يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

8.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/58467

⸱

نوفمبر 20, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Lab of Animal Models and Functional Genomics (LAMFG), The Key Laboratory of Animal Vaccine & Protein Engineering, College of Veterinary Medicine, Hunan Agricultural University (HUNAU), 2Department of Pathology, Georgetown University Medical School, 3College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University (HUNAU), 4Lab of Molecular Cardiology (LMC), National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH), 5Transgenic Core, National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI)/National Institutes of Health (NIH)

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا، بروتوكول مفصلة لتحديد الأحداث جزئ المتجانسة التي وقعت في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبية و/أو PCR. ويتجلى هذا الأسلوب توليد نونموسكلي الميوسين الثانية استبدال الوراثية الماوس النماذج باستخدام الجنينية يستند إلى الخلية الجذعية المتجانسة اقترانها بوساطة تستهدف التكنولوجيا التقليدية.

الملخص

بالنسبة للمسائل المتعلقة بالآثار خارج الهدف وصعوبة إدراج جزء الحمض النووي طويلة في تطبيق nucleases المصمم للجينوم الجذعية الجنينية، وتحرير (ES) يستند إلى الخلية استهداف الجين التكنولوجيا ليس لديها أوجه القصور هذه وعلى نطاق واسع يستخدم لتعديل جينوم الحيوان/الماوس بدءاً من الحذف/الملاحق الكبيرة لاستبدال النوكليوتيدات واحدة. جدير بالذكر أن تعريف الأحداث جزئ المتجانسة (HR) قليلة نسبيا اللازمة للحصول على المطلوب استنساخ ES هو خطوة رئيسية التي تتطلب أساليب دقيقة وموثوق بها. النشاف الجنوبية و/أو PCR التقليدية غالباً ما تستخدم لهذا الغرض. هنا، يمكننا وصف الإجراءات المفصلة لاستخدام تلك الأساليب اثنين لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا التي يراد الجين Myh9 الذاتية أن تعطل والاستعاضة عنها بترميز أخرى نونموسكلي الميوسين سلسلة ثقيلة IIs (NMHC IIs) كدناس. يتضمن الإجراء بأكمله من النشاف جنوب بناء استهداف vector(s) انهانسر، التحديد المخدرات، والتوسع وتخزين خلايا ES/الحيوانات المستنسخة، وإعداد، والهضم، والنشاف للحمض النووي (جدنا)، التهجين و غسالة من probe(s)، وخطوة أخيرة من أوتوراديوجرافي على أفلام الأشعة السينية. يمكن أن يؤديها بكر مباشرة مع جدنا استعداد والمخفف. للحصول على نتائج مثالية، ينبغي بدقة التخطيط المسابير وإنزيم التقييد (إعادة) مواقع قطع النشاف الجنوبي والإشعال لبكر. على الرغم من تنفيذ النشاف الجنوبية تستغرق وقتاً طويلاً وتتطلب عمالة مكثفة ولها نتائج PCR المغلوطة، التعرف الصحيح النشاف الجنوبي والفحص السريع ببكر يسمح بتطبيق هذه الأساليب الموصوفة وحدها أو مجتمعة وفي هذه الورقة استخدامها على نطاق واسع واستشارها معظم المعامل في التعرف على الأنماط الجينية لخلايا ES ووراثيا تعديل الحيوانات.

المقدمة

تكنولوجيا الجينات استهداف الموارد البشرية في موريني دإط الخلايا يوفر أداة قوية لتشريح الخلوية عواقب الطفرات الوراثية المحددة1،2. أهمية ومغزى هذه التكنولوجيا تنعكس في اعترافها بعام 2007 جائزة نوبل في الطب أو الفيزيولوجيا3،4؛ وفي الوقت نفسه، وهو يمثل قدوم العصر الحديث ل هندسة الجينات5. يمكن أن تستخدم الجينات تستهدف من خلال الموارد البشرية مهندس تقريبا أي تغيير تتراوح بين الطفرات الكبيرة ترتيبات جديدة كروموسومية في الجينوم من الماوس دإط الخلايا6،7. من المعروف أن توليد ماوس خروج المغلوب الجينات المطلوبة قبل ظهور أدوات تحرير ما يسمى الجينوم، تطبيق التكنولوجيا استهداف الجين في دإط الخلايا8،9،10. خلال العقدين الماضيين، تم إنتاج 5,000 أكثر من استهداف جينات الفئران بهذا النهج لنمذجة الأمراض البشرية أو دراسة وظائف الجينات11. وأنشئت بجهد على نطاق الجينوم بالضربة قاضية لتوزيع ناقلات استهداف الجين واستنساخ الخلايا ES المستهدفة، والفئران الحية إلى المجتمع العلمي2،12،،من1314 , 15-مما لا شك فيه، وفاق يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا كثيرا المتقدمة فهمنا لوظائف المورثات لعبت في سياق الفسيولوجية أو المرضية.

نظراً لأن الموارد البشرية هي حدث نادر نسبيا في الثدييات خلايا16،17، الهامة، والخطوة التالية بعد استهداف الجينات في خلايا ES مورين تحليل العديد من المستعمرات ES لتحديد عدد قليل من الحيوانات المستنسخة مع الطفرات الناتجة عن الموارد البشرية مع استهداف ناقلات18. وتشمل أساليب الذهب لتحديد الموارد البشرية الأحداث النشاف الجنوبي وبكر19،20. تشمل مزايا النهج أن النشاف جنوب يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة ES مستهدفة بشكل صحيح، ويسمح للباحثين تحليل بنية الحدث الجينات المستهدفة، مثل قق إدراج نسخة واحدة من البناء، في حين استراتيجية تقوم على بكر يسمح بالفحص السريع للموارد البشرية أحداث21،22. على الرغم من أن هذه الأساليب قد عيوب، مثل أن فمضيعة للوقت ويمكن أن يكون المغلوطة، استخدام التوافيقيه منهم على نطاق واسع المقبولة وتطبقها معظم المعامل في تحديد أحداث الموارد البشرية، خاصة في دإط الخلايا، لتوليد وراثيا تعديل الحيوانات.

إيسوفورمس ثلاثة من الميوسين نونموسكلي "شمال البحر الأبيض المتوسط" (الثانية) في الثدييات، ويتألف كل منهما من اثنين متطابقة NMHC IIs التي تم ترميزها بثلاثة جينات مختلفة (المسماة Myh9 و Myh10 و Myh14) واثنين من أزواج من سلاسل خفيفة، يشار إلى شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء وثانيا-ج23. دراسات سابقة قد أشارت إلى أن على الأقل إيسوفورمس شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-ب ضرورية للتنمية الماوس لأن الاجتثاث في فيفو من isoforms هذه النتائج في الفتك الجنينية24،،من2526. للتحايل على هذه المشكلة والحصول على رواية ثاقبة وظائف محددة isoform شمال البحر الأبيض المتوسط الثاني-ألف والثاني-باء في مراحل لاحقة من الماوس التنمية، بديل وراثية اعتمد استراتيجية استخدام ES يستند إلى الخلية بوساطة الموارد البشرية استهداف الجين التكنولوجيا إلى إنشاء سلسلة من نماذج الماوس27. أثناء تحديد المستنسخين ES المرجوة، استخدمت النشاف الجنوبي وطرق PCR، وهذه أثبتت أنها فعالة وموثوق بها27،28.

وتعتزم هذه الورقة تقديم وصف مفصل لجنوب النشاف وبكر، بما في ذلك تصميم استهداف vector(s)، probe(s)، والإشعال، وتنفيذ التجارب، وكذلك تحليل النتائج يتجلى في تحديد الحدث الموارد البشرية التواجد في خلايا ES لتهيئة الماوس "الثاني شمال البحر الأبيض المتوسط" الوراثية استبدال نماذج وبيانات تمثيلية. ويمكن أيضا اعتماد بروتوكولات هاتين الطريقتين المقدمة هنا للتعرف الأنماط الجينية للخلايا المحورة وراثيا أو الحيوانات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-التصميم لاستهداف Construct(s)، تحقيقات للجنوب وصمة عار، وكبسولة تفجير لبكر

  1. حدد أول إكسون الترميز (إكسون 2) الجينات Myh9 للتعطيل أو الإدراج في التطبيق من خروج المغلوب/تدق في ذكرت هنا.
  2. استرداد 5 كيلو بايت المنبع و 5 كيلو بايت المصب تسلسل الحمض النووي المحيطة إكسون Myh9 2 من موقع genome.ucsc.edu .
  3. تحليل أنماط الهضم التقييد للإنزيمات (REs) مع خفض 1 – 2 في هذه المنطقة 10 كيلو بايت باستخدام البرمجيات بدرو لتحديد RE(s) مناسبة لهضم الحمض النووي الجينومي لجنوب النشاف.
    ملاحظة: Dra يفي بهذا المطلب، ومحددا لهذا الغرض.
  4. حدد جزء 4 كيلو بايت فورية المنبع من إكسون Myh9 2 كالذراع الأيسر التماثل (LHA) وتسلسل 1.7 كيلو بايت المتلقين للمعلومات فورية يفتت كالذراع اليمنى التماثل (RHA)؛ اختر جزء 1 كيلو بايت 5 'المنبع من LHA كالمسبار الأيسر (ليرة لبنانية) لجنوب النشاف وجزء 1.2 كيلو بايت 3' اتجاه مجرى النهر من RHA كالتحقيق اليمنى (RP)، استناداً إلى التحليل الوارد أعلاه.
  5. استخدام برنامج primer3 لتصميم الإشعال إلى الأمام وعكس لتضخيم تلك الشظايا الحمض النووي أربعة من بكر. تصميم زوج من أجهزة الإشعال مع التمهيدي إلى الأمام يقيمون قرب المحطة 3 ' الجينات المقاومة نيوميوسين علامة الاختيار (P1) وعكس التمهيدي يقع خارج هيئة (P2).
    ملاحظة: سيتم استخدام هذا الزوج التمهيدي لتحديد المستهدف ES استنساخ ببكر29.
  6. العثور على نسخة باك 129Sv تغطي موضع الماوس Myh9 الجينات عن طريق زيارة الموقع bacpac.chori.org (ملاحظة: اسوي الحمض النووي المفضل). عزل "الحمض النووي باك" باستخدام مجموعة أدوات مناسبة لتنقية أجزاء كبيرة من الحمض النووي اتباع التعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    ملاحظة: ستستخدم المنقي BAC DNA كالقالب للتضخيم PCR.
  7. رسم تمثيل تخطيطي للاستهداف بنيات وتحقيقات، وكبسولة تفجير لتلخيص هذه المعلومات.

2-جيل من استهداف Construct(s) ومجسات للجنوب وصمة عار، وإعداد أجهزة الإشعال لبكر

  1. ترتيب الإشعال PCR الموصوفة أعلاه ويحل لهم في تركيز من 20 ميكرومتر.
  2. تضخيم الذراعين التماثل والمسابير ببكر في حل رد فعل بما في ذلك 1 ميليلتر ميليلتر إلى الأمام و 1 كبسولة تفجير عكس، 1 ميليلتر من الحمض النووي BAC (50 نانوغرام) كالقالب، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت ل [بفو] و 1 ميليلتر من الترا بفو بوليميراز الدنا ، وأداء ح2س ما يصل إلى 50 ميليلتر. بكر في جهاز PCR تحت الظروف التالية: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية؛ 72 درجة مئوية و 1 كيلو بايت في الدقيقة؛ دورات 30؛ وأخيراً، 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  3. تنقية منتجات PCR باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR طبقاً للبروتوكول بتوفيرها من قبل الشركة المصنعة والوت الشظايا من الحمض النووي مع ميليلتر 40 ح2خلاصة O. المنتجات بكر المنقي مع الدقة المصممة مسبقاً في رد فعل محلول يحتوي على 5 ميليلتر من 10 x العازلة للدقة ، 2.5 ميليلتر من RE1 و 2.5 ميليلتر RE2، والحمض النووي التيد، في 37 درجة مئوية 2 حاء تشغيل هلام الحمض النووي 1% لفصل نطاقات الحمض النووي الهدف، والمكوس هلام التي تحتوي على الحمض النووي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، هدفا لتنقية الشظايا من الحمض النووي المستهدف من جل استخدام الحمض النووي جل استخراج طقم وفقا للبروتوكول التي توفرها الشركة المصنعة، والوت الشظايا من الحمض النووي مع ميليلتر 40 ح2o.
  4. استنساخ بالأسلحة التماثل واستبدال التعبير cassette(s) إلى ناقل مبنتكف-لوكسب وفقا لترتيب تضخيم وتنقية RHA، LHA، واستبدال التعبير cassette(s) صدر من ناقلات أخرى للحصول على استهداف النهائي construct(s). استنساخ شظايا من الحمض النووي من المسابر تضخيم وتنقية في الموجه T سهلة.
  5. تأكيد تسلسل النوكليوتيدات من جميع أجزاء الحمض النووي المستنسخة بالتسلسل27،28.

3-التحضير لاستهداف Construct(s) وانهانسر دإط الخلايا والتضخيم من الحيوانات المستنسخة ES

  1. إعداد كل بناء يستهدف استخدام عدة ماكسيبريب بلازميد طبقاً للبروتوكول بتوفيرها من قبل الشركة المصنعة. لينيريزي بلازميد بناء كل من هضم أنه مع عدم في رد فعل 400 ميليلتر بما في ذلك 40 ميليلتر من المخزن المؤقت 10 x ليس الأول، 10 ميليلتر من عدم، 100 ميكروغرام من الحمض النووي، وح2س ما يصل إلى 400 ميليلتر، في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  2. تنقية construct(s) استهداف خطية.
    1. استخراج الحل رد فعل الهضم 1 x مع حجم متساوية من "الكحول" الفينول: كلوروفورم: إيسواميل (25:24:1) وأجهزة الطرد المركزي في قوة 2,000 س ز لمدة 10 دقائق.
    2. نقل المادة طافية إلى أنبوب 1.5 مل جديدة، ويعجل بالحمض النووي باستخدام 2.5 × خلات الصوديوم الإيثانول و 0.1 × 3 م (pH 5.2) (نسبة حجم)، والطرد المركزي في قوة 2,000 x ز لمدة 10 دقائق.
    3. إزالة الغسيل طافية، الحمض النووي بيليه x 1 مع 1 مل إيثانول 75%، والطرد المركزي في قوة 2,000 س ز لمدة 5 دقائق.
    4. إزالة المادة طافية وأيردري بيليه الحمض النووي لمدة 5 دقائق.
    5. حل بيليه الحمض النووي خطية في المخزن المؤقت تريس يدتا (TE) العقيمة بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/ميليلتر.
  3. مزيج 50 ميكروغرام لكل بناء استهداف خطية مع 0.5 × 107 دإط الخلايا. أداء انهانسر في 320 V و 250 µF. لوحة اليكتروبوراتيد دإط الخلايا على أطباق مع مغذيات MEF المقاوم للأجسام القريبة من الأرض.
  4. بعد 24 ساعة، قم بالتبديل إلى وفاق الخلية المتوسطة مع 400 ميكروغرام/مل G418 و ganciclovir 200 ميكرومتر وتواصل الثقافة لمدة 4-5 أيام مع تغير متوسط يومي. التقاط استنساخ ES المقاوم للعقاقير في لوحات 48-جيدا.
    ملاحظة: تستخدم أربعة ألواح 48-جيدا عادة، كل بناء.
  5. تكرار لوحات 48-جيدا.
    ملاحظة: مجموعة واحدة من اللوحات هو cryopreserved، ومجموعة أخرى تستخدم لإعداد الدنا الجينومي.

4-إعداد الجينوم السلطات الوطنية المعينة والهضم مع Restriction Enzyme(s)

  1. إعداد جدناس من دإط الخلايا باستخدام مجموعة تجارية (أدوات تنقية الحمض النووي الجينوم) مع بعض التعديلات الطفيفة.
    1. قم بإزالة الوسائط من ثقافة الخلية وفاق وإضافة 500 ميليلتر حل تحلل أنوية، بما في ذلك رناسيا، مباشرة إلى الآبار الخلايا.
      ملاحظة: يمكن تخزينها في-80 درجة مئوية الخلية ليساتي أو تعامل على الفور.
    2. بيبيت صعودا وهبوطاً عدة مرات الخلايا تماما ونقلها إلى أنبوب 1.5 مل نظيفة.
    3. إضافة ثلث حجم الحل ترسيب البروتين إلى أنبوب 1.5 مل، ودوامه بقوة عن 20 s، البرد العينات على الجليد لمدة 5 دقائق، وثم الطرد المركزي في قوة 2,000 x ز 5 دقيقة نقل المادة طافية إلى آخر نظيفة 1.5 مل أنبوب كونتي نينغ حجم متساوية من الكحول؛ المزيج بلطف الحل. (لاحظ أن خيوط مثل الخيط الأبيض يمكن أن يرى في هذه اللحظة). الطرد المركزي في قوة 2,000 x ز 1 دقيقة؛ وبعد ذلك، تجاهل المادة طافية.
    4. أغسل بيليه جدنا مع 1 مل إيثانول 70% في درجة حرارة الغرفة، أجهزة الطرد المركزي في قوة 2,000 x ز لمدة 1 دقيقة ونضح المادة طافية بعناية ثم أيردري بيليه جدنا لمدة 3 دقائق.
    5. حل جدناس مع 100 ميليلتر من حل الإماهة الحمض النووي، واحتضان 65 درجة مئوية ح 1 أو 4 درجات مئوية، ثم بين عشية وضحاها.
    6. تخزين جدناس في 2-8 درجة مئوية.
  2. ملخص جدناس مع المصممة مسبقاً إعادة "تعيين Dra أولاً" حتى فعل هضم 30 ميليلتر بخلط 3 ميليلتر من 10 x المخزن المؤقت ل Dra الأول، 3 ميليلتر من Dra الأول، 10 ميكروغرام من جدناس/عينة، وح2س يصل إلى 30 ميليلتر، واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  3. تحقق من اكتمال الهضم بهلام الحمض النووي، وتحليل 5 ميليلتر من رد فعل الهضم، وثم إضافة 3 ميليلتر من 10 × الحمض النووي-تحميل المخزن المؤقت للخطوة اللاحقة.

5-الجنوب النشاف وتحديد بكر

  1. الفحص جنوب النشاف
    1. فصل جدناس هضمها بالتفريد ونقل لغشاء.
      1. إعداد 1% [اغروس] هلام التفريد مع اثيديوم بروميد (المجلس التنفيذي) وتحميل العينات من الخطوة 4، 3 وسلم 1 كيلو بايت، وتشغيل الهلام مع جهد منخفض (30-40 الخامس) بين عشية وضحاها.
      2. تأخذ بها الجل والتقاط صورة باستخدام نظام تصوير جل الحمض النووي بعد التفريد. التحقق من ما إذا كان جدناس هضمها والمنفصلين عن ذويهم من عرض صورة شبيهة بتشويه.
      3. نقع الجل في صينية مع 0.2 N HCl الحل والتخلص منه بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      4. نقل الجل إلى حل يشوه الحمض النووي والتخلص منه بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      5. التبديل الجل إلى حل تحييد الحمض النووي والتخلص منه بلطف لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: الهلام عرضه للكسر بعد هذه الخطوة، ولذلك فإنه يجب أن تعالج بعناية.
      6. استخدام نظام نقل نحو الانخفاض السريع لنقل السلطات الوطنية المعينة من الهلام إلى الغشاء. تجميع توربوبلوتير ومكدس النشاف طبقاً للتعليمات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
        ملاحظة: 10 x أو 20 x سترات الصوديوم المالحة (SSC) حل يستخدم كمخزن مؤقت نقل. وبصفة عامة، ح 3 من نقل ما يكفي لنقل 95% جدناس من الهلام إلى الغشاء؛ ومع ذلك، وقتاً أطول لنقل حميدة.
      7. إخراج الغشاء وغسله مع 2 x SSC لمدة 1 دقيقة، استيعاب السائل مع الأنسجة، وثم تشابك الحمض النووي مع الغشاء استخدام كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية.
        ملاحظة: يمكن تخزين الغشاء عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
    2. تسمية الحمض النووي تحقيقات مع النشاط الإشعاعي.
      1. تنقية والبلازميدات التحقيق استخدام عدة مينيبريب طبقاً للبروتوكول بتوفيرها من قبل الشركة المصنعة.
      2. الإفراج عن الحمض النووي شظايا من التحقيقات من ناقلات بلازميد من اكور أنا الهضم في حل رد فعل بما في ذلك 5 ميليلتر من المخزن المؤقت لاكور الأول، 2 ميليلتر لاكور أنا الإنزيم و 20 ميكروغرام من بلازميد الحمض النووي ح2س ما يصل إلى 50 ميليلتر ، عن ح 2.
      3. تشغيل % 1 جل الحمض النووي لفصل أجزاء الحمض النووي المسبار من الناقل وتنقية الشظايا من الحمض النووي من التحقيقات مع مجموعة استخراج هلام الحمض النووي طبقاً للبروتوكول بتوفيرها من قبل الشركة المصنعة.
      4. 1 ميليلتر من حل الحمض النووي، باستخدام قياس تركيز الحمض النووي الشظايا من الحمض النووي التحقيق مع جهاز المطياف الضوئي في موجه من 260/280 نانومتر.
      5. إعداد 40-نانوغرام تحقيق السلطات الوطنية المعينة في أنبوب 1.5 مل مع 45 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات ويغلي لمدة 3 دقائق، تدور بإيجاز، وثم وضع في tube(s) على الجليد لمدة 2 دقيقة.
      6. إضافة السلطات الوطنية المعينة مسبار الحرارة-التشويه والتحريف إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخرز وسم الحمض النووي جاهزة للذهاب (-دكتب)، بيبيت صعودا وهبوطاً لمزيج، وإضافة 5 ميليلتر من دكتب [α32ف]، واحتضان ثم، في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      7. تنقية المسابير المسمى باستخدام ميكروكولومنس G-50 وفقا للإرشادات المتوفرة من قبل الشركة المصنعة، وثم، قياس النشاط الإشعاعي بواسطة عداد التﻷلؤ (اختياري).
    3. هجن membrane(s) مع تحقيقات المسمى.
      1. بريهيبريديزي الغشاء.
        1. بريوارم الحل التهجين في 42 درجة مئوية عن 30 دقيقة ميكس 20 مل من محلول بريوارميد التهجين مع 200 ميكروغرام للحيوانات المنوية السلمون مسلوق الحمض النووي في أنبوب 50 مل.
        2. وضع الغشاء في أنبوب التهجين. إضافة حل بريهيبريديزيشن مختلطة إلى أنبوب التهجين. ضعه في الفرن التهجين (مجموعة المتداول ودرجة حرارة 42 درجة مئوية) وترك بريهيبريديزيشن المضي قدما لمدة 30 دقيقة.
      2. هجن الغشاء مع probe(s) المسمى.
        1. إخراج الأنبوب التهجين وتصب في حل بريهيبريديزيشن في أنبوب 50 مل؛ إضافة المسبار التشويه والتحريف (تسخينه عند 100 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) من الخطوة 5.1.2.7 لهذا الأنبوب والمزيج بلطف.
          ملاحظة: تقليل أي فقاعات حمل.
        2. العودة الحل المختلط إلى أنبوب التهجين وإجراء التهجين في 42 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    4. أغسل membrane(s) لإزالة المجسات نونهيبريديزيد.
      1. وضع في membrane(s) في صينية مع 1 × SSC + 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي وهزه برفق في 55 – 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      2. نقل membrane(s) إلى علبة مع 0.5 x SSC + 0.1% الحزب الديمقراطي الصربي وهزه برفق في 55 – 60 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      3. فحص النشاط الإشعاعي في membrane(s) باستخدام عداد غايغر محمولة لتقرر ما إذا كان مطلوباً غسل ثالث.
    5. الكشف عن النشاط الإشعاعي في الغشاء لأفلام الأشعة السينية.
      1. إزالة السائل من membrane(s) غسلها.
      2. انفولد membrane(s) مع غلاف بلاستيكي وإصلاح تكنولوجيا المعلومات/لهم في كاسيت التعرض.
      3. كشف الغشاء بورقتين من فيلم الأشعة السينية في غرفة مظلمة.
      4. وضع الكاسيت التعرض في-80 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو أطول.
    6. تطوير الأفلام تصور النتائج. تقييم ما إذا كان استنساخ ES المقابل المطلوب واحد مع جزئ المستهدفة أو لا، وفقا لأحجام العصابات الحمض النووي الكشف عنها بواسطة التحقيقات.
    7. ريهيبريديزي الغشاء نفسه بمسبار آخر بعد تجريد إيقاف التحقيق المستخدمة وفقا للإجراء التالي: إخراج الغشاء المستخدمة، وتغسل س 1 مع تنظيف ح2س، واحتضان ثم، فإنه في حل شريطية (55% ميثلامين، 2% ح الالتهاب، 1% الحزب الديمقراطي الصربي، 2 O) عند 65 درجة مئوية مع الهز لطيف ح 1 – 2.
  2. تحديد بكر
    1. إجراء تحديد PCR المستنسخين ES المرجوة في حل رد فعل 50 ميليلتر بما في ذلك 5 ميليلتر من المخزن المؤقت x PCR 10، 2 ميليلتر من 50 مم MgSO4، 1 ميليلتر من دنتب 10 ملم، 1 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام 20 ميكرومتر، 1 ميليلتر من 20 ميكرومتر عكس التمهيدي ، 1 ميليلتر من عالية الدقة البلاتين بوليميراز، جدناس (~ 100 نانوغرام)، وح2س ما يصل إلى 50 ميليلتر.
    2. استخدام PCR رد فعل الشروط التالية: تمسخ أولى في 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، دورات 30 من تمسخ في 94 درجة مئوية لمدة 30 s، الصلب في 60 درجة مئوية لمدة 30 ق وملحق في 68 درجة مئوية ل 132 s، وخطوة نهائية من 68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    3. تحليل منتجات PCR بالتفريد في 1.0% [اغروس].
    4. استنساخ الأجزاء PCR مع حجمها المتوقع في ناقل تي--سهولة وتسلسل تأكيد وجود تسلسل جزئي لناقلات الأمراض المستهدفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه الورقة، بروتوكول مفصل النشاف الجنوبي وبكر هو وصف، الذي يستخدم لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا لتوليد نماذج الماوس استبدال الوراثية "الثاني شمال البحر الأبيض المتوسط"، باستخدام دإط الخلايا التكنولوجيا القائمة على الموارد البشرية بوساطة الاستهداف. على الرغم من أن قد استخدمت النشاف الجنوبي وبكر، فضلا عن التكنولوجيا التقليدية استهداف الجين، على نطاق واسع لعدة عقود، يحتاج التطبيق الناجح منهم يجب التخطيط بعناية. على الأقل هذه الجوانب مطالبون بالنظر في: طول ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حاليا، نوكليسيس مصمم للتحرير الجينوم لا تزال لا يمكن استبدال ES خلية التكنولوجيا القائمة على استهداف الجين بسبب قضايا لها آثار خارج الهدف، وصعوبة في إدراج الحمض النووي جزء30،طويلة31. ويقدم هذا التقرير كأساليب الذهبي لتحديد الموارد البشرية الأحداث التي وقعت في الماوس دإط الخلايا، بروتوكول مفصل النشاف الجنوبي وبكر للحقل. أننا التحقق من موثوقية هذه الأساليب من خلال تحليل استنساخ الفردية من الماوس دإط الخلايا المستهدفة مع سلسلة من بنيات. المستنسخين ES المطلوب تحديدها...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذا العمل وتلقى الدعم من البرنامج العام لمؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (منح رقم 31571432) والبشرية المقاطعة العلوم الطبيعية مؤسسة من الصين (رقم المنحة 2015JC3097) ومؤسسة البحوث للتعليم المكتب هونان مقاطعة بالصين (ك منحة رقم 15 054).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

باك كبيرة البناء محلول DNA
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
استنساخمركز موارد BACPAC (BPRC)bMQ-330E21
QIAGEN مجموعةQIAGEN12462
QIAquick Gel ExtractionKit QIAGEN28704
QIAquick PCR Pur KitQIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus ماكسي كيتQIAGEN12963
PfuUltra عالية الدقة DNA PolymeraseAgilent600382
T-easy vectorPromegaA1360
Nuclei Lysis SolutionPromegaA7941
ترسيب البروتينPromegaA7951
Denatturing SolutionVWR351-013-131
محلول تحييد الحمض النوويVWR351-014-131
حبات وضع العلامات على الحمض النووي الجاهزة للذهاب (-dCTP) VWR27-9240-01
UltraPure SSC ، 20xThermo Fisher15557036
UltraPur الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزواميل (25:24: 1 ، الخامس / الحجم)ثيرمو فيشر15593031
G418ثيرمو فيشر10131035
محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمونثيرموفيشر 15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High FidelityThermo Fisher11304029
Not IThermo ScientificER0592
Dra IThermo ScientificER0221
EcoR IThermo ScientificER0271
GanciclovirSigmaG2536
Whatman  نظام نقل TurboBlotter ، مجموعات كبيرةفيشر Scientific09-301-188
[& alpha; 32< / sup>P] dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro ColumnsGE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I Hybrid SolutionMilliporeS4040
Kodak X-Ray FilmZ& زد ميديكال844 5702

المراجع

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, dW. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187(2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337(2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260(2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365(1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117(2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238(2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641(2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188(2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173(2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74(2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.