر.
- تريتوراتي الأنسجة 10 مرات مع 5 مل ماصة مصلية، أو حتى جميع قطع الأنسجة الانتقال بسلاسة من خلال فتح الماصة.
- تريتوراتي مع سلسلة من ثلاث ماصات باستور مصقول النار مع أقطار أضيق تدريجيا (~ 900-600 مم).
- لكل ماصة، تريتوراتي 5-15 مرة، تسمح الأنسجة تسوية وإزالة مل 1 – 2 من المادة طافية المحتوية على نواة معزولة ويمر عبر مصفاة 40 مم في أنبوب مخروطي مبردة مسبقاً 50 مل.
- بعد تريتوريشن مع ماصة باستور أصغر الحجم، ضمان تدفق هوموجيناتي سلاسة من خلال تلميح ماصة. تمرير حل المتبقية عبر مصفاة 40 مم في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
ملاحظة: يمكن ضبط إجمالي عدد تريتوريشنز النحو المرغوب فيه. سوف تظل السحايا الحبل الشوكي الماوس، ولكن من المهم أن تريتوراتي أي قطع مرئية من الحبل الشوكي. تمرير هوموجيناتي المتبقية عبر مصفاة 40 مترا. تجنب إدخال فقاعات أثناء تريتوريشن.
- الطرد المركزي العينة التي تمت تصفيتها في 1,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. بمجرد اكتمال الطرد المركزي، صب وتجاهل المادة طافية. انتقل إلى الخطوة 5.
5. التجانس والتدرج كثافة السكروز
- بعد الخطوة 3 أو 4، ريسوسبيند بيليه استخدام 3 مل من المخزن المؤقت السكروز منخفضة. دوامة برفق لإزالة بيليه من الجدار لتسهيل استثارة. واسمحوا العينة الجلوس على الجليد لمدة 2 دقيقة ونقل التعليق إلى أنبوب أوك ريدج.
- استخدام الخالطون في الإعداد 1، مجانسة الأنوية في المخزن المؤقت السكروز منخفضة ل 15 – 30 ثانية، حفظ العينة على الجليد.
ملاحظة: s استخدام 15 إذا كان استخدام الحبل الشوكي القطني واحد أو 30 ثانية في حالة استخدام تجميع عينات أو حبل الشوكي كله. - استخدام ماصة مصلية، طبقة 12.5 مل من كثافة السكروز العازلة تحت هوموجيناتي المخزن المؤقت السكروز منخفضة، مع الحرص على عدم خلق فقاعة أن يعطل الطبقات الكثافة.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 3,200 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- بمجرد اكتمال الطرد المركزي، فورا صب المادة طافية في حركة عبها.
ملاحظة: وحدة تخزين متبقية (أقل من 400 مل) السكروز المخزن المؤقت يمكن التخلص إذا كان المطلوب لإنتاج حجم أقل ونظافة العينة النهائية، ولكن هذا الحجم المتبقي تحتوي على نواة ويمكن الحفاظ على تعظيم العائد الأنوية. - استخدام 100 مل-1 مل من محلول استثارة، ريسوسبيند الأنوية المتبقية على الجدار. تجنب المايلين 'التجهم' أن يبقى مع إعداد المستندة إلى المنظفات.
- تصفية الأنوية من خلال مصفاة حجم مسام 30 – 35 ملم، وجمع في أنبوب مبردة مسبقاً.
- تحديد العائد الأنوية باستخدام هيموسيتوميتير لعد الأنوية تحت هدف X 10.
ملاحظة: يمكن إضافة تريبان الأزرق لتصور النوى، التي يجب أن تظهر زرقاء. ملاحظة كمية الحطام الخلوية. - تابع إلى الخطوة 6 أو 7.
6-كثافة موازية سنرنا-التسلسل: "منهاج الأكاديمية"7
- إجراء تسلسل سنرنا موازية على نطاق واسع (مثل، قطره Seq) الأسلوب كما تم وصفه سابقا7 مع إدخال التعديلات التالية:4
- ضبط الأنوية لتركيز نويات 225 كل مل نهائي.
- إعداد حبات المراقب بتركيز 250 الخرز كل مل.
- إعداد المخزن المؤقت تحلل مع ساركوسيل 0.7%.
- ضبط معدلات تدفق إلى 35 مل في الدقيقة الخرز و 35 مل في الدقيقة لانويه 200 مل في الدقيقة للنفط.
7-كثافة موازية سنرنا-التسلسل: "منصة تجارية"26
- أداء سنرنا-تسلسل موازية على نطاق واسع استخدام منصة تجارية (مثلاً، التعبير الجيني حل الكروم وحيد الخلية) المنتجات وفقا لإرشادات الشركة المصنعة26 مع إجراء التعديل التالي:
- أثر عكسي-النسخ، إضافة دورة إضافية لبكر أن يحسب عدد دورات للتضخيم كدنا استناداً إلى استرداد الخلية المستهدفة للتعويض عن انخفاض كدنا من نويات الخلايا بالمقارنة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هنا، نحن تنفيذ عزل نواة من الحبل الشوكي القطني الماوس الكبار المصب تسلسل الحمض النووي الريبي موازية على نطاق واسع. البروتوكول شملت ثلاثة عناصر رئيسية: الأنسجة التعطيل والخلوية تحلل السكروز وتجانس الكثافة الطرد المركزي (الشكل 1). في غضون ثوان، أثمر تحلل المنظفات الصناعية والميكانيكية إعداد نواة النفط خام مع عدد كبير من الأنوية فضلا عن الحطام الخلوية والأنسجة (الشكل 2A، الجدول 2). بعد خمس عشرة دقيقة، أثمر تحلل ناقص...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
والهدف النهائي لهذا البروتوكول عزل الأنوية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي عالية الجودة لتحليل النسخي المتلقين للمعلومات. علينا تكييف أساليب Seq سنرنا أجل الشخصية كافة أنواع الخلايا في الحبل الشوكي. وفي البداية، وجدنا أن الخلية النموذجية الانفصال من أساليب غير فعالة لتسلسل وحيد الخلية الجيش الملكي النيبالي، كما تعرضا لموت الخلايا العصبية الحبل الشوكي. وعلاوة على ذلك، حمل الخلية الانفصال من أساليب التعبير من مختلف النشاط والإجهاد استجابة الجينات التي تصل إلى عدة هوندريدفولد. 3 ,
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لدينا لا تضارب في الكشف.
شكر وتقدير
هذا العمل كان يدعمها برنامج NINDS داخلية (1 ضياء NS003153 02) و NIDCD (1 ضياء DC000059 18). ونحن نشكر لي ل. و C.I. دوبروت للدعم الفني ومناقشات مفيدة، وكاثي جيم لاستعراض المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| السكروز | Invitrogen | 15503-022 | |
| 1 M HEPES (الرقم الهيدروجيني = 8.0) | Gibco | 15630-080 | |
| CaCl 2< / sub> | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| MgAc | Sigma Aldrich | M5661-50G | |
| 0.5 M EDTA (الرقم الهيدروجيني = 8.0) | Corning | MT-46034CI | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 10197777001 | أضف DTT قبل استخدام |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| ماء خال من النوكلياز | Crystalgen | 221-238-10 | |
| 1 M Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني = 7.4) | Sigma Aldrich | T2194 | |
| 5 M NaCl | Sigma Aldrich | 5922C | |
| 1 M MgCl2< / sub> | Sigma Aldrich | M1028 | |
| Nonidet P40 | Sigma Aldrich | 74385 | |
| Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| B27 (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| 1x PBS | Crystalgen | 221-133-10 | |
| 0.04٪ BSA | New England Biolabs | B9000S | |
| 0.2 U / مو L RNAse مثبط | Lucigen | 30281-1 | |
| الطرد المركزي Oak Ridge | Thermo Scientific | 3118-0050 | |
| يمكن التخلص منه من القطن المتصل بالبورسليكات والزجاج باستور Pipets | فيشر Scientific | 13-678-8B | |
| الأنسجة الزجاجية Dounce (2 مل) | Kimble | 885303-002 | |
| مدقة زجاجية كبيرة الخلوص | Kimble | 885301-0002 | |
| مدقة زجاجية صغيرة الخلوص | Kimble | 885302-002 | |
| T 10 Basic Ultra Turrax Homogenizer | أداة | تشتيت 3737001 | |
| IKA (S 10 N &ndash ؛ 5G) | IKA | 3304000 | |
| Trypan Blue Stain (0.4٪) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 40 & mu ؛ مصفاة الخلايا m | Falcon | 352340 | |
| MACS SmartStrainers ، 30 مو ؛ m | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| أنابيب مخروطية | Denville Scientific | 1000799 | |
| Sorvall Legend XTR أجهزة الطرد المركزي | Thermo Fisher Scientific | 75004505 | |
| Fiberlite F15-6 x 100y دوار بزاوية | ثابتة Thermo Fisher Scientific | 75003698 | |
| الماصات التجسيمية: 5 مل ، 10 مل | Denville Scientific | P7127 | |
| مقياس الدم | Daigger Scientific | EF16034F | |
| Chemgenes Barcoding Beads | Chemgenes | Macosko-2011-10 | |
| RNaseZap RNase Depollution Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| Falcon Test Tube مع غطاء مصفاة الخلية (35 & mu ؛ م) | كورنينج | 352235 | |
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Chromium i7 Multiplex Kit ، 96 rxns | 10X Genomics | 120262 | |
| الكروم خلية واحدة 3 ' مجموعة المكتبة وجل حبة v2 ، 4 rxns | 10X الجينوم | 120267 | |
| الكروم أحادي الخلية A رقاقة ، 16 rxns | 10X | ||
| (60 مم × 15 مم) | كورنينج | 353002 |
المراجع
- Hrvatin, S., et al. Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).
- Hu, P., et al. Dissecting Cell-Type Composition and Activity-Dependent Transcriptional State in Mammalian Brains by Massively Parallel Single-Nucleus RNA-Seq. Molecular Cell. 68 (5), 1006-1015 (2017).
- Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq. Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).
- Sathyamurthy, A., et al. Massively Parallel Single Nucleus Transcriptional Profiling Defines Spinal Cord Neurons and Their Activity during Behavior. Cell Reports. 22 (8), 2216-2225 (2018).
- Tang, F., et al. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6 (5), 377-382 (2009).
- Campbell, J. N., et al. A molecular census of arcuate hypothalamus and median eminence cell types. Nature Neuroscience. 20 (3), 484-496 (2017).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Chen, R., Wu, X., Jiang, L., Zhang, Y. Single-Cell RNA-Seq Reveals Hypothalamic Cell Diversity. Cell Reports. 18 (13), 3227-3241 (2017).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967(2016).
- Shin, J., et al. Single-Cell RNA-Seq with Waterfall Reveals Molecular Cascades underlying Adult Neurogenesis. Cell Stem Cell. 17 (3), 360-372 (2015).
- Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).
- Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
- Villani, A. C., et al. Single-cell RNA-seq reveals new types of human blood dendritic cells, monocytes, and progenitors. Science. 356 (6335), (2017).
- Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347 (6226), 1138-1142 (2015).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7, 11022(2016).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (20), (2008).
- Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue. Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).
- Nohara, K., Chen, Z., Yoo, S. H. A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation. Journal of Visualized Experiments. (125), (2017).
- Halder, R., et al. DNA methylation changes in plasticity genes accompany the formation and maintenance of memory. Nature Neuroscience. 19 (1), 102-110 (2016).
- Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
- 10X Genomics. Sample Preparation Demonstrated Protocols: Isolation of Nuclei for Single Cell RNA Sequencing. , Available from: https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/sample-prep/doc/demonstrated-protocol-isolation-of-nuclei-for-single-cell-rna-sequencing (2018).
- 10X Genomics. Single Cell 3' Reagent Kits v2 User Guide. , (2018).
- Fu, Y., Rusznak, Z., Herculano-Houzel, S., Watson, C., Paxinos, G. Cellular composition characterizing postnatal development and maturation of the mouse brain and spinal cord. Brain Structure and Function. 218 (5), 1337-1354 (2013).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031(2017).
- Bakken, T. E. Equivalent high-resolution identification of neuronal cell types with single-nucleus and single-cell RNA-sequencing. bioRxiv. , (2018).
- Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing
Posted by JoVE Editors on 11/20/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing. The Protocol section was updated.
Step 3.1 was updated from:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 mL pre-chilled detergent lysis buffer.
to:
Place the lumbar spinal cord in a pre-chilled Dounce homogenizer and add 500 μL pre-chilled detergent lysis buffer.
Step 3.6 was updated from:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 mL of the lysis buffer.
to:
Pass an additional 1 mL low sucrose buffer over the 40 mm strainer, bringing the final volume to 3 mL of the low sucrose buffer and 500 μL of the lysis buffer.
Step 5.5 was updated from:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 mL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
to:
Once the centrifugation is complete, immediately decant the supernatant in a flicking motion.
NOTE: A residual volume (less than 400 μL) of sucrose buffer can be discarded if desired to produce a lower volume and cleaner final sample, but this residual volume does contain nuclei and can be preserved to maximize nuclei yield
Step 5.6 was updated from:
Using 100 mL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
to:
Using 100 μL - 1 mL of resuspension solution, resuspend the nuclei remaining on the wall. Avoid the myelin ‘frown’ that remains with the detergent-based preparation.
Steps 6.1.1 - 6.1.4 were updated from:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per mL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per mL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 mL per min for beads, 35 mL per min for nuclei, and 200 mL per min for oil.
to:
- Adjust nuclei to a final concentration of 225 nuclei per μL.
- Prepare barcoded beads at a concentration of 250 beads per μL.
- Prepare the lysis buffer with 0.7% sarkosyl.
- Adjust the flow rates to 35 μL per min for beads, 35 μL per min for nuclei, and 200 μL per min for oil.
الوسوم
