Method Article

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

DOI:

10.3791/58441

⸱

December 10th, 2018

 ,  , 
1Division of Integrative Biosciences and Biotechnology, Pohang University of Science and Technology, 2Department of Life Sciences, Pohang University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا يصف لنا وضع بروتوكول للتعبير عن البروتينات في بروتوبلاستس باستخدام أسلوب التحويل شماعة بوساطة. يوفر الأسلوب التعبير سهلة للبروتينات للفائدة، وتحقيق كفاءة الترجمة البروتين وعملية الاستيراد لمختلف الظروف التجريبية المجراة في.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بلاستيدات الخضراء هو عضية أساسية المسؤولة عن مختلف العمليات الخلوية في النباتات، مثل عملية التمثيل الضوئي وإنتاج العديد من نواتج الأيض الثانوية والدهون. المعايشة تتطلب عددا كبيرا من البروتينات لهذه العمليات الفسيولوجية المختلفة. أكثر من 95% بروتينات بلاستيدات الخضراء من ترميز نواة واستيرادها في الجبيلة من سيتوسول بعد الترجمة في ريبوسوم سيتوسوليك. وهكذا، استيراد السليم أو استهداف هذه البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء للمعايشة أمر أساسي للأداء السليم للمعايشة، فضلا عن الخلية النباتية. البروتينات المرمزة بنواة بلاستيدات الخضراء تحتوي على تسلسلات إشارة لاستهداف محددة للمعايشة. الآلات الجزيئية مترجمة إلى بلاستيدات الخضراء أو سيتوسول تعترف بهذه الإشارات، والقيام بعملية الاستيراد. للتحقيق في آليات الاستيراد البروتين أو استهداف للمعايشة في فيفو، قمنا بتطوير أسلوب المستندة إلى جبلة مجردة سريعة وفعالة لتحليل البروتين استيراد المعايشة لنبات. في هذا الأسلوب، ونحن نستخدم بروتوبلاستس المعزولة من أنسجة أوراق نبات. هنا، نحن نقدم بروتوكول مفصل لاستخدام بروتوبلاستس للتحقيق في الآلية التي يتم استيرادها البروتينات إلى المعايشة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بلاستيدات الخضراء واحدة من العضيات الأكثر أهمية في النباتات. واحدة من المهام الرئيسية للمعايشة القيام بعملية التمثيل الضوئي1. الجبيلة أيضا الاضطلاع بكثير من التفاعلات الكيميائية الحيوية الأخرى لإنتاج الأحماض الدهنية والأحماض الأمينية، النيوكليوتيدات ونواتج الأيض الثانوية العديدة1،2. لكل ردود الفعل هذه، تتطلب المعايشة عدد كبير من أنواع مختلفة من البروتينات. ومع ذلك، يتضمن الجينوم بلاستيدات الخضراء الجينات فقط حوالي 1003،4. ولذلك، يجب استيراد المعايشة غالبية البروتينات على من سيتوسول. في الواقع، قد أظهرت معظم بلاستيدات الخضراء الب....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-نمو النباتات نبات

  1. تحضير 1 لتر جامبورج B5 المتوسطة (B5) عن طريق إضافة ز 3.2 من B5 المتوسطة بما في ذلك الفيتامينات، 20 غراما من السكروز 0.5 غرام من حامض السلفونيك الإيثان 2-(N-morpholino) (MES) لحوالي 800 مل مياه، وضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع هيدروكسيد البوتاسيوم (KOH). جلب المياه إضافة منزوع أكثر الحجم الإجمالي إلى 1 ز 8 إضافة ل. فيتواجار والاوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية.
  2. تسمح على المديين المتوسط وباردة وصولاً إلى 55 درجة مئوية وتصب 20 – 25 مل الوسط B5 في طبق بتري (9 سم في القطر، 1.5 سم في الطول) في هيئة نظيفة. لوحات جافة لمدة 2-3 أيام، حزمة لهم مع التفاف نظيفة، والاحتفاظ بها في ثلاجة حتى الاستخدام.
  3. التمويل نبات تعقيم....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن فحص استيراد البروتينات إلى المعايشة باستخدام نهجين اثنين: التحليل المجهري و immunoblot الأسفار بعد فصل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة-بوساطة. وهنا استخدمنا كرات الدم الحمراء-nt:GFP، بناء انصهار ترميز مخلفات الأحماض الأمينية الطرفي ن 79 من كرات الدم الحمراء المحتوية على الببتيد العبور للتجارة والنقل. عندما يتم استيراد البروتينات إلى المعايشة، ومضان أخضر إشارات من البروتين المستهدف كرات الدم الحمراء-ينبغي دمج nt:GFP مع إشارات الفلورسنت الأحمر من الكلوروفيل السيارات-الأسفار، كما درست بالأ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدمنا بروتوكول مفصلاً لاستخدام بروتوبلاستس نبات لدراسة البروتين استيراد المعايشة. هذا الأسلوب قوية للتحقيق في عملية الاستيراد البروتين. هذا الأسلوب البسيط، تنوعاً مفيد لدراسة استهداف البروتينات البضائع المقصود للمعايشة. باستخدام هذا الأسلوب، يتم إعداد بروتوبلاستس من أنسجة أوراق نبات11،12 يمكن الحصول عليه من مصانع في العديد من مراحل النمو المختلفة بدءاً من وقت مبكر جداً أن يترك ناضجة تماما. ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند زراعة النباتات المستخدمة لإع.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نفذ هذا العمل بالدعم من "برنامج البحوث التعاونية" لعلوم الزراعة وتطوير التكنولوجيا (المشروع رقم PJ010953012018)، "إدارة التنمية الريفية"، ومنحة "مؤسسة البحوث الوطنية" (كوريا) الممولة من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (رقم 2016R1E1A1A02922014)، جمهورية كوريا.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
GAMBORG B5 متوسط بما في ذلك الفيتاميناتDuchefa BiochemieG0210.0050
السكروزDuchefa BiochemieS0809.5000
MES MONOHYDRATEDuchefa BiochemieM1503.0250
Agar ، مسحوقJUNSEI24440S1201
شريط جراحي Micropore3M1530-0
شفرة جراحية أنبوب
، 50 ملSPL LIFE SCIENCES50050
Macerozyme R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.غير متوفر
Cellulase ONOZUKA R-10YAKULT PHARMACEUTICAL IND.غير متوفر
ALBUMIN ، BOVINE (BSA) VWR0332-100G
D-MannitolSIGMAM1902-1KG
CALCIUM CHLOR ، DIHYDRATEMP BIOMEDICALS0219463505-5KG
TwisterVISION SCIENTIFICVS-96TW
كوب شاشة لشاشات CD-1SIGMAS1145
ل CD-1SIGMAS3895
طبق بتريSPL LIFE SCIENCES10090
ماصة باستورHILGENBERG3150102
جهاز طرد مركزي مختبر / مقعد أعلىالرؤية العلميةVS-5500N
كلوريد الصوديومJUNSEI19015S0350
كلوريد البوتاسيومSIGMAP3911-1KG
D-GLUCOSE ، اللامائيالحيوي الأساسيGB0219
هيدروكسيد البوتاسيومDUKSAN40
الكالسيوم رباعي هيدراتSIGMAC2786-500G
بولي (إيثيلين جلايكول)SIGMAP2139-2KG
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيومSIGMAM2393-500G
أنبوب 13 مل ، 100 × 16 مم ، PPSARSTEDT55.515
شرائح مجهرMARIENFELD1000412
نظارات غطاء المجهرMARIENFELD101030
غرفة العدMARIENFELD650030
Axioplan 2 مجهر التصويركارل زايسأنبوب دقيق غير متوفر
1.5 ملسارستدت72.690.001
2- MercaptoethanolSIGMAM3148-250ML
كبريتات الصوديوم دوديسيل الصوديوم (SDS) ، البروتينات الصفVWRM107-500G
TRIS ، درجة نقاءفائقة VWR0497-5KG
DTT (DL-DITHIOTHREITOL) ، درجة التكنولوجيا الحيويةVWR0281-25G
بروموفينول ملح الصوديوم الأزرق ACSVWR0312-50G
الجلسرينJUNSEI27210S0350
الألوان الحية A.v. الأجسام المضادة أحادية النسيلة (JL-8)تاكارا632381
مخروطي غير متوفر من الريش رقم 10 نترات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jarvis, P., Lopez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 787-802 (2013).
  2. Neuhaus, H. E., Emes, M. J. Nonphotosynthetic Metabolism in Plastids. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 51, 111-140 (2000).
  3. Rolland, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Import ChloroplastsProtoplast IsolationFluorescence MicroscopyImmunoblotting AnalysisChloroplast Protein TargetingArabidopsis ProtoplastsProtein Import AssayGFP Fusion ProteinCentrifugation ProtocolsSucrose Gradient

Related Articles