مقالة منهجية

الإنتاج الواسع النطاق للكشف المؤتلف في سقالة دائرية باستخدام نظام المستمدة من فرويد في الإشريكيّة القولونية

DOI:

10.3791/58472

⸱

نوفمبر 30, 2018

 ,  , 
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية بالإعراب شارك الجيش الملكي النيبالي تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. المنتج الرئيسي هو جزيء تعميم الذي يسهل تنقية للتجانس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ومع تزايد الاهتمام بالبيولوجيا الجيش الملكي النيبالي، واستخدام جزيئات الحمض النووي الريبي في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية تطورا، الأساليب التي تنتج كميات كبيرة من الكشف المؤتلف محدودة. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في الإشريكيّة القولونية يستند التعبير المشارك من جزيء تشيميريك التي تحتوي على الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة فرويد ومصنع للحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. فيرويدس يتم الكشف دائرية صغيرة نسبيا، غير الترميز، درجة عالية من إقران قاعدة يتم المعدية على النباتات العليا. النباتات المضيفة الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى هو إنزيم جندهم فيرويدس التي تنتمي إلى الأسرة، أفسونفيرويدايمثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)، للتوسط على الجيش الملكي النيبالي أثناء النسخ المتماثل فرويد. على الرغم من أن الفد لا النسخ المتماثل في كولايوكفاءة يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي مؤشرا الفد ويتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة المضمنة في الخلايا البكتيرية، وهي سيركولاريزيد مونومرات الناجمة عن ذلك شارك أعرب ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال التوصل إلى تركيز ملحوظ. إدراج الحمض النووي الريبي للفائدة في سقالة الفد يتيح إنتاج عشرات ملليغرام من المؤتلف الحمض النووي الريبي للتر الواحد من ثقافة البكتيرية في الظروف المختبرية العادية. جزء الرئيسي من المنتج الجيش الملكي النيبالي التعميم، ميزة تسهل على تطهير الجيش الملكي النيبالي المؤتلف إلى التجانس الظاهري. في هذا البروتوكول، يتم إدراج المقابلة الحمض النووي (كدنا) مكملة للجيش الملكي النيبالي للفائدة في موضع معين من كدنا الفد في تعبير بلازميد المستخدمة، على طول بلازميد لﻹعراب الباذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى، شاركت في تحويل كولاي. التعبير المشترك كلا الجزيئات تحت سيطرة المروجين التأسيسي قوي يؤدي إلى إنتاج كميات كبيرة من الجيش الملكي النيبالي المؤتلف. يمكن استخراجه من الخلايا البكتيرية الجيش الملكي النيبالي المؤتلف وفصلها عن الجزء الأكبر الكشف البكتيرية الاستفادة به دائرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وعلى النقيض من الحمض النووي والبروتينات، بروتوكولات لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي سهلة وفعالة وفعالة من حيث التكلفة ليست وفيرة. ومع ذلك، متطورة الطلب البحوث والصناعة زيادة مبالغ هذه الجزيئات الحيوية للتحقيق عن الخصائص البيولوجية الفريدة1، أو استخدامها في تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، بما في ذلك استخدامها الابتامرات محددة للغاية 2أو3من العوامل العلاجية أو مبيدات انتقائية4. النسخ في المختبر والتوليف الكيميائية تستخدم عادة في البحوث لإنتاج الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذه الأساليب تستتبع القيود الهامة عندما يتطلب الأمر كميات كبيرة من المنتجات. البديل المنطقي لاستخدام آلات النسخ الذاتية من الخلايا الحية، تليها عملية تنقية لفصل الكشف لمصلحة من رفاقه الخلوية. وفي أعقاب هذه الاستراتيجية، وضعت أساليب لإنتاج الكشف المؤتلف في الخلايا البكتيرية، مثل المختبر الصديقة الإشريكيّة القولونية5 أو البحرية الأرجواني فوتوتروفيك ألفا-بروتيوباكتيريوم سولفيدوفيلوم رهودوفولوم 6-معظم الأساليب لإنتاج الحمض النووي الريبي المؤتلف في البكتيريا تعتمد على التعبير عن السقالة الحمض النووي الريبي مستقرة جداً الأصلي، مثل إدراج7الحمض الريبي النووي النقال أو الرنا الريباسي، التي يكون فيها الجيش الملكي النيبالي للفائدة. وهذا يفرض ضرورة الإفراج عن الجيش الملكي النيبالي للفائدة من جزيء تشيميريك، في حالة وجود الحمض النووي الريبي إضافي مشكلة بالنسبة للتطبيقات المصب8. مفهوم آخر في المؤتلف الحمض النووي الريبي التكنولوجيا الأحيائية هو إنتاج مجمعات ribonucleoprotein التوليفية التي قد تكون المنتج المطلوب في حد ذاتها أو تستخدم كاستراتيجية وقائية لزيادة الاستقرار في الجيش الملكي النيبالي للفائدة9، 10. وبالمثل، اقترحت أيضا كاستراتيجية لتوليد منتجات أكثر استقرارا11إنتاج الكشف دائرية.

قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب جديد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي المؤتلف في كولاي التي تشارك في ثلاثة من المفاهيم المذكورة أعلاه: الإدراج من الجيش الملكي النيبالي للفائدة في سقالة الحمض النووي الريبي دائرية عالية مستقرة والتعبير المشترك عن رنا المؤتلف مع بروتين التفاعل المحتمل أن إنتاج ribonucleoprotein مستقرة معقدة التي تتراكم في المبالغ الملحوظة في البكتيريا خلايا12. على النقيض من التطورات السابقة، استخدمنا الحمض النووي الريبي سقالة غريبة تماما على كولاي، إلا وهي فرويد. فيرويدس هي نوع خاص جداً من العوامل المعدية من النباتات العليا التي تتألف حصرا من صغيرة نسبيا (nt 246-401) درجة عالية من إقران قاعدة التعميم الحمض النووي الريبي13. من المثير للاهتمام، فيرويدس هي غير الترميز الكشف، ومع أي مساعدة من البروتينات الخاصة بها، فقادرة على إكمال دورات المعدية المعقدة في المضيفين المصابة14. تشمل هذه الدورات تكرار الحمض النووي الريبي للجيش الملكي النيبالي في نوى أو المعايشة، اعتماداً على الأسرة فيرويد –بوسبيفيرويداي أو أفسونفيرويداي، على التوالي – الحركة عن طريق النباتات المصابة والتهرب من استجابة دفاعية المضيف. يجب أن يتم تصنيفهم فيرويدس بين الكشف الأكثر استقرارا في طبيعتها، ونتيجة ليجري الحمض النووي الريبي دائرية عارية، والحاجة إلى البقاء على قيد الحياة في بيئة معادية للخلايا النباتية المصابة. وقد جعل هذه الخاصية فيرويدس مناسبة خاصة السقالات على استقرار المؤتلف الحمض النووي الريبي في نهج التكنولوجيا الحيوية. وباﻹضافة إلى ذلك، أسلوب جديد يستند إلى التعبير المشارك من السقالة فرويد مع بروتين النباتي متفاعلة. فيرويدس نسخاً متماثلاً من خلال إليه دائرة المتداول في استضافة التي يجند الإنزيمات لتحفيز الخطوات المختلفة لهذه العملية. لا سيما بعض فيرويدس، وبشكل أكثر تحديداً تلك التي تنتمي إلى أفسونفيرويدايالأسرة15، تحتوي على ريبوزيميس التي تشارك أيضا في عملية النسخ المتماثل. تبعاً للأنواع الأحيائية فرويد، توسط نسخ فرويد الكشف المضيفة الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني أو بوليميريز الحمض النووي الريبي النووي ترميز تشلوروبلاستيك (NEP). معالجة فرويد الجيش الملكي النيبالي ويبدو أن تحفزها مضيف رناسي نوع-ثالثا، على الرغم من أن تنشق وسيطة في فيرويدس مع الحمض النووي الريبي أوليجوميريك ribozymes ذاتيا أثناء النسخ المتماثل. وأخيراً، مونومرات فرويد الناتجة هي سيركولاريزيد، اعتماداً على الأسرة، وفرويد ليجاسى الحمض النووي المضيف 1 أو isoform تشلوروبلاستيك الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى16،17. هذا الإنزيم الأخير تشارك في عملية ربط أحادي أشكال فيرويدس في الأسرة أفسونفيرويداي، مثل فرويد الكامنة الباذنجان (الفد)18.

أثناء عمل تحليل متطلبات الفد تسلسل والهيكلية التي تحدد الاعتراف بالباذنجان (Solanum melongena L.) ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال، أنشأنا نظام تجريبي يستند إلى التعبير المشترك لكل الجزيئات في كولاي 19-لاحظنا أن تنشق ذاتية أطول من وحدة الفد النصوص كفاءة في الخلايا كولاي عن طريق ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ، وأن مونومرات فرويد الناتجة مع 5 '-هيدروكسيل و 2'، 3 '-phosphodiester تيرميني كانت كفاءة سيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان أعرب المشترك. بل أكثر من ذلك، رنا فرويد التعميم الناتج الذي تم التوصل إليه بتركيز عال غير متوقعة في كولاي، تتجاوز تلك التي ررناس الذاتية12. أظهرت عدم وجود وسيطة النسخ المتماثل عدم التضخيم الفد الحمض النووي الريبي للجيش النيبالي الملكي في هذه الخلايا البكتيرية. من المثير للاهتمام، الإدراج للكشف مغايرة في موقف معين للجزيء فرويد أثرا معتدلة في تراكم الكشف مشتقة فرويد-التعميم12. هذه الملاحظات جعلتنا نتصور طريقة لإنتاج كميات كبيرة من المؤتلف الكشف في البكتيريا. في هذا الأسلوب، يتم إدراج كدناس المقابلة للكشف الفائدة في كدنا الفد والجيش الملكي النيبالي تشيميريك الناتجة في كولاي عن طريق أحد المروجين تأسيسي قوية. لنظام العمل، يجب تحويل كولاي يشترك مع بلازميد للتعبير عن ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان. نسخة أطول من الوحدة المشتقة من الفد تتم معالجتها بواسطة ribozymes المطرقة جزءا لا يتجزأ ومعترف بها وسيركولاريزيد من ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال المشترك أعرب مونومرات الناتجة مع تيرميني المناسبة. بهذه الطريقة، يتم إدراج الجيش الملكي النيبالي لمصلحة سقالة دائرية مستقرة جداً يتألف من جزيء دائري فرويد. هذا الحمض النووي الريبي تشيميريك المؤتلف على الأرجح كذلك استقرت داخل الخلايا كولاي بتشكيل ribonucleoprotein المعقدة من خلال التفاعل مع الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. باستخدام هذا الأسلوب (انظر البروتوكول أدناه)، الابتامرات الجيش الملكي النيبالي ودبوس الكشف وغيرها الكشف المنظم بسهولة أنتجت بكميات عشرات مليغرام للتر الواحد من الثقافة كولاي في الظروف المختبرية العادية وتنقيته للتجانس مع أخذ الاستفادة من تدوير12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-بلازميد البناء

  1. تضخيم بكر (أو النسخ العكسي PCR إذا البدء من قالب الحمض النووي الريبي) كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للاهتمام باستخدام كبسولة تفجير 5 ' ملحق للسماح للجمعية إلى بلازميد التعبير. لتجنب حدوث طفرات غير مرغوب فيها، استخدام عالية دقة بوليميريز الحمض النووي.
    1. لإدراج كدنا في بلازميد التعبير عن جيبسون الجمعية20، إضافة 5 'الملحقات التالية إلى الإشعال بكر: الأمام، 5'-تكتكككككتكككاجتاكتاتككككتكسكسسسسسسسسسسسسسسسسسسسسس-3 '؛ عكس، 5 '-كككتككتاججاكاكاتككتجاكسكسسسسسسسسسسسسسسسسسسسسس-3'؛ يمثل X النيوكليوتيدات مثلى لنهايات طرفية للجيش الملكي النيبالي للفائدة.
    2. احتضان لمدة 30 ثانية عند 98 درجة مئوية، تليها دورات 30 10 s عند 98 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية و 30 s في 72 درجة مئوية، وتمديد نهائي من 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  2. ملخص 100 نانوغرام من بلازميد بليلفد-بزب مع 10 يو إنزيم التقييد IIS نوع Bpi أنا ح 1 في 37 درجة مئوية في رد فعل ميليلتر 20 مل 0.5 أنبوب في المخزن المؤقت ز (10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 10 مم مجكل2, 50 مم كلوريد الصوديوم ، 0.1 مغ/مل جيش صرب البوسنة).
    ملاحظة: والبلازميدات جميع متاحة بناء على طلب صاحب البلاغ المقابلة. Bpi أنا ما يعادل Bbs أنا.
  3. فصل المنتجات بكر والهضم بالتفريد في 1% [اغروس] هلام في تاي المخزن المؤقت (40 مم تريس، 20 ملم حمض الخليك، يدتا 1 مم، الرقم الهيدروجيني 7.2). وصمة عار للهلام لمدة 15 دقيقة قبل المصافحة في 200 مل من 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. تصور الحمض النووي باستخدام ترانسيلوميناتور الأشعة فوق البنفسجية وقطع العصابات تناظر كدنا تضخيم و Bpi يهضم أنا بلازميد (2046 bp) باستخدام شفرة المبضع.
    ملاحظة: Bpi وأنا هضم بليلفد بزب تطلق أيضا منتج شركة بريتيش بتروليوم 528 المقابلة للمراسل لاكز الأزرق والأبيض.
  4. الوت السلطات الوطنية المعينة من الشظايا جل استخدام أعمدة السليكا هلام (جل الحمض النووي استعادة كيت في الجدول للمواد)، وقياس تركيز الحمض النووي عن طريق التحليل سبيكتروفوتوميتريك.
  5. قم بإعداد رد فعل الجمعية جيبسون استخدام كدنا تضخيم وبلازميد هضمها. استخدام فائض مولى 3-fold في مقابل إدراج مكافحة ناقلات20. احتضانها ح 1 عند 50 درجة مئوية وتنقية نواتج التفاعل باستخدام عمود هلام السليكا (الحمض النووي نظيفة ومركزات كيت في الجدول للمواد).
  6. استخدام المنتجات النقية من رد فعل الجمعية جيبسون إلى اليكتروبوراتي المختصة كولاي DH5α الخلايا. استخدام الترعة انهانسر 1 ملم، يتم تطبيق الإعدادات التالية: 1500 V و 5 السيدة إينكوباتي ح 1 في 37 درجة مئوية في مرق سوبر الأمثل مع القمع كاتابوليتي (شركة نفط الجنوب؛ تريبتوني 20 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.5 غرام/لتر كلوريد الصوديوم، 2.5 مم بوكل، 10 مم مجكل2 ، الجلوكوز 20 ملم، ودرجة الحموضة 7.0) المتوسطة السائل وانتشار ثم إلى بيرتاني لوريا (رطل؛ تريبتوني 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 10 غرام/لتر كلوريد الصوديوم) أجار (1.5 ٪) لوحات تحتوي على 50 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل.
    1. على الشاشة للمستعمرات المقابلة لتحول كولاي تنتشر الحيوانات المستنسخة التي يرجح أن إدراج insert، 15 دقيقة قبل طلاء الخلايا اليكتروبوراتيد، 30 ميليلتر من 50 ملغ/مل 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) في ديميثيلفورماميدي. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  7. اختيار عدة مستعمرات بيضاء وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في وسائل الإعلام LB السائل. تنقية والبلازميدات استخدام مينيبريب كيت (انظر الجدول للمواد)، وتحليل أحجامها بالتفريد في 1% [اغروس] هلام في تاي المخزن المؤقت.
  8. حدد بلازميد المؤتلف على الأرجح استناداً إلى الهجرة الغرواني الكهربي مقارنة إلى عنصر التحكم بزب بليلفد. تأكيد تسلسل بلازميد المحدد بالتسلسل باستخدام كبسولة تفجير 5 '-ككتتتتكاتاتاتجاجك-3' و 5 '-جاتجكتكجتكاجججججكجاج-3' أن الجناح كاسيت التعبير كله في بزب بليلفد.
    ملاحظة: تذكر أن هذا بلازميد يحتوي على بوليلينكير bp 528 مع علامة لاكز الذي يتم استبداله بكدنا للفائدة. تعيين قيود قد تساعد على تحديد والبلازميدات حق المؤتلف.

2-الجيش الملكي النيبالي التعبير

  1. اليكتروبوراتي Co (انظر الشروط في 1.6) المحدد كولاي سلالة (BL21كولاي أو مشتق BL21) مع بليلفد-بزب-مشتق يحتوي على كدنا المقابلة للجيش الملكي النيبالي للفائدة وبلازميد p15LtRnlSm للتعبير عن المشاركة باذنجان الحمض الريبي النووي النقال ليجاسى. استخدام كولاي HT115(DE3)، الذي يفتقر إلى "الثالث رناسي"21، للتعبير عن الكشف مع مناطق طويلة مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل.
    ملاحظة: كلا الجيش الملكي النيبالي للفائدة وليجاسي الحمض الريبي النووي النقال مرناً يتم نسخها من قبل بوليميريز الحمض النووي الريبي كولاي . مطلوب لا ليسوجين DE3 للتعبير عن T7 رنا بوليميراز في سلالة كولاي ، على الرغم من وجود هذا ليسوجين له أي آثار ضارة.
  2. بعد ح 1 الحضانة عند 37 درجة مئوية في المتوسط السائل شركة نفط الجنوب، لوحة البكتيريا اليكتروبوراتيد في رطل المتوسطة الصلبة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. اختيار مستعمرة وتطعيم 1 ل حير قارورة Erlenmeyer مع 250 مل من سائل مرق رائع (السل) متوسطة (تريبتوني 12 غرام/لتر، 24 غرام/لتر الخميرة 0.72 م ك2مكتب البراءات الهنغاري4، 0.17 م خ2ص4، استخراج ووالغليسيرول 0.4 في المائة)، التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين و 34 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز قوي في 180 الثورات في الدقيقة الواحدة (لفة في الدقيقة). حصاد البكتيريا بين 12 و 16 ساعة بعد التطعيم الثقافة.

3-الجيش الملكي النيبالي استخراج وتنقية

  1. لأغراض التحليل، تأخذ 2 مل مختبرين للثقافة في نقاط الوقت المطلوب والطرد المركزي في 14,000 س ز 2 دقيقة تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 مم يدتا تريس-HCl و pH 8.0 ملم 1) قبل فورتيكسينج.
    1. إضافة مجلد واحد (50 ميليلتر) 1:1 (v/v) مزيج من الفينول (المشبعة بالماء واكويليبراتيد على درجة الحموضة 8.0 مع تريس-HCl، pH 8.0) الكلوروفورم. كسر الخلايا من فورتيكسينج قوية وفصل مراحل مائي والعضوية بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في س 14,000 ز.
    2. استعادة مراحل مائي (العليا) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي البكتيرية مجموع بعناية.
      ملاحظة: يمكن تخزين الأعمال التحضيرية في-20 درجة مئوية للتحليل اللاحق.
  2. لأغراض التحضير، من أجل الثقافة إلى 250 مل زجاجة أجهزة الطرد المركزي وزيادة ونقصان لأسفل الخلايا في س 14,000 ز للمادة 10 دقيقة تجاهل طافية. تغسل الخلايا التي ريسوسبيندينج في 30 مل الماء. نقل إلى أنبوب الطرد مركزي وتدور أسفل الخلايا مرة أخرى تحت نفس الظروف.
  3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من المخزن المؤقت اللوني (50 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، يدتا 0.2 مم) قبل فورتيكسينج.
    ملاحظة: وفي هذا الوقت، يمكن تجميد الخلايا في-20 درجة مئوية المضي قدما في تنقية في أي لحظة أخرى.
  4. استخدام إعداد بكتيرية طازجة أو المذابة، كسر الخلايا بإضافة المجلد 1 (10 مل) من الفينول: كلوروفورم (راجع الخطوة رقم 3.2) وفورتيكسينج بشدة.
  5. الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 12,000 س زواستعادة المرحلة المائية وإعادة استخراج مع حجم 1 (10 مل) من كلوروفورم نفس الظروف.
    ملاحظة: ويمكن تخزين إعداد الجيش الملكي النيبالي في-20 درجة مئوية في هذه المرحلة.
  6. كذلك تنقية الحمض النووي الريبي البكتيرية مجموع بشاردة-تبادل اللوني. تصفية إعداد الجيش الملكي النيبالي خلال 45 ميكرومتر محقن تصفية والتحميل على عمود 1 مل ديثيليثانولاميني (دي).
    1. لتنقية اللوني، استخدم نظام لوني سائل بمعدل تدفق من 1 مل/دقيقة. قبل تحميل عينة، حجته العمود مع 10 مل من المخزن المؤقت اللوني (راجع الخطوة 3، 3 للتكوين).
    2. تحميل العينة وتغسل العمود مع 10 مل من المخزن المؤقت اللوني. الوت الجيش الملكي النيبالي مع 20 مل من شطف المخزن المؤقت (50 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، 1 م كلوريد الصوديوم، 0.2 مم يدتا) وجمع مختبرين 1 مل.
      ملاحظة: التيس الجيش الملكي النيبالي بسرعة في كسور الأولية. يمكن إعادة استخدامها لزيادة تنقية العمود. لهذا، أغسل العمود مع 10 مل مياه وتخزينها في 4 درجات مئوية في الإيثانول 20%.
  7. منذ جزءا رئيسيا من المؤتلف الحمض النووي الريبي يتراكم في كولاي في شكل دائري، يمكن استفادت هذه الخاصية لتنقية لتجانس12. فصل الكشف دائرية من نظرائهم الخطي بالأبعاد polyacrylamide هلام التفريد (2D صفحة) يجمع بين غير يشوه ويشوه (م 8 اليوريا) شروط12،22.

4. تحليل الحمض النووي الريبي

  1. تحضير هلام polyacrylamide 5% (أكريلاميدي 37.5:1:ن، ن '-ميثيلينيبيساكريلاميدي، نسبة الشامل) في TBE العازلة (مم 89 تريس، 89 مم الماء المقطر يدتا 2 مم) التي تحتوي على 8 أمتار اليوريا.
  2. ميكس 20 ميليلتر من استعدادات الجيش الملكي النيبالي بحجم 1 (20 ميليلتر) تحميل المخزن المؤقت (ميثلامين 98% 10 ملم تريس-HCl، pH 8.0، 1 مم يدتا، 0.0025% بروموفينول الأزرق وزايلين زيلين نفط 0.0025%)، احتضانها لدقيقة 1.5 عند 95 درجة مئوية في كتلة تدفئة، والتقط باردة على الجليد.
  3. تحميل العينات في جل polyacrylamide وتشغيل التفريد في الظروف المناسبة استناداً إلى أبعاد هلام (مثلاً، تشغيل 140 × 130 × 2 مم الهلام ح 2.5 في 200 V). وصمة عار للهلام لمدة 15 دقيقة في 0.5 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد ويغسل بالماء، وتصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لإنتاج المؤتلف الحمض النووي الريبي في كولاي استخدام نظام المستمدة من الفد12، هو المطعمة الجيش الملكي النيبالي للفائدة إلى سقالة "رنا الفد". هذا الجيش الملكي النيبالي تشيميريك أعرب عن المشاركة على طول ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان في كولاي. حالما تتم معالجتها والمشقوق وسيركولاريزيد، تشيميريك دائرية الجيش الملكي النيبالي، الذي يبرز الجيش الملكي النيبالي للفائدة، يرجح أن يشكل ribonucleoprotein معقدة مع الإنزيم الباذنجان أعرب المشترك الذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء البحث في تسلسل الفد ومتطلبات بنية المشاركة في الاعتراف بواسطة ليجاسى الحمض الريبي النووي النقال الباذنجان، لاحظنا أن التعبير المشترك كل الجزيئات في غير المضيفة كولاي التي أدت إلى تراكم فرويد دائرية كبيرة غير متوقعة أشكال في الخلايا البكتيرية19. أننا فهمنا أن تراكم كبير فرويد الجيش الملكي النيبالي في كولاي كان على الأرجح نتيجة للمشترك معربا عن جزيء الحمض النووي الريبي مستقرة جداً، مثل الصغيرة نسبيا (333 nt)، والغاية أساس-إقران، فرويد دائرية، وبروتين لهذا يعرض فرويد خاصة تقار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن التكنولوجيا المبينة في هذا البروتوكول كان براءة اختراع (الولايات المتحدة للبراءات رقم EP14382177.5 PCT/EP2015/060912).

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل منح BIO2017-83184 آر واكسب-BIO2017-91865 من وزارة العلوم دي الإسبانية, Innovación y جامعات (FEDER صناديق التمويل المشترك).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Phusion عالية الدقة DNA polymeraseThermo ScientificF530S
Bpi< em> IThermo ScientificER1011
AgaroseConda8010D1 Low EEO
TrisPanReac AppliChemA1086،1000
حمض الخليكPanReac AppliChem131008.1214
EDTAسيجما ألدريتشE5134-500G
بروميد الإيثيديومPanReac AppliChemA1152،00251٪
Zymoclean Gel استعادة الحمضالنووي Zymo ResearchD4001
NanoDropThermoFisher ScientificND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England BioLabsE2621S
DNA Clean & المكثفZymo ResearchD4003
EporatorEppendorf4309000019
الإشريكية القولونية< / م > DH5 & ألفا ؛Invitrogen18265-017
TryptoneIntron BiotechnologyBa2014
مستخلص الخميرةIntron Biotechnology48045
NaClPanReac AppliChem131659.1211
AgarIntron Biotechnology25999
AmpicillinPanReac AppliChemA0839،0010
X-galDuchefaX1402.1000
N ، N-DimethylformamidePanReac AppliChem131785.1611
NucloSpin PlasmidMacherey-Nagel22740588.250<
em> Escherichia coli< / em> BL21 (DE3)Novagen69387-3
الإشريكية القولونية< / em> HT115 (DE3)المرجع Timmons et al. ، 2001
ChloramphenicolDuchefaC 0113.0025
GlycerolPanReac AppliChem122329.121187٪
KH2< / sub>PO4< / sub>PanReac AppliChem131509.1210
K2HPO4< / sub>PanReac AppliChem122333.1211
HClPanReac AppliChem131020.1211
PhenolScharlauFE0479100090٪
ChloroformPanReac AppliChemA3691،1000
Filtropur S 0.2Sarstedt83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF العمودGE Healthcare Life Sciences17-5055-01
& Auml; نظام الكروماتوغرافيا السائل KTAprime plusGE Healthcare Life Sciences11001313
أكريلاميدPanReac AppliChemA1089،10002K
N، N ' < / م >-ميثيلين بيساكريلاميدسيجما ألدريتشM7279-100G
اليوريابانريك AppliChem146392.1211
حمض البوريكPanReac AppliChemA2940،1000
فورماميدPanReac AppliChemA0937،2500
بروموفينول أزرقسيجما ألدريتشB8026-5G
زيلين سيانولسيجما ألدريتشX4126-10G
N ، N & Prime ؛ -Bis (أكريلويل) سيستامينسيجما ألدريتشA4929-5G

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., et al. Current Research on Non-Coding Ribonucleic Acid (RNA). Genes. 8 (12), (2017).
  2. Hamada, M. In silico approaches to RNA aptamer design. Biochimie. 145, 8-14 (2018).
  3. Bobbin, M. L., Rossi, J. J. RNA Interference (RNAi)-Based Therapeutics: Delivering on the Promise? Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 103-122 (2016).
  4. Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA Interference for Mosquito and Mosquito-Borne Disease Control. Insects. 8 (1), 4(2017).
  5. Ponchon, L., Dardel, F. Large scale expression and purification of recombinant RNA in Escherichia coli. Methods. 54 (2), 267-273 (2011).
  6. Kikuchi, Y., Umekage, S. Extracellular nucleic acids of the marine bacterium Rhodovulum sulfidophilum and recombinant RNA production technology using bacteria. FEMS Microbiology Letters. 365 (3), fnx268(2018).
  7. Ponchon, L., Dardel, F. Recombinant RNA technology: the tRNA scaffold. Nature Methods. 4 (7), 571-576 (2007).
  8. Batey, R. T. Advances in methods for native expression and purification of RNA for structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 26, 1-8 (2014).
  9. El Khouri, M., et al. Expression and Purification of RNA-Protein Complexes in Escherichia coli. Methods in Molecular Biology. 1316, 25-31 (2015).
  10. Ponchon, L., et al. Co-expression of RNA-protein complexes in Escherichia coli and applications to RNA biology. Nucleic Acids Research. 41 (15), e150(2013).
  11. Umekage, S., Kikuchi, Y. In vitro and in vivo production and purification of circular RNA aptamer. Journal of Biotechnology. 139 (4), 265-272 (2009).
  12. Daròs, J. -A., Aragonés, V., Cordero, T. A viroid-derived system to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli. Scientific Reports. 8 (1), 1904(1904).
  13. Daròs, J. A. Viroids: small noncoding infectious RNAs with the remakable ability of autonomous replication. Current Research Topics in Plant Virology. , Springer International Publishing Switzerland. 295-322 (2016).
  14. Flores, R., Hernández, C., Martínez de Alba, A. E., Daròs, J. A., Di Serio, F. Viroids and viroid-host interactions. Annual Review of Phytopathology. 43, 117-139 (2005).
  15. Di Serio, F., et al. ICTV Virus Taxonomy Profile: Avsunviroidae. The Journal of General Virology. 99 (5), 611-612 (2018).
  16. Nohales, M. A., Flores, R., Daròs, J. A. Viroid RNA redirects host DNA ligase 1 to act as an RNA ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13805-13810 (2012).
  17. Nohales, M. A., Molina-Serrano, D., Flores, R., Daròs, J. A. Involvement of the chloroplastic isoform of tRNA ligase in the replication of viroids belonging to the family Avsunviroidae. Journal of Virology. 86 (15), 8269-8276 (2012).
  18. Daròs, J. A. Eggplant latent viroid: a friendly experimental system in the family Avsunviroidae. Molecular Plant Pathology. 17 (8), 1170-1177 (2016).
  19. Cordero, T., Ortolà, B., Daròs, J. A. Mutational Analysis of Eggplant Latent Viroid RNA Circularization by the Eggplant tRNA Ligase in Escherichia coli. Frontiers in Microbiology. 9 (635), (2018).
  20. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  21. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
  22. Schumacher, J., Randles, J. W., Riesner, D. A two-dimensional electrophoretic technique for the detection of circular viroids and virusoids. Analytical Biochemistry. 135 (2), 288-295 (1983).
  23. Hansen, J. N., Pheiffer, B. H., Boehnert, J. A. Chemical and electrophoretic properties of solubilizable disulfide gels. Analytical Biochemistry. 105 (1), 192-201 (1980).
  24. Giguère, T., Adkar-Purushothama, C. R., Bolduc, F., Perreault, J. P. Elucidation of the structures of all members of the Avsunviroidae family. Molecular Plant Pathology. 15 (8), 767-779 (2014).
  25. López-Carrasco, A., et al. The transcription initiation sites of eggplant latent viroid strands map within distinct motifs in their in vivo RNA conformations. RNA Biology. 13 (1), 83-97 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Escherichia coli tRNA ligase

مقالات ذات صلة