مقالة منهجية

رصد فرس النهر مما يشير إلى نشاط المسار باستخدام بيوسينسور القامع (لاتس لاتفيا) ورم كبير القائم على لوسيفراس

DOI:

10.3791/58416

⸱

سبتمبر 13, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بيوسينسور على أساس لوسيفراس لقياس نشاط كيناز القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا)-كيناز مركزية في فرس النهر مما يشير إلى المسار. وقد بيوسينسور هذه التطبيقات المتنوعة في البحوث الأساسية ومتعدية الجنسيات تهدف إلى بحث فرس النهر ممر المنظمين في المختبر و في فيفو.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فرس النهر مما يشير إلى مسار منظم مصانة من حجم الجهاز ولديها أدوار هامة في بيولوجيا سرطان والتنمية. نظراً للتحديات التقنية، ما زال من الصعب تقييم نشاط هذا المسار إرسال الإشارات وتفسيرها في سياق بيولوجية. الكتابات الموجودة على القامع الورم كبير (لاتس لاتفيا) يعتمد على الأساليب النوعية ولا يمكن بسهولة أن تكون زيادة للفحص. في الآونة الأخيرة، قمنا بتطوير biosensor المستندة إلى الإضاءة الحيوية لرصد النشاط كيناز لاتس لاتفيا-أ الأساسية المكون من تتالي كيناز فرس النهر. هنا، يمكننا وصف الإجراءات لكيف يمكن استخدام هذا بيوسينسور لاتس لاتفيا (لاتس لاتفيا-بكالوريوس) لتوصيف المنظمين المسار فرس النهر. أولاً، نحن نقدم بروتوكول مفصل للتحقيق في تأثير مرشح البروتين أوفيريكسبريسيد (مثلاً، VEGFR2) في نشاط لاتس لاتفيا لاتس لاتفيا-البكالوريوس باستخدام. ثم نعرض كيف يمكن أن تستخدم اللاتس-البكالوريوس لشاشة المانع كيناز صغيرة. هذا البروتوكول يمكن عمليا رفع مستوى أداء شاشات أكبر، والتي ستحدد ولا شك أن المنظمين رواية المسار فرس النهر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فرس النهر مما يشير إلى مسار للمرة الأولى في المورفولوجية كمنظم رواية لنمو الخلايا، وحجم الحيوان1،2. منذ اكتشاف أولى، ثمة دلائل متزايدة مقنع أظهرت أن المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في التنمية (مثلالتنمية الجنينية المبكرة، والتحكم في حجم الجهاز وثلاثي الأبعاد [ثلاثية الأبعاد] مورفولوجيا)، توموريجينيسيس ( مثلالورم، ورم خبيث، تولد الأوعية، ومحصنة ضد التهرب من دفع، عدم الاستقرار المجيني، إجهاد استجابة والتنمية والمقاومة للعقاقير)، والتوازن الأنسجة (مثلاً، تجديد الخلايا الجذعية والتمايز وتجديد الأنسجة بعد الإصابة) 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10-إشارات فرس النهر هو في كثير من الأحيان dysregulated في مختلف أنواع السرطان7،،من89،10،11،12. ولذلك، توضيح وظائف المسار فرس النهر في بيولوجيا السرطان والمداواة والطب التجديدي قد أصبحت واحدة من المناطق الأكثر سخونة في البحوث الطبية الحيوية.

في موجز، في مسار فرس النهر، عند التنشيط بواسطة المنظمين المنبع (مثلاً، خلية خلية الاتصال والمغذيات الإجهاد والمصفوفة خارج الخلية [ECM])، مؤنزم MST1/2 (MST؛ homologs الثدييات من فرس النهر المورفولوجية ) سيرين/ثريونين (S/T) فوسفوريلاتي/تنشيط محول البروتينات hMOB1 و WW45، فضلا عن مؤنزم LATS1/2 (لاتس لاتفيا) التي، في وقت لاحق، فوسفوريلاتي المنشط المشارك النسخي ياب وفي بارالوج طاز في HX(H/R/K)XX(S/T) مصانة (ح، الحامض الأميني؛ البحث والتطوير، ارجينين؛ ك، يسين؛ S، سيرين؛ تي، ثريونين؛ X، أي الأحماض الأمينية) الزخارف، بما في ذلك11،S127 ياب وطاز-S8912. فوسفوريلاتيد S127 ياب (ياب-pS127) وفوسفوريلاتيد S89 طاز (طاز-pS89) التي تدهورت بسبب أوبيكويتيناتيون أو ربط البروتين هيولى 14-3-3 ويمنعون من التفاعل مع عوامل النسخ TEAD1-4 في النواة مجرى النهر ترانساكتيفاتي الجينات المعنية بتكاثر الخلايا والخلايا (الشكل 1). على الرغم من الاهتمام الهائل في مسار فرس النهر، يوجد عدد قليل من الأدوات لقياس الإشارات فرس النهر وتلك التي كانت محدودة تاريخيا للصحفيين إخراج النسخي ياب/تاز/تيد. وفي الواقع، حتى وقت قريب جداً، كانت هناك أية أدوات لقياس حيوية ونشاط لفرس النهر مما يشير إلى المكونات بطريقة كمية، في الوقت الحقيقي، والفائق، وغير الغازية في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.

نظراً لدينا فهم دور تفاعلات البروتين البروتين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الناشئة، هناك اهتمام كبير بتطوير الأدوات التي يمكن استخدامها لدراسة هذه التفاعلات في طريقة في الوقت الحقيقي والكمية13، 14،،من1516. وفي الواقع، كان هناك تقدما كبيرا في تطوير الاستراتيجيات الحيوية التحليلية، بما فيها (Y2H) اثنين-الهجين الخميرة17والسطحية مأكل مثل الطحين الرنين (موارد البرنامج الخاصة)18فورستر الرنين الطاقة نقل (بكى)19 معبراً، تقييم تفاعلات البروتين البروتين. ومع ذلك، تحمل هذه النهج الحد من التي تحتاج إلى التحسين الكبير لتوجه مراسل، مثل أنه يجب اختبار العديد من بنيات للعثور على عنصر كفاءة. علاوة على ذلك، قد هذه النهج أيضا نسبة الإشارة إلى الضوضاء منخفضة نسبيا، مثل أن المميزين إشارات إيجابية حقيقية يمكن أن يكون تحديا.

وقد وضعت فحوصات البروتين التكامل التغلب على هذه القيود. الجيل الأول من البروتين التكامل فحوصات تستند إلى تقسيم البروتينات الفلورية متعدد الألوان ولا يمكن أن يحل20من القيود المذكورة أعلاه. بروتينات فلورية متعدد الألوان تتكون من مجال واحد فقط، مما يجعل من الصعب على تقسيمها إلى اثنين من أجزاء منفصلة مستقرة مع تقارب منخفضة و الضوضاء الخلفية21. وفي وقت لاحق، تم تحديد لوسيفراس اليراع كمرشح جديد لاستخدامها في وضع انقسام البروتين التكامل فحوصات. في هذا النهج، يتم تقسيم لوسيفراس اليراع في الشظايا اثنين (لوسيفراس الطرفي ن والمحطة الطرفية ج [نلوك وكلوك]) مع كل جزء تنصهر فيها بروتين المستهدف للفائدة. إذا كان يوجه نلوك وكلوك إلى قرب عند تفاعل البروتينات المستهدفة اثنين، هو تشكيل النشاط لوسيفراس ويتم إنشاء ضوء طرحه حضور الركيزة لوسيفرين و ATP22. في عام 2001، عن طريق إجراء قطع اندماجي فرز باستخدام مكتبة تحتوي على شظايا نلوك وكلوك في مواقع مختلفة ويعلق على البروتينات مع linkers مختلفة، وضع باولموروجان ومحمد في جامعة ستانفورد تقسيم أمثل--اليراع لوسيفراس نظام التكامل ساعد جزء ل تفاعلات البروتين البروتين23. في هذا النظام، يتم قطع لوسيفراس اليراع في الحمض الأميني (أإ) 398 لتشكيل نلوك وكلوك، التي ترتبط البروتينات اثنين من اهتمام باستخدام رابط مرنة ثمانية جليكاين المخلفات وبقايا سيرين اثنين.

باستخدام نهج مماثل، وضعنا مؤخرا اللاتس جديدة-درجة بكالوريوس بالصمامات نلوك إلى 15 ألف ياب المحيطة بموقع الفسفرة لاتس لاتفيا في S127 (YAP15) وكلوك مع 14-3-3. ولم يستخدم البروتين ياب كاملة الطول، لتجنب الخلط إشارات بتعديلات بوستترانسلاشونال ياب (مثلاً، الفسفرة في مواقع أخرى وأوبيكويتيناتيون) من قبل المنظمين التمهيدية الأخرى. غير إينفاسيفيلي لاتس لاتفيا-BS المعروضة هنا يمكن رصد فرس النهر مما يشير إلى النشاط سواء في المختبر في الخلايا الحية و في فيفو في الفئران20،24 (الشكل 2). هنا، نحن وصف بروتوكول مفصل لقياس اللاتس كيناز النشاط في المختبر باستخدام لاتس لاتفيا-BS. أولاً، نحن إظهار كيف يمكن استخدام لاتس لاتفيا-البكالوريوس للتحقيق في تأثير البروتين أوفيريكسبريسيد على نشاط لاتس لاتفيا. ثم نعرض كيف يمكن استخدام في بيوسينسور لرصد نشاط المسار فرس النهر بعد العلاج مع وكلاء تنظم المسار فرس النهر. يمكن استخدام هذا البروتوكول تحديد وتوصيف إشارات المسارات أو المحفزات التي تنظم النشاط كيناز لاتس لاتفيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-تحقيق منظم المفترضة لفرس النهر مما يشير إلى استخدام لاتس لاتفيا-بكالوريوس

  1. الطلاء وتعداء الخلايا
    1. إعداد ثقافة الخلية
      1. الحارة 1 x PBS، دميم التي تحتوي على 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين، و 0.25% التربسين-أدتا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة حوالي 30 دقيقة.
      2. دقة تنظيف خزانة السلامة الأحيائية مع الإيثانول 70%.
      3. ضع الأطباق زراعة الأنسجة، باستور الممصات، الماصات المصلية، ونصائح ماصة في زراعة الأنسجة غطاء محرك السيارة كما هو مطلوب.
      4. إخراج 1 × برنامج تلفزيوني، ووسائط الإعلام، والتربسين يدتا من حمام الماء وتنظيفها باستخدام الإيثانول 70% ووضعها في غطاء محرك السيارة.
    2. صيانة وطلاء من الخلايا تعداء
      1. اختر خط خلية مع تعداء عالية كفاءة (مثلاً، HEK293) للتجربة. تحقق للتعبير عن مكونات المسار فرس النهر في هذا الخط خلية بوصمة عار الغربية للتأكد من إشارات فرس النهر نشطاً.
      2. تنمو خلايا HEK293 في دميم في أطباق بتري 10 سم في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. رصد الخلايا تحت مجهر كل يوم. ممر الخلايا كما هو موضح أدناه عندما يلاحظ كونفلوينسي 80-90%.
      3. غسل الخلايا بإضافة 5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني في لوحة ويحوم بلطف اللوحة يسفط وسائل الإعلام تماما.
      4. أضف 1 مل يدتا التربسين اللوحة. دوامة لوحة لضمان أن التربسين يغطي بالتساوي الخلايا.
      5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة2 CO لمدة 5 دقائق أو حتى يتم فصل جميع الخلايا.
      6. إضافة 4 مل من وسائل الإعلام (بنسبة 10% FBS و 1% البنسلين/ستربتوميسين) إلى تحييد التربسين، ريسوسبيند الخلايا من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات، والاستغناء عن عشر (0.5 مل) من الخلايا في اللوحات الجديدة 100 مم (لنسبة وفاة 01:10) التي تحتوي على 9.5 مل من وسائط كاملة.
      7. تعداء لاتس لاتفيا-بكالوريوس ، عد الخلايا باستخدام خلايا 2 × 105 هيموسيتوميتير ولوحة في كل من لوحة 12-جيدا 24 ساعة قبل تعداء جيدا.
        ملاحظة: باستخدام أرقام الخلية أعلى قد تزيد الإشارات الخلفية طرحه كفرس النهر مما يشير إلى نشاط تنظمه كونفلوينسي الخلية. استخدام أرقام الخلية السفلي قد زيادة حساسية الكواشف تعداء الخلايا وزيادة خلية الموت24.
    3. تعداء لاتس لاتفيا-بكالوريوس وحدها أو جنبا إلى جنب مع الجينات المرشحة
      1. مينيبريب لاتس لاتفيا-بكالوريوس والبلازميدات (نلوك-YAP15-pcDNA3.1-هيجرو و 14-3-3-CLuc-pcDNA3.1-Hygro) جديدة من البكتيريا DH5a السائلة الثقافة (ضرورية لتحقيق تعبير لاتس لاتفيا-بكالوريوس أمثل).
      2. ح 1 قبل تعداء، نضح المتوسطة من اللوحة وإضافة 500 ميليلتر من متوسط النمو الكامل لكل بئر من لوحات 12-جيدا والعودة الخلايا للحاضنة.
        ملاحظة: البروتوكول التالي يصف الأساليب تعداء استخدام كاشف تعداء المستندة إلى البوليمر متاحة تجارياً. الكواشف تعداء أخرى قد تكون أيضا مناسبة تعداء؛ ومع ذلك، نحن لم بعد اختبار لهم.
      3. جعل الحلول A و B كما هو موضح في الجدول 1. ترانسفيكشنز ن، جعل (N + 0.5) × مواده حل ب.
      4. فورا إضافة الكاشف المخفف تعداء المستندة إلى البوليمر (حل ب) للحمض النووي (الحل A). "الماصة؛" صعودا وهبوطاً بلطف مزيج.
      5. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لمجمعات تعداء للنموذج.
      6. إضافة إجمالي حجم (76 ميليلتر) مجمعات تعداء dropwise لكل بئر من لوحة 12-جيدا مع دوامات لطيف.
      7. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها (18 – 24 ح) عند 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: للخلايا التي تراعي الكواشف المستندة إلى البوليمر تعداء، يمكن تقليل فترة الحضانة إلى ح 5.
      8. قم بإزالة الوسائط التي تحتوي على مجمع تعداء اليوم بعد تعداء، واستبدالها بوسائل الإعلام كاملة جديدة. ثقافة الخلايا في 37 درجة مئوية ليوم آخر لإجراء فحص لوسيفراس.
  2. تحليل لوسيفراس
    ملاحظة: يتم استخدام "نظام مقايسة مراسل لوسيفراس" الكشف عن اليراع و رينيلا معا في تحليل واحد لفحوصات لوسيفراس. إذا لم يستخدم رينيلا كرقابة داخلية، إجراء المقايسة لوسيفراس خطوة واحدة عن طريق إضافة لاريي دون إضافة الكاشف الكشف رينيلا .
    1. إعداد ليساتيس خلية
      1. تمييع 5 x تحلل السلبي العازلة (الإرشاد) مع الماء المقطر كما يلي:
      2. مطلوب x PLB الحجم الإجمالي من 1 = N x (50 ميكروليتر من 5 × الإرشاد) + 200 ميكروليتر من dH2O = N x 250 ميكروليتر من 1 x PLB كل من لوحات 12-جيدا جيدا (N = عدد العينات).
      3. نضح وسائل الإعلام تماما. أضف 1 مل من 1 x برنامج تلفزيوني في كل بئر. دوامة اللوحة برفق لإزالة فصل الخلايا ووسائط النمو المتبقية. نضح PBS 1 x تماما. تأكد من أن لا 1 المتبقية س يظل برنامج تلفزيوني قبل إضافة 1 x PLB.
      4. إضافة 250 ميكروليتر 1 × الإرشاد/جيدا.
      5. وضع لوحات الثقافة على منصة هزاز مع هزاز لطيف لضمان تغطية كاملة وحتى من أحادي الخلية الطبقة مع 1 x PLB. صخرة لوحات الثقافة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للخلايا إلى ليسي.
      6. نقل ليساتي إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    2. قياس الإشارات طرحه
      1. أخرج لاريي (20 ميكروليتر في عينة) من-80 درجة مئوية وحجته أنه على درجة حرارة الغرفة.
      2. إعداد رينيلا الكشف عن الكاشف لفحوصات N: إضافة (N + 1) × 0.4 ميكروليتر من 50 × الركازة (N + 1) × 19.6 ميكروليتر من المخزن المؤقت الخاص به.
      3. بريديسبينسي 10 ميكروليتر من كل خلية ليساتي لأنابيب 1.5 مل.
      4. برنامج luminometer القيام بتأخير بريميسوريمينت 2-s، تليها فترة قياس 10-s لكل مقايسة لوسيفراس المزدوج.
        ملاحظة: القياسات الأولى والثانية سوف تكون المقابلة لإشارة لاتس لاتفيا-بكالوريوس وإشارة التحكم الداخلية رينيلا ، على التوالي. ويمكن استخدام أي لومينوميتير متوافقة مع لوسيفراس مفرد أو مزدوج.
      5. نقل 20 ميكروليتر من كاشف ﻻري بعناية في أنبوب واحد وسرعة "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 3 لأنها مزيج.
      6. ضع الأنبوبة في لومينوميتير على الفور والشروع في القراءة.
      7. إزالة أنبوب عينة من لومينوميتير وفورا إضافة 20 ميكروليتر من كاشف رينيلا ، ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً 3 x. إحضار العينة في لومينوميتير والشروع في القراءة التالية. تسجيل القياسات.
      8. تجاهل الأنبوبة رد الفعل والشروع في العينة التالي.

2. شاشة "تحديد فرس النهر ممر المنظمين استخدام" لاتس لاتفيا-بكالوريوس

  1. زراعة الخلايا وترانسفيكشنز
    1. الثقافة HEK293AD الخلايا كما هو موضح في القسم 1-1.
      ملاحظة: HEK293AD ملتصقة أكثر من غيرها من خطوط الخلايا HEK293، مما يجعل من خط خلية جيدة للاستخدام في شاشات.
    2. فصل الخلايا كما هو موضح في القسم 1.1.2. عد ولوحة 2 × 106 خلايا في لوحات 100 ملم ح 24 قبل تعداء.
    3. نضح الوسائط من اللوحة ح 1 قبل تعداء، والاستعاضة عنها مع 5 مل وسائط النمو كاملة جديدة.
    4. جعل الحلول A و B كما هو موضح في الجدول 2.
    5. فورا إضافة الكاشف المخفف تعداء المستندة إلى البوليمر (حل ب) للحمض النووي (الحل A). "الماصة؛" صعودا ونزولاً المزيج.
    6. احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح لمجمعات تعداء للنموذج.
      1. إضافة إجمالي حجم (500 ميليلتر) مجمعات تعداء الخلايا مع دوامات لطيف dropwise.
      2. احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      3. وفي اليوم التالي تريبسينيزي وحساب الخلايا. لوحة 1 × 104 إلى 2 × 104 خلايا في كل بئر من صفيحة 96-جيدا في إجمالي حجم 100 ميليلتر من وسائل الإعلام كل بئر. احتضانها ليوم آخر.
    7. وفي اليوم التالي إضافة الجزيئات الصغيرة وكلاء تنظم المسار فرس النهر بتركيز نهائي 10 ميكرون لكل بئر، ح 1-4 قبل إجراء الفحص لوسيفراس.
      ملاحظة: للجزيئات الصغيرة معظم/وكلاء، لعلاج ح 4 في 10 مكم لا يؤثر على بقاء الخلية. وإذا استخدم بتركيز أقل، قد تمدد العلاج لفترة أطول من الزمن.
  2. تحليل لوسيفراس
    1. في المختبر بالانزيم لوسيفراس
      1. نضح وسائط الإعلام من الخلايا تماما. تغسل الخلايا مع 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 في كل بئر. نضح تماما.
      2. إضافة 20 ميليلتر من 1 x PLB (إعداد كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.1) إلى كل من لوحات 96-جيدا جيدا.
      3. وضع لوحات الثقافة على منصة هزاز مع هزاز لطيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      4. نقل 20 ميليلتر من كاشف ﻻري في كل بئر و "الماصة؛" صعودا وهبوطاً x 3 لخلط بعناية.
      5. ضع اللوحة في لومينوميتير لوحة القراءة على الفور والبدء في القراءة.
    2. الفحص لوسيفراس الخلية الحية
      1. جعل 11 س د-لوسيفرين الأسهم على النحو التالي: حل 1.5 ملغ مسحوق لوسيفرين د في 1 مل من العادي الثقافة الإعلامية.
      2. نقل 10 ميليلتر من س 11 د-لوسيفرين إلى كل جيدا ومزجها بلطف مع وسائط الإعلام الذي بالفعل في البئر.
      3. استبدال الخلايا في الحاضنة لمدة 10 دقائق.
      4. ضع اللوحة في لومينوميتير والشروع في القراءة.
        ملاحظة: إذا لم تكن كثافة إشارة قوية بما يكفي في هذا التركيز من د-لوسيفرين، ميليلتر 10 آخر مخزون لوسيفرين د قد تضاف إلى الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان كوترانسفيكتيد لاتس لاتفيا-البكالوريوس مع جينات مختلفة لتقييم أثرها على النشاط اللاتس (الشكل 3). وفي هذه التجربة، استخدمت رينيلا كرقابة داخلية. تعبير عابر من 5SA ياب، نموذج نشط تأسيسي ياب، أسباب ارتفاع مستويات الأهداف النسخي ياب وزيادة لاحقة في النشاط كيناز لاتس لاتفيا من خلال مسار التغذية مرتدة المنشأة25. MST، المنشط المنبع من لاتس لاتفيا في مسار فرس النهر (الشكل 1)، يزيد أيضا من كثافة إشارة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما المسار فرس النهر تلعب أدواراً حاسمة في مختلف العمليات البيولوجية، والتقلبات مسار فرس النهر يؤدي إلى السرطان6، كيف ينظم المسار فرس النهر في الاستجابة للمحفزات المختلفة ليست مفهومة تماما. وبالإضافة إلى ذلك، كان هناك لا نظام في الوقت الحقيقي والكمية لتقييم نشاط المكونات الأساسية فرس النهر. مؤخرا، نحن البلدان المتقدمة النمو، والتحقق من صحة بيوسينسور رواية لقياس النشاط كيناز لاتس لاتفيا في مسار فرس النهر24. ويمكن استخدام هذا بيوسينسور ليس فقط كمياً ودقة رصد فرس النهر مما ي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الكندي "البحوث الصحية" (استوفوا #119325، 148629) والكندي الثدي السرطان مؤسسة (كبكف) إلى س وص. تا معتمد من قبل فانييه كندا الدراسات العليا المنح الدراسية والمنح الدراسية الدراسات العليا الدولية أونتاريو. هجفر معتمد من قبل "الملكة إليزابيث الثانية خريج منحة دراسية" في مجال العلم والتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Trypsin-EDTA  < / strong>Life Technologies25200560.25٪
<قوي>مصل بقري الجنين (FBS)< / قوي>سيجماF1051
<قوي>DMEMسيجماD6429-500 ملDMEM مع نسبة عالية من الجلوكوز & nbsp ؛
Penicillin Streptomycin< / strong>Life Technologies15140122
PolyJet In vitro < / em> كاشف نقل الحمض النووي   ؛ < / strong>SignagenSL100688.5
5x عازلة التحلل السلبي< / strong>PromegaE194A30 مل
Dual-Glo & reg ؛ نظام فحص Luciferase < / قوي >PromegaE2940100 مل
عدة < قوي > 20/20 مقياس إضاءة < / قوي >تيرنر بيوأنظمة998-2036إضاءة قارئ أنبوب
واحد < قوي > GloMax & reg ؛ الملاح مع حاقنات مزدوجة < / قوي >PromegaGM201096 بئر قارئ الألواح مقياس الإضاءة
مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Justice, R. W., Zilian, O., Woods, D. F., Noll, M., Bryant, P. J. The Drosophila tumor suppressor gene warts encodes a homolog of human myotonic dystrophy kinase and is required for the control of cell shape and proliferation. Genes & Development. 9 (5), 534-546 (1995).
  2. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121 (4), 1053-1063 (1995).
  3. Taha, Z., Janse van Rensburg, H. J., Yang, X. The Hippo Pathway: Immunity and Cancer. Cancers. 10 (4), 94(2018).
  4. Maugeri-Saccà, M., De Maria, R. The Hippo pathway in normal development and cancer. Pharmacology & Therapeutics. 186, 60-72 (2018).
  5. van Rensburg, H. J. J., Yang, X. The roles of the Hippo pathway in cancer metastasis. Cellular Signalling. 28 (11), 1761-1772 (2016).
  6. Yeung, B., Yu, J., Yang, X. Roles of the Hippo pathway in lung development and tumorigenesis. International Journal of Cancer. 138 (3), 533-539 (2016).
  7. Zhao, Y., Yang, X. The Hippo pathway in chemotherapeutic drug resistance. International Journal of Cancer. 137 (12), 2767-2773 (2015).
  8. Yu, F. -X., Guan, K. -L. The Hippo pathway: regulators and regulations. Genes & Development. 27 (4), 355-371 (2013).
  9. Yang, X., Xu, T. Molecular mechanism of size control in development and human diseases. Cell Research. 21 (5), 715(2011).
  10. Visser, S., Yang, X. LATS tumor suppressor: a new governor of cellular homeostasis. Cell Cycle. 9 (19), 3892-3903 (2010).
  11. Zhao, B., et al. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control. Genes & Development. 21 (21), 2747-2761 (2007).
  12. Hao, Y., Chun, A., Cheung, K., Rashidi, B., Yang, X. Tumor suppressor LATS1 is a negative regulator of oncogene YAP. Journal of Biological Chemistry. 283 (9), 5496-5509 (2008).
  13. Ozawa, T., Kaihara, A., Sato, M., Tachihara, K., Umezawa, Y. Split Luciferase as an Optical Probe for Detecting Protein. Protein Interactions in Mammalian Cells Based on Protein Splicing. Analytical Chemistry. 73 (11), 2516-2521 (2001).
  14. Hashimoto, T., Adams, K. W., Fan, Z., McLean, P. J., Hyman, B. T. Characterization of oligomer formation of amyloid-β peptide using a split-luciferase complementation assay. Journal of Biological Chemistry. 286 (31), 27081-27091 (2011).
  15. Decock, M., et al. Analysis by a highly sensitive split luciferase assay of the regions involved in APP dimerization and its impact on processing. FEBS Open Bio. 5 (1), 763-773 (2015).
  16. Azad, T., Tashakor, A., Rahmati, F., Hemmati, R., Hosseinkhani, S. Oscillation of apoptosome formation through assembly of truncated Apaf-1. European Journal of Pharmacology. 760, 64-71 (2015).
  17. Brückner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).
  18. Pattnaik, P. Surface plasmon resonance. Applied Biochemistry and Biotechnology. 126 (2), 79-92 (2005).
  19. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current Opinion in Biotechnology. 6 (1), 103-110 (1995).
  20. Azad, T., Tashakor, A., Hosseinkhani, S. Split-luciferase complementary assay: applications, recent developments, and future perspectives. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 406 (23), 5541-5560 (2014).
  21. Hu, C. -D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nature Biotechnology. 21 (5), 539-545 (2003).
  22. Hosseinkhani, S. Molecular enigma of multicolor bioluminescence of firefly luciferase. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (7), 1167-1182 (2011).
  23. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Combinatorial library screening for developing an improved split-firefly luciferase fragment-assisted complementation system for studying protein-protein interactions. Analytical Chemistry. 79 (6), 2346-2353 (2007).
  24. Azad, T., et al. A LATS biosensor screen identifies VEGFR as a regulator of the Hippo pathway in angiogenesis. Nature Communications. 9 (1), 1061(2018).
  25. Moroishi, T., et al. A YAP/TAZ-induced feedback mechanism regulates Hippo pathway homeostasis. Genes & Development. 29 (12), 1271-1284 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293

مقالات ذات صلة