كشف اللاعبين الرئيسيين من الحصانة Humoral: متقدم ومحسن اللمفاويات العزلة البروتوكول من بقع الفاري بير في

هو زينت الجهاز الهضمي كامل من البداية إلى النهاية مع شبكة اللمفاوية واسعة النطاق الذي يحتوي على الخلايا المناعية أكثر من أي جهاز في الإنسان والفأر¹. بير بقع (PPs) تشكل عنصرا رئيسيا لفرع هذه المنظمة المناعية الخلوية، ما يسمى الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالقناة الهضمية (جالت)^2،3في الأمعاء. داخل المركز الصحفي، آلاف ملايين مستضدات المشتقة من المواد الغذائية، الحجمية commensal ومسببات الأمراض التي يتم أخذ عينات باستمرار، وعندما تكون الاستجابات المناعية المناسبة اللازمة تجاهها المناعة المعوية وبالتالي الحفاظ على محمل التوازن. وفي هذا المعني، ذكر المكتب الصحفي يمكن أن يطلق عليه اسم "اللوزتين الأمعاء الدقيقة". ذكر المكتب الصحفي تتكون من الأقسام الفرعية الرئيسية: قبة سوبيبيثيليال (SED)، مناطق المسام ب-خلية كبيرة؛ السطحية المرتبطة جريب ظهارة (FAE) ومنطقة إينتيرفوليكولار (أي إف آر) حيث تكون خلايا تي يقع⁴. ويمنح هذا التقسيم الفريد من المكتب الصحفي المستجيب مختلفة تمكن الخلية مجموعات فرعية للتعاون، وبالتالي، السيلينيوم في القناة الهضمية.

ذكر المكتب الصحفي انعدام اللمفاوي الزبائ، ونظرا لهذا السبب، يجري المستضدات تنقل إلى الصحفي من الأمعاء لا عن طريق الأوعية اللمفاوية خلافا لمعظم الأجهزة اللمفاوية الأخرى. بدلاً من ذلك، الخلايا الظهارية المتخصصة الموجودة في صناديق النشاط الخاص، ما يسمى م الخلايا، المسؤولة عن نقل المستضدات لومينال إلى الصحفي⁵. وفي وقت لاحق، يتم انتقاؤها المستضدات المنقولة بالخلايا الجذعية (DCs) والبالعات التي تقع في منطقة قبة سوبيبيثيليال (SED) تحت^6،FAE⁷. عملية الفرز هذه مستضد بوحدات تحكم المجال Dc في PP أمر حاسم لبدء الاستجابة المناعية التكيفية⁸ والجيل اللاحق من الخلايا المبيضي إيغا⁹.

نظراً للعبء الثقيل مستضدي من كومينسال النباتات والمواد الغذائية، المضيف الصحفي اندوجينوسلي المنشط المستجيب T وخلية بمجموعات فرعية في وفرة كبيرة مثل طفح وب GC إيغا⁺ الخلايا¹⁰، مما يوحي بأن المكتب الصحفي تمثيل موقع للمناعة النشطة ¹¹من الاستجابة. كشف ليصل إلى 20-25% طفح خلايا CD4 مجموع⁺ تي الخلية المقصورة ويصل إلى 10 – 15% ب GC الخلايا داخل الخلايا ب المجموع هو ممكن في المكتب الصحفي لجمعها من الفئران C57BL/6 الشباب المطعمين¹². خلافا لسائر أنواع الخلايا مساعد تي (أي.، Th1، Th2، خلايا Th17)، تظهر الخلايا طفح انتحاء فريدة من نوعها في المسام خلية باساسا بسبب التعبير CXCR5، الذي يعزز طفح الخلية صاروخ موجه على طول التدرج CXCL13¹³. في مناطق المسام خلية ب PPs، حمل الخلايا طفح جزئ تبديل فئة إيغا وهايبرموتيشن جسدية في تنشيط الخلايا ب من التي تميز عالية تقارب إيغا إنتاج خلايا¹⁴. وفي وقت لاحق، هذه الخلايا البلازما إفراز جسم تهاجر إلى بروبريا الصفيحة (ليرة لبنانية) وتنظيم التوازن المناعي في الأمعاء¹⁰.

تحديد وتوصيف طفح وب GC السكان خلية داخل المركز الصحفي قد تمكن الباحثين من التحقيق في ديناميات خلطيه الاستجابات المناعية تحت ظروف حالة ثابتة دون الحاجة إلى نماذج التحصين مضيعة للوقت تستخدم تقليديا في "ب" طفح-GC خلية الدراسات^15،16،،من¹⁷¹⁸. تحليل الخلايا طفح داخل المكتب الصحفي غير مباشرة كمجموعات فرعية خلية أخرى. وتشمل التحديات التقنية تحديد الأنسجة مثالية إعداد الشروط، سطح جسم-علامة الجمع، فضلا عن تحديد الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية. حقول البحث طفح و PP يحمل تقلبات كبيرة من حيث الإجراءات التجريبية وهي أبعد ما تكون عن منح توافق في آراء وضع بروتوكولات موحدة لأسباب عدة. أولاً، يميل كل خلية فرعية داخل المكتب الصحفي خلطات متأثرة بظروف إعداد الأنسجة التي تحتاج إلى مزيد من التعديلات في طريقة فرعية محددة خلية. ثانيا، هناك اختلاف كبير بين طرق الإبلاغ عنها فيما يتعلق بتفاصيل إعداد الخلية من "لالصحفي. الثالثة"، العدد الدراسات المقارنة على أساس بروتوكول التحقيق تقنيات إعداد الأنسجة مثالية والظروف التجريبية PP وطفح البحث محدودا نوعا ما.

الدراسات الحالية المستندة إلى بروتوكول اقترح PP خلية إعداد^{19،20،21،22} لم تكن طفح-أو GC المنحى الخلية ب. وعلاوة على ذلك، تم العثور على بعض شروط إعداد الأنسجة الموصى بها للصحفي^19،20 مثل الهضم المستندة إلى كولاجيناز تؤثر على نتائج تحديد الهوية طفح بالتدفق الخلوي سلبا على¹⁸. وعلى هذا الأساس، نحن مسبب أن بروتوكولا الأمثل وموحد وقابل لإعادة الإنتاج التي يمكن استخدامها لدراسة ديناميات خلية طفح وب GC داخل المكتب الصحفي قيمة بالنسبة للمحققين الذين يعملون على هذا الموضوع. هذه الحاجة أعطانا الحافز لتوليد بروتوكولا محسنة وحديثة لعزل وتوصيف لمفاوية PP ناعما محسن لاسترداد الخلوي وصلاحية وكفاءة لتدفق سيتوميتريك توصيف عدة تي وب مجموعات فرعية من الخلية. نحن تهدف أيضا إلى استبعاد عدة خطوات إعداد شاقة اقترح في البروتوكولات السابقة، وبالتالي الحد من التلاعب المطلوب والوقت لإعداد الخلايا والأنسجة من المكتب الصحفي.

وأجريت جميع الدراسات والتجارب المبينة في هذا البروتوكول بموجب المبادئ التوجيهية وفقا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) من بيت إسرائيل ديكونيس الطبي.

1-تصميم الإعداد التجريبية والمجموعات الماوس

1. (اختياري) شارك بيت الفئران التجريبية لتيسير انتقال أفقي للقناة الهضمية الحجمية بين الفئران التجريبية، والحد من التقلبات غير محددة داخل الخلايا اللمفية PP. بالإضافة إلى ذلك، استخدام عناصر تحكم ليتيرماتي من نفس الجنس للحد من التقلبات.

2-الجراحي وخطوات إعداد الأنسجة:

1. الاستئصال الجراحي للامعاء (SI)
   1. Euthanize الفئران استخدام الخنق₂ CO أو أي طريقة مناظرة أقرته لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية.
   2. نقل الماوس إلى منطقة مخصصة للاستئصال الجراحي. وضع المؤخر لأسفل وتطهير البطن مع الإيثانول 70%. القيام فتح البطن بقطع الجلد البطن والصفاق على طول خط الوسط من العانة إلى القفص الصدري مما فتح التجويف الصفاقى.
      ملاحظة: تنفيذ الشق الأول على مساحة صغيرة نسبيا من الجلد لتجنب اختراق التجويف الصفاقى وإلحاق أضرار بالانسجة المعوية. مواصلة الختان حتى الحدود التشريحية المرجوة.
   3. تحديد الأعور، الذي هو معلما مثاليا للكشف عن الدقاق المحطة الطرفية، الذي يشكل الجزء الأعلى من الأمعاء الدقيقة.
      ملاحظة: يوجد الأعور عادة في الجانب الأيسر السفلي من البطن الماوس.
   4. تحديد تقاطع إيليوكايكال وجعل خفض هذا المستوى القاصي كما قدر الإمكان فصل الأعور الأمعاء. في جميع أنحاء الخطوات المقبلة، تجنب الاتصال الجسدي المفرط مع جدار الأمعاء للصحفي هشة تنهار بسهولة عند اللمس.
   5. إزالة بلطف الأمعاء الدقيقة أكمله حتى مصرة البواب بقطع مساريق استخدام مقص. تحديد نقطة التقاء بين بواب والاثني عشر، وقص العفج على هذا المستوى، مما يؤدي إلى إكمال مفرزة من الأمعاء الدقيقة من تجويف البطن.
      ملاحظة: (ط) تجنب فرط كهذا قد يسبب تمزق جدار الأمعاء. (ثانيا) إذا كان المطلوب هو عزل اللمفاويات ليرة لبنانية بالإضافة إلى الخلايا الليمفاوية PP، من الضروري إزالة كاملة من الدهون المساريقي العلوي. بيد لعزل PP فقط، تبقى الدهون المساريقي العلوي يمكن أن توفر بعض الفوائد خلال الخطوات العزل؛ ولذلك، ينبغي الحفاظ عليها.
   6. مكان فصل الأمعاء الصغيرة في لوحة 6-بئر مليئة ربمي الباردة + 10% مصل بقرى الجنين (FBS) ولطف تحرض الأنسجة يدوياً حتى جميع شرائح المعوية مغمورة في وسائط الإعلام الباردة. المحافظة على الأنسجة على الجليد في جميع أنحاء الخطوات المقبلة.
   7. بعد تشريح العدد المطلوب من الأمعاء الصغيرة الماوس، انتقل إلى الختان PP من الأمعاء الصغيرة التي تم جمعها.
2. الاستئصال الجراحي للصحفي، وإعداد تعليق خلية مفردة:
   1. بلطف نقل الأمعاء على منشفة ورقية التي تجتاح الدهون المساريقي العلوي باستخدام الملقط والجانب المساريقي العلوي تواجه منشفة ورقية. ترطيب الجزء معوي كامل مع الباردة ربمي + 10% FBS لتجنب جفاف الأنسجة والالتصاق.
      ملاحظة: المتبقية الدهون المساريقي العلوي يمكن أن تكون مفيدة في هذه المرحلة نظراً لشرائح الأنسجة الدهنية في موقع سي المساريقي العلوي سوف تتمسك بمنشفة ورقية حفظ الموقع المساريقي العلوي المضادة مواجهة.
   2. تحديد الصحفي، الذي يظهر كمجاميع متعددة لوبولاتيد الأبيض في شكل "قرنبيط-مثل" على الجانب مضادة المساريقي العلوي لجدار الأمعاء.
      ملاحظة: لا يوصي فلاشينغ مضمون لومينال حتى هي اقتطعت الصحفي جميع. إفراغ محتوى لومينال قد يتسبب في انهيار المركز الصحفي وسيمنع تباين اللون بين الصحفي وجدار الأمعاء، ومفيدة جداً لتحديد الهوية البصرية للمركز الصحفي.
   3. بعد تحديد المركز الصحفي في الجهة المضادة المساريقي العلوي، مكان مقص منحنى نهاية العمليات الجراحية على الصحفي (منحنى ينبغي مواجهة) تقييد PP من الحدود البعيدة والقريبة.
      اختياري: دفع PP بلطف نحو ريش مقص باستخدام الإصبع. هذه المناورة سيؤدي إلى استبعاد أفضل غير PP الأنسجة المحيطة. المكوس الصحفي بلطف، باستثناء الأنسجة المعوية المحيطة.
      ملاحظة: (ط) هذه الخطوة أمر حاسم للحصول على PP خلية الغلة القصوى مع التقليل من تلوث الخلية المجاورة المقصورات المعوية مثل ليرة لبنانية وظهاره الأمعاء، وأيضا غنية بالخلايا T. (ثانيا) من أحد SI اقتطعت من الماوس C57BL/6، يمكن جمعها الصحفي 5-10 (متوسط الحجم، لوبولاتيد متعددة). بهدف المركز الصحفي حتى أصغر (لا لوبولاتيد متعددة)، جمع يصل إلى الصحفي 12-13 للماوس (C57BL/6) من الممكن استخدام هذا البروتوكول.
   4. نقل الصحفي قصت لوح زراعة الأنسجة 12-بئر مليئة بالجليد ربمي + 10% FBS وحافظت على الجليد باستخدام الملقط أو المقص الجراحي منحنية.
      ملاحظة: (ط) فورا بعد الختان للمركز الصحفي، مخاط ومحتوى الأمعاء على سطح PP يمكن تنظيفها بفرك الأنسجة بلطف في منشفة ورقية. هذه الخطوة ستساعد على تحسين جدوى لمفاوية PP. (ثانيا) بدلاً من نقل المكتب إلى لوحة، نقل إلى فصل أنابيب يمكن أيضا اعتبار تبعاً لعدد العينة الكلية.
   5. اختياري: عند إتمام الختان PP وإيداعه لاحقاً في لوحة جيدا، عدد وحجم المكتب الصحفي لتجمع من مجموعات تجريبية مختلفة/الماوس يمكن توثيقها بالتقاط صورة للوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على ذكر المكتب الصحفي.
   6. إعداد مجموعة من أنابيب مخروطية 50 مل مليئة 25 مل ربمي + 10% FBS (استعد مسبقاً عند 37 درجة مئوية). باستخدام مقص، قطع حافة تلميح ميليلتر 1,000 من المسافة التي سوف تسمح لتطلع الصحفي مع ماصة 1 مل. نضح الصحفي مع ماصة 1 مل ونقلها من لوحة 12-جيدا زراعة الأنسجة بالأنابيب المخروطية استعداد 50 مل.
      ملاحظة: استخدام تلميح جديد لكل عينة الماوس لتجنب التلوث المتبادل بين العينات.
   7. تأمين الغطاء ووضع الأنابيب عمودياً في شاكر مداري في 37 درجة مئوية، مع التحريك المستمر في 125 – 150 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. ومن ناحية أخرى، إعداد مجموعة جديدة من أنابيب 50 مل ووضع مصفاة خلية 40 ميكرومتر على رأس كل أنبوبة، سيتم من خلالها إعداد تعليق خلية مفردة.
      ملاحظة: الخطوة الانفعالات (ط) سوف إزالة الأنقاض المحتوى والمخاط والخلايا المعوية المتبقية، التي تقلل من بقاء الخلية والانتعاش لمفاوية PP إذا لم إزالتها. (ثانيا) لا تنطبق أي نوع من إنزيمات الجهاز الهضمي في الأنسجة PP لعملية الهضم يسبب خسارة هائلة في التعبير CXCR5 من سطح الخلية.
   8. بعد الانفعالات، نقل ذكر المكتب الصحفي مصفاة خلية 40 ميكرومتر وضعت على رأس هذه الأنابيب المخروطية أعدت حديثا 50 مل. استخدام الجانب مقربة من المكبس حقنه 10 مل، بلطف تعطيل الصحفي من خلال مصفاة الخلية لتوليد تعليق خلية مفردة. شطف في المصفاة مع 15 – 20 مل من البرد ربمي + 10% FBS.
      ملاحظة: (ط) قبل التصفية، اهتز الأنابيب التي تحتوي على الصحفي أفقياً. هذا يهز قصيرة ستسهل نقل الصحفي إلى مصافي الخلية. (ثانيا) باستخدام مصفاة خلية 70 ميكرومتر لعزل الخلايا المناعية غير اللمفاوية (مثلاً.، وحيدات، الضامة، وحدات تحكم المجال Dc) ينصح.
   9. الطرد المركزي من تعليق خلية مفردة في 350-400 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
   10. وتجاهل المادة طافية بعناية ريسوسبيند الخلايا بتركيز 10 × 10⁶ خلايا/مل. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير.
       ملاحظة: (ط) قبل أن عد الخلايا، خلية الإجمالي لكل مجموعة الماوس PP يمكن تكون تقريبا يقدر العدد استخدام الصيغة التالية: "0.5-1 × 10⁶ خلايا x (عدد PPs) = مجموع الخلايا". قد يكون من الضروري تخفيف المزيد مع تريبان الأزرق لخلية العد. (ثانيا) كبديل للعد اليدوي، يمكن استخدام عدادات خلية الآلي.
   11. نقل 2-2.5 × 10⁶ خلايا في المجلد المناسب (على سبيل المثال., 200 ميليلتر) في لوحة 96-بئر مستديرة القاع.
       ملاحظة: لعينات المراقبة السلبية ولون واحد، قد يكون 0.5-1 × 10⁶ خلايا كافية.
   12. الطرد المركزي اللوحة في 350 غ س لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
   13. تغسل الخلايا في 200 ميليلتر "تلطيخ المخزن المؤقت".

3-سطح جسم تلطيخ

1. تلوين صلاحية:
   1. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من صبغة الجدوى يمكن حلها المخفف في برنامج تلفزيوني (1:1، 000). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد أو عند 4 درجة مئوية في الظلام.
      ملاحظة: تلطيخ (ط) داخل الخلايا للكشف عن النسخ الرئيسية عوامل مثل Foxp3 أو Bcl-6 يتطلب تثبيت الخلايا. وفي هذه الحالة، الأصباغ البقاء غير يمكن حلها (مثلاً.، 7-عاد DAPI) لا يمكن استخدامه. (ثانيا) لتمييع صبغ صلاحية يمكن حلها، لا تستخدم أي المصبوغة من المخزن المؤقت الذي يحتوي على البروتين. الوسائط المستخدمة في هذه الخطوة يجب أن تكون خالية من البروتين. (ثالثا) استبعاد الخلايا الميتة باستخدام تلطيخ البقاء حاسم للخلايا الميتة يمكن أن يسبب صعوبات تقنية خطيرة في التحليل الخلوي التدفق التي تنبعث منها أوتوفلوريسسينسي، وربط الأجسام المضادة السطحية نونسبيسيفيكالي، الذي قد يؤدي إلى خطأ نتائج إيجابية.
   2. تغسل الخلايا مرتين مع تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
2. كتلة fc والسطحية-الطبقة الأولى:
   1. إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في تلطيخ المخزن المؤقت.
   2. ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من استعداد نادي كتلة الحل. احتضان لمدة 15 دقيقة على الجليد.
   3. دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من سطح جسم كوكتيل (انظر الجدول 1 لجسم موجزة) أعد في تخفيف مناسبة. تبني على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
   4. تغسل مرتين عن طريق إضافة المخزن المؤقت المصبوغة المفرط. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
3. السطح-الطبقة الثانية:
   1. تحضير حل Streptavidin المصبوغة بتمييع مترافق fluorochrome Streptavidin في المخزن المؤقت المصبوغة.
   2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا تلطيخ الحل مع 100 ميكروليتر من ستريبتافيدين قبل المخفف (1: 100). احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل في الجليد في الظلام.
   3. تغسل مرتين تلطيخ المخزن المؤقت. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة.
      اختياري: إذا تلطيخ داخل الخلايا للكشف عن خلية T التنظيمية الحبيبي هو غير مرغوب فيه، بعد الغسيل الأخير، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل إلى أنابيب مناسبة للحصول على البيانات في تدفق سيتوميتير. عند العينات ليست ثابتة، ينبغي إجراء الحصول على البيانات بالتدفق الخلوي داخل ح 3 – 4 للحصول على نتائج دقيقة.

4. تثبيت الخلية

1. إعداد التثبيت/بيرميبيليزيشن (إصلاح/بيرم) العامل الحل باستخدام الكواشف من Foxp3/النسخ "عامل تلطيخ المخزن المؤقت تعيين". خلط جزء واحد من التثبيت/بيرميبيليزيشن التركيز مع ثلاثة أجزاء من التثبيت/permeabilization مادة إلى الحجم النهائي المطلوب.
2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من الإصلاح/بيرم العامل الحل.
3. احتضان صفيحة الجليد أو عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. لا تتجاوز 20 دقيقة لهذه الخطوة. قد يقلل فترة حضانة أطول شدة استرداد الخلية.
4. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نفض الغبار اللوحة. (اختياري) بعد هذه الخطوة، يمكن تخزين خلايا ثابتة لعدة أيام في 4 درجات مئوية في تلطيخ مخزن يحتوي على ألبومين المصل البقري (BSA) أو FBS حتى اللاحقة داخل الخلايا تلطيخ أو التدفق الخلوي اقتناء.
5. ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من بيرميبيليزيشن المخزن المؤقت (x1) الطازج المخفف مسبقاً في تنقية المياه.
6. الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
7. أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت والطرد المركزي في 350 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت

5-داخل الخلايا تلطيخ

1. إعداد الحل Fc-كتلة بتمييع الأجسام المضادة-CD16/32 (1: 200) في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن.
   ملاحظة: بعد الخطوة التثبيت، الخلايا يجب الاحتفاظ في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن حتى نهاية عملية المصبوغة داخل الخلايا.
2. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 20 ميكروليتر من حل كتلة Fc. احتضان لمدة 10 – 15 دقيقة في RT في الظلام.
3. دون الغسيل، إضافة 80 ميكروليتر من داخل الخلية جسم كوكتيل (100 ميكروليتر الحجم النهائي) المخفف مسبقاً في المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن. احتضان لمدة 30 دقيقة في الرايت
4. إضافة 100 ميكروليتر من "المخزن المؤقت بيرم"، وأجهزة الطرد المركزي في 350 غ س لمدة 5 دقائق في الرايت
5. أغسل مرة واحدة مع 200 ميكروليتر permeabilization المخزن المؤقت، والطرد المركزي في ز 350 x لمدة 5 دقائق في الرايت
6. بعد الغسيل النهائي، ريسوسبيند الخلايا في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت ونقل الخلايا في أنابيب مناسبة (الحجم النهائي ميكروليتر 400 في المخزن المؤقت المصبوغة) والحصول على البيانات بالتدفق الخلوي. كما يمكن تشغيل عينات الملون في لوحة 96-جيدا دون نقل إلى أنابيب إذا كان متوفراً cytometer تدفق مع خيار قارئ لوحة. هذه الخطوة يقلل من فقدان الخلية أثناء نقل الخلية.
7. الحصول على حد أدنى من 5 × 10⁵ مجموع الخلايا في سيتوميتير تدفق ليتمكن من القيام بتحليل استنساخه من طفح، معدل الخصوبة الإجمالي، فضلا عن خلايا ب GC.

على النقيض من بروتوكول سابق20، لاحظنا أن الصحفي ليست موزعة بالتساوي سي ولكن المترجمة أكثر كثافة نحو الغايات البعيدة والقريبة من الدولية الاشتراكية كما هو موضح في الشكل 1A. وأظهر تحليل تدفق سيتوميتريك، إذا اتبعت بشكل صحيح، لدينا بروتوكول يعطي سكان لمفاويات PP الذي يوضح توزيع المبعثر إلى الأمام--الجانب شبيه سبلينوسيتيس (الشكل 2 أ، ه، و 2D، ح) مع > خلية 95% صلاحية (الشكل 2 و 2 واو). خلافا لأجهزة اللمفاوية الثانوية (سلوس)، في الفئران C57BL/6 حوالي 70-80 في المائة من مجموع PP لمفاوية تتكون من خلايا ب، بينما خلايا CD4+ تي الخلايا تشكل فقط 10-15% من مجموع الخلايا الليمفاوية PP (الشكل 2 و 2 ز).

يرجى ملاحظة أن CD4+ CD19+ الخلايا إيجابية مزدوجة (DP) تشكل ≈ 1% من مجموع الخلايا الليمفاوية PP. مع بعض الاحتياطات أثناء إعداد الخلية مثل أداء Fc-كتلة ضد مستقبلات Fc خلايا ب واستثناء doublets، خلايا CD4+ CD19+ DP السكان خلية يمكن تصغير (الشكل 3 أ وب). بيد أن جزءا صغيراً الحقيبة التي لا تثبت المبعثر إلى الأمام (FSC) خصائص doublets أمر لا مفر منه وينبغي أن بوابات الخروج من البوابات T وخلية بايجابيه واحدة (الشكل 3B). كشفت النتائج التي توصلنا إليها أن الخلايا ب داخل الخلايا DP CXCR5 صريح جداً على سطحها (الشكل 3) التي يمكن أن تؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة في بوابة طفح التي يتم تعديلها استناداً إلى التعبير CXCR5 في خلايا CD4+ تي الخلايا. من ناحية أخرى، وجدنا أن GL7، علامة على تنشيط الخلايا باء، أعرب في خلايا CD4+ CD19+ DP الخلايا (الشكل 3D)، التي قد تتسبب في حدوث تداخل مع النابضة الخلية ب GC.

أمثلة للخلية طفح وب GC النابضة خوارزميات يرد في الشكل 4. ب GC خلية النابضة، نستخدم وسم GL7 مقابل CD38، الذي يعرف ب GC الخلايا ك GL7+ CD38– ب الخلايا (الشكل 4 أ-ب). وصف السلطة الوطنية الفلسطينية يمكن استخدامها بدلاً من GL723 بينما CD38 يمكن استبداله بإحدى العلامات التالية: IgD و Bcl-6 و CD95. البديل النابضة استراتيجيات للخلايا ب GC وأثبتت في S1 الشكل. ويبين نسبة الخلية ب GC في المكتب الصحفي تقلبات كبيرة في الفئران C57BL/6. ومع ذلك، مقارنة بغيرها سلس، ذكر المكتب الصحفي يكون أعلى بكثير من نسبة الخلية ب GC مع مجموعة من 2-10% من مجموع الخلايا ب ظروف حالة ثابتة. النابضة استراتيجية للخلايا طفح PP يوصف CD19– CD4+ PD-1مرحبا CXCR5+ تي الخلايا (الشكل 4 أ، ج). "ارسم حمار وحشي" وجد أن أسلوب البيان العملي أمثل لطفح النابضة كما أنه يصور PD-1مرحبا السكان أكثر حدة بالمقارنة مع الأنواع الأخرى الأرض (الشكل 4). معدل الخصوبة الإجمالي، مجموعة فرعية خلايا طفح معربا عن Foxp3، هي بوابات ك CD19– CD4+ PD-1مرحبا CXCR5+ Foxp3+ تي الخلايا (الشكل 4). مثل خلايا ب GC، الكسر خلية طفح يختلف أيضا في الأفراد المطعمين الماوس مع مجموعة من 10-20% من مجموع CD19– CD4+ PP لمفاوية. وترد تفاصيل خوارزميات النابضة بديلة للخلايا طفح في الشكل 4Eوو و الشكل S1C، دال

لتجنب الإيجابية الكاذبة بسبب تلوين الخلفية وأوتوفلوريسسينسي، ايستب عناصر تحكم أو عناصر تحكم يعادل بديلة مثل الأسفار ناقص واحد (FMO) أن يدرج في لوحة المصبوغة كعنصر تحكم سلبية لعلامات خلية طفح وب GC ( 4 الرقم-ي).

لتحسين الظروف اللازمة لإعداد الأنسجة PP، قمنا بتطوير استراتيجية تجريبية داخليا التي تسيطر عليها رواية، التي جمعت من الماوس فردية واحدة الصحفي وتجميعها بشكل منفصل حسب أصلهم التشريحية (على سبيل المثال-، والاثني عشر، لفائفي). للقيام بتجارب، الصحفي المجمعة تم تعيينها إلى مجموعات فردية حتى كل التجريبية وضمت المجموعة السيطرة على عدد متساو من الصحفي من كل منطقة التشريحية (الشكل 5A). بهذا النهج، وجدنا أن الهضم الأنزيمي المستندة إلى كولاجيناز (اختبار في 37.5 ملغ كولاجيناز الثاني أو الرابع كل 25 مل مزيج الهضم = 1.5 ملغ/مل)، الذي يستخدم عادة لعزل الخلايا اللمفاوية من الأنسجة المخاطية المختلفة، CXCR5 انخفاض كبير التعبير في PP لمفاوية (الشكل 5 (ب))، لا سيما في الخلايا طفح (5F الشكل--أنا)، بينما التعبير عن جزيئات سطحية أخرى (مثلاً.، CD19, CD4) ظلت سليمة (الشكل 5 ج-ه). الحد من الكشف عن CXCR5 كان بارزا حتى أن التعبير عن CXCR5 في خلايا طفح تعامل كولاجيناز كان لا يمكن تمييزها تقريبا من التحكم ايستب (5F الشكل--أنا). مزيد من التجارب أظهرت أن مستوى التدخل الهضم الأنزيمي مع التعبير CXCR5 تعتمد على استنساخ جسم CXCR5 المستخدمة (الشكل 6A-F). على وجه التحديد، عند العلاج الثاني كولاجيناز، كان قدرة الكشف عن استنساخ جسم CXCR5 8 2 البصر أكثر كثيرا، من قدرة الكشف عن استنساخ جسم CXCR5 L138D7 (الشكل 6A-د).

خفض الهضم الأنزيمي ليس فقط التعبير عن CXCR5 ولكن أيضا النسبة من مجموع الخلايا الليمفاوية داخل الخلايا PP كما تحددها خصائص منتدى التعاون الأمني-التعاون بين بلدان الجنوب، بينما جزء كبير من الخلايا المعزولة من هضم PPs معارضها إلى الأمام والجانب مبعثر كثافة أعلى مما PP لمفاوية (الرقم 7 ألف-ج)- حدث آثار كولاجيناز على استرداد الخلية بطريقة تعتمد على الجرعة (الشكل 7 أ، ح-ي). زيادة الهضم الأنزيمي بقاء الخلية (الشكل 7، هاء). غير أن هذا الاستحقاق لم تكن كاوساتيفيلي مرتبطة بالهضم كولاجيناز لأنه كان يفضل الخلايا المعزولة من الصحفي بعد الانفعالات دون كولاجيناز المثل (الرقم 7F). تم تحسين الكشف عن النسخ النووية معامل Foxp3، الذي يكتسي أهمية خاصة هنا لأنه يقدر عادة أثناء عزلة طفح لتحديد الخلايا معدل الخصوبة الإجمالي، بالتحريض على 37 درجة مئوية بغض النظر عن هضم كولاجيناز (الرقم 7 ).

رقم 1: بنية العيانية وتوزيع بقع مورين بير التشريحية. (أ)-الحصول على صورة من الإثناعشرية نهاية الأمعاء الدقيقة مع المعدة. يتم الإشارة إلى اثنين من المكتب الصحفي للموقع عن كثب في العفج بالسهام السوداء. (ب)-الصحفي التي تم جمعها من أحد عشر C57BL/6 الفئران كانت مخزنة على حدة في صفيحة جيدا 12. (ج)-الصورة من المكتب الصحفي للماوس قصت الطازجة المعروضة في مصفاة خلية 40 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: تدفق خوارزمية النابضة الأساسية للخلايا الليمفاوية PP وتوصيف سيتوميتريك. (أ)-قطع دوت تبين توزيع لمفاوية PP غير المثبتة حديثا معزولة على طول محاور منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب الذي يحمل التشابه الكبير إلى سبلينوسيتيس صورت في (د). (ب)-استبعاد خلايا الميتة عن طريق التعبير 7AAD. 7AAD– الخلايا تمثل الخلايا الحية. (ج)-CD19 وإيمونوفينوتيبينج على أساس خلايا CD4 خلايا تي وب بين بوابات قبل يعيش PP الخلايا. (ه-ز). تحليل لتدفق الممثل الثابتة PP لمفاوية. (ح)-خصائص تدفق الممثل سبلينوسيتيس الثابتة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: CD4+ CD19+ الخلايا إيجابية مزدوجة (DP) قضية الإيجابية الكاذبة في طفح وب GC خلية النابضة. (A). خلايا CD4+CD19+ DP أثبتت الخلايا الليمفاوية داخل الخلايا الحية في PP. (ب)-فصل DP الخلايا استناداً إلى خصائص منتدى التعاون الأمني دوبليتس ونوع. (ج،د). ويرد CXCR5 والتعبير GL7 الخلايا DP في مؤامرات الرسم البياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: طفح الممثل وب GC الخلية الاستراتيجية النابضة. جمعت الصحفي من ماوس 3-شهر قديم ولمفاويه معزولة كما هو موضح في المقطع بروتوكول. CD19 (A) وخلايا CD4 وسم ليعيش PP لمفاوية يصور. (ب) CD38لو GL7مرحباCD19+ ب كانت بوابات الخلايا كخلايا ب GC. كانت بوابات الخلايا (ج) طفح ك CXCR5+PD-1مرحبا CD4+ الخلايا. (د) معدل الخصوبة الإجمالي الخلايا هي جزء صغير من خلايا طفح معربا عن النسخ الخاصة بخلية تنظيمية معامل Foxp3 جنبا إلى جنب مع علامات طفح وهي بوابات ك CXCR5+ PD-1مرحبا Foxp3+ CD4+ تي الخلايا. (ه-و) النابضة استراتيجية لطفح علامات السطحية المؤكدة في سبلينوسيتيس المعزولة من البويضات NP-تحصين الماوس عن طريق التعبير BCL-6. (غ-ي) يصور ضوابط fluorescence ناقص واحد (FMO) لمفتاح طفح-معدل الخصوبة الإجمالي وعلامات خلية GC. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: الهضم الأنزيمي المستندة إلى كولاجيناز يؤدي إلى انخفاض كبير في الكشف عن CXCR5- (أ) ذكر المكتب الصحفي لمن ماوس شهرا 2 الموجود في العفج (≈ 1/3 الدانية)، صائم (≈ 1/3 الأوسط) وجمعت الدقاق (≈ 1/3 القاصي) وتجميعها بشكل منفصل. ووزعت PPs المجمعة على قدم المساواة للمجموعات التجريبية. وأجرى الهضم الأنزيمي مع كولاجيناز الثاني أو الرابع بتركيز 1.5 ملغ/مل مع الإثارة لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. (ب-E) المدرج التكراري يرسم تصور التعبير عن جزيئات السطح (CXCR5، CD19، PD-1، خلايا CD4) الخلايا المعزولة من الصحفي الذي تعرضوا الهضم المستندة إلى كولاجيناز. (و--أنا) طفح النابضة داخل تديرها كولاجيناز ومجموعات مراقبة يتجلى في مؤامرات حمار وحشي. وتمثل البيانات ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: تأثير كولاجيناز على التعبير CXCR5 أظهر اختلافاً كبيرا تبعاً لاستنساخ الأجسام المضادة-CXCR5- لمفاوية PP التي تم جمعها من ماوس عمره 6 أشهر، المجمعة والمنفصلين عن ذويهم في مختلف المجموعات فيما يتعلق بجسم استنساخ الهضم الأنزيمي ويستخدم التطبيق. (واو) نسبة الخلايا طفح هو مبين في مؤامرات حمار داخل بوابات قبل لايف، CD19– CD4+ تي الخلايا. (أ، ج و ه) الخلايا PP كانت ملطخة بجسم CXCR5 الماوس المضادة مترافق البيوتين (8 2 استنساخ)، و Streptavidin مترافق مع فلوروتشرومي BV421. (باء، دال و واو) PP الخلايا كانت ملطخة بالابتدائي مترافق ماوس المضادة CXCR5 جسم (استنساخ L138D7). (أ-ب) طفح النابضة المؤامرات من عسر الهضم PP لمفاوية. (ج-د) ذكر المكتب الصحفي ليهضم مع كولاجيناز الثاني (20 ملغ/25 مل مزيج الهضم) وتحريكها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. وتمثل البيانات تجربتين مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 7: الهضم المستندة إلى كولاجيناز والتحريض على 37 درجة مئوية تؤثر على بقاء الخلية، والانتعاش والكفاءة داخل الخلايا المصبوغة. وقد ضحى ماوس C57BL/6 أشهر 3؛ ذكر المكتب الصحفي جمع وتجميع كما هو موضح في الشكل 5 ألف. (أ) بعد أن تم تحريكها جمع الصحفي، الأنسجة حضور كولاجيناز الثاني (37.5 ملغ/25 مل مزيج الهضم) لمدة 10 دقائق، ويصور خصائص ثابتة PP الخلايا منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب في (أ) ويبين صلاحية تلطيخ الأرض ( د)-(ب، ه) بعد جمع الصحفي، وأبقى الأنسجة على الجليد بدون تحريض أو الهضم الأنزيمي؛ يصور خصائص ثابتة PPs الخلايا منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب في (ب) وتلطيخ البقاء هو مبين في (ه). (ج، و) وبعد جمع الصحفي، تم تحريكها الأنسجة 125-150 لفة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية وفي غياب من كولاجيناز؛ خصائص منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب، وصلاحية تلطيخ الخلايا PP الثابتة صورت (ج، و)، على التوالي. (ز) مقارنة التعبير Foxp3 في خلايا تي التنظيمية معزولة عن المكتب الصحفي لتحريكها وأوناجيتاتيد دون الإدارة كولاجيناز هو مبين في الرسم البياني مؤامرة. (ح-ي) ذكر المكتب الصحفي جمعها من ماوس C57BL/6 6 أشهر-ويعاملون بتركيزات مختلفة من كولاجيناز الثاني: 25 ملغ في 25 مل الهضم ميكس، 15 ملغ في 25 مل الهضم مزيج أو لا كولاجيناز. يصور المؤامرات منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب التي تكشف عن آثار الهضم الأنزيمي في PP خلية الإنعاش والغلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 8: نموذج الجزيئي وسلسلة كاملة من الأحماض الأمينية CXCR5. (أ) سبعة-تمرير على غرار هيكل البروتين ترانسميمبراني من CXCR5. (ب) سلسلة كاملة من الأحماض الأمينية CXCR5 ويتجلى. تتم الإشارة إلى تسلسل مناطق خارج الخلية باللون الأحمر والأحماض الأمينية خارج الخلية مع روابط كيميائية حساسة كولاجيناز المفترض تظهر باللون الأصفر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1: موجز جسم. يتم الإشارة إلى تخفيف واستنساخ والاقتران فلوروتشرومي للأجسام المضادة ذات الصلة والأصباغ البقاء. تمييع الأمثل قد تختلف تبعاً للظروف التجريبية ونوعية الكثير من المنتج. استنساخ مترافق BV421 L138D7 الأولية في 01:20 إضعاف أظهرت قدرة الكشف عن CXCR5 قابلة للمقارنة مع 8 2 مترافق البيوتين استنساخ الساعة 01:50 إضعاف. ولذلك، يمكن استخدام L138D7 مترافق الابتدائية كبديل مترافق البيوتين 2 8 استنساخ.

الشكل 1 التكميلية (S1): بديل النابضة استراتيجيات للخلايا طفح و GC ب. (أ) يصور لمفاوية PP يعيش من 3 أشهر ماوس على خلفية C57BL/6. (ب-ج) هي بوابات الخلايا ب GC ك CD38– GL7+ (ب) وبي سي ال-6+ GL7 الخلايا+ ب (ج). (د-ه) خلايا طفح يصور ك PD-1مرحبا CXCR5+ (د) وكنظام ايكوس+CXCR5+ CD4 + "تي" الخلايا (ه). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

وأعلن لا تضارب في المصالح.