مقالة منهجية

مقايسة متحاور تضخيم (مصباح) بوساطة حلقة "التعرف السريع على" دراسة حيث

DOI:

10.3791/58502

⸱

أكتوبر 29, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Method Development and Analytics, Agroscope, 2Swiss Tropical and Public Health Institute, 3University of Basel, 4Swiss Federal Plant Protection Service, Federal Office for Agriculture, 5OptiGene Limited, 6Fera Science Limited, 7School of Natural and Environmental Sciences, Newcastle University, 8Department of Plants and Plant Products, Agroscope

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتقارير هذه الورقة البروتوكول المتعلق مقايسة التعرف سريع حيث دراسة تستند إلى تقنية التضخيم متحاور بوساطة حلقة (المصباح). البروتوكول يتطلب التدريب المختبري الحد الأدنى، ويمكن، لذلك، تنفيذ في الموقع عند نقاط الدخول للواردات النباتية مثل الموانئ والمطارات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الذبابة حيث دراسة (جيناديوس) هو الآفات الغازية ذات أهمية كبيرة، التي تؤثر على إنتاج محاصيل الخضر ونباتات الزينة في العديد من البلدان حول العالم. خسائر المحصول شديدة ناجمة عن التغذية المباشرة، والأهم من ذلك، أيضا انتقال أكثر من 100 من الفيروسات المسببة للأمراض النباتية الضارة. أما بالنسبة لغيرها من الآفات الدخيلة، يسهل زيادة التجارة الدولية تشتت حيث باء إلى المناطق الواقعة خارج نطاق الأصلي. عمليات تفتيش لمصنع استيراد المنتجات في نقاط الدخول مثل الموانئ والمطارات، ولذلك، تعتبر بمثابة تدبير من تدابير هامة لمنع. ومع ذلك، هذا السطر الأخير من الدفاع ضد الغزوات الآفات الوحيد الفعال إذا كانت أساليب التعرف السريع على عينات الحشرات المشبوهة متوفرة بسهولة. لأن التمايز المورفولوجي بين التنظيم حيث باء والأقارب دون مركز الحجر الصحي من الصعب على غير أخصائيو، مقايسة التعرف جزيئي سريع استناداً إلى (حلقة بوساطة التضخيم متحاور وقد تم تطوير تكنولوجيا مصباح). هذا النشر تقارير البروتوكول مفصلاً المقايسة رواية تصف سرعة استخراج الحمض النووي، والإعداد لرد فعل مصباح، فضلا عن تفسير في القراءة، مما يتيح تحديد العينات حيث (ب) خلال ساعة واحدة. مقارنة للبروتوكولات القائمة لكشف محددة ب-حيث يستهدف المتعايشة، الأسلوب المتقدمة الجامع حيث باء- الأنواع المعقدة في فحص واحد. وعلاوة على ذلك صمم المقايسة التي يجب أن يطبقها في الموقع مفتشي الصحة النباتية مع التدريب المختبري الحد الأدنى مباشرة في نقاط الدخول. التحقق من صحة شامل المضطلع بها في إطار المختبر والشروط في الموقع يوضح أن المقايسة مصباح المبلغ عنها أداة تحديد السريع وموثوق بها، وتحسين الإدارة حيث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الذبابة حيث دراسة (جيناديوس) هو مكافحة الآفات الحشرية الغازية التي تؤثر على العديد من المحاصيل الزراعية الهامة اقتصاديا بما في ذلك نباتات الزينة والخضروات والبقول الحبوب والقطن1،2. بجانب الأضرار الناشئة من خلال تغذية لحاء مباشرة، الأنواع هوموبتيران يضر بالنباتات غير مباشر بإفراز كميات كبيرة من المن على أسطح أوراق الشجر والفواكه، فضلا عن انتقال العديد من الفيروسات المسببة للأمراض النباتية1 , 3 , 4-الدراسات الوراثية الحديثة مقارنة تسلسل الحمض النووي من أوكسيديز ج الفسفرة الجينات المتقدرية 1 (المحيط الهندي) وكشفت أن (ب) حيث أنواع المعقدة من الأنواع مورفوكريبتيك 34 على الأقل3،4. عضوين الغازية للغاية ومدمرة داخل هذا المجمع، biotype ب القادمين من الشرق الأوسط والمنطقة "الآسيوية طفيفة"، فضلا عن biotype Q التي تنشأ من منطقة البحر الأبيض المتوسط، قد تم تفريق على الصعيد العالمي من خلال التجارة الدولية أنشطة مع المنتجات النباتية، لا سيما عن طريق نقل نباتات الزينة1،،من56. بسبب مركزها الآفات في جميع أنحاء العالم، "الاتحاد الدولي" "حفظ الطبيعة" و "الموارد الطبيعية" (IUCN) المذكورة حيث (ب) كواحدة من "100 في العالم أسوأ الأنواع الغريبة الغازية" وأعضاء الأنواع المعقدة هي الكائنات الخاضعة للتنظيم العديد من البلدان1،،من34.

في "الاتحاد الأوروبي" (EU)، (ب) حيث مدرجاً في 1AI الصحة النباتية التوجيه 2000/29/EC "المرفق" كما حظرت كائن الحجر صحي التي مقدمة من بلدان خارج الاتحاد الأوروبي ونشرها داخل الاتحاد الأوروبي4. أحد تدابير أساسية للوقاية ضد انتشار الكائنات الحجر الصحي هو تفتيش الشحنات النباتية عند نقاط الدخول (POEs) مثل المطارات والموانئ7،8. في الحالة يتم العثور على كائن الحجر صحي، يأخذ الوطنية النباتية حماية المنظمة (نبو) بتهمة العمل برفضها أو العلاج (بما في ذلك تدمير) ل شحن تنتشر فيها9. ومع ذلك، ضباط التفتيش الواردات غالباً ما لا تملك الخبرة التصنيفية للتعرف بدقة مجموعة واسعة من أنواع الآفات المرتبطة بالتجارة العالمية9. خاصة تحديد مراحل الحياة غير ناضجة (مثل البيض واليرقات) دون مفاتيح المورفولوجية متميزة من المستحيل تقريبا غير أخصائيو8،،من910. ونتيجة لذلك، لتمكين تنفيذ تدابير الحجر الصحي بأقل قدر من التأخير، هناك حاجة لتحديد الموقع البديل، السريع فحوصات9.

هو أسلوب مرشح وساطة حلقة متحاور تكنولوجيا الحمض النووي التضخيم (المصباح) التي ظهرت مؤخرا لتكون تقنية مناسبة للتعرف على النباتات مسببات الأمراض11،،من1213. مصباح محددة للغاية لأنه يستخدم الأسلوب على الأقل اثنين من أزواج التمهيدي الاعتراف بست مميزة الحمض النووي الهدف تسلسل14. بسبب النشاط التشرد حبلا الحمض النووي من بوليميريز الحمض النووي بتوقيت جنوب بريطانيا ، تتم ردود فعل مصباح تحت ظروف متحاور14. ومن ثم، على عكس التقليدية البلمرة المتسلسل (PCR)-استناداً إلى فحوصات هناك هو عدم الحاجة إلى13،cycler حرارية14. ميزة أخرى عبر فحوصات المستندة إلى PCR هي مرونته ضد مثبطات المحتملة في استخراج الحمض النووي، الالتفاف حول الحاجة لتنقية الحمض النووي خطوة13. بسبب البروتوكول بالسرعة والبساطة، حتى يمكن تنفيذ مصباح تحت ظروف في الموقع باستخدام جهاز محمول، بطارية مدفوعة في الوقت الحقيقي من الكشف عن جهاز8،15.

مقايسة مصباح صمم استجابة للطلب على طريقة التعرف سريع على الموقع حيث8. وكان الهدف الأسمى لوضع بروتوكول التي يمكن أن يقوم بها مفتشو الصحة النباتية مع التدريب المختبري محدودة. ولذلك، تعيين تركيز قوي على تحسين السرعة والبساطة في البروتوكول. بينما عموما وضعت الاختبارات التشخيصية الموجودة لتحديد المتعايشة واحدة أو عدة من حيث (ب)، مقايسة مصباح رواية يغطي كامل حيث باء- الأنواع المعقدة8،16،17 ،18. تم حل المشكلة تنوع وضوحاً الجينية ضمن الأصناف المعقدة باستخدام تركيبات من مجموعات مختلفة من التمهيدي والتطبيق للإشعال تتدهور8. تم تصميم الرواية حيث باء- مصباح الفحص في مثل هذه طريقة أن كبسولة تفجير استهداف جزء في نهاية 3 ' الجينات COI المتقدرية8. هذا الجين ويعرض هدفا مناسباً لفحوصات تشخيص الحيوان نظراً لأنها تؤوي المناطق المصانة ما يكفي لضمان حساسية التشخيصية لأنواع محددة، بينما تميز كافية بين ارتباطاً وثيقا الكائنات19، 20-وعلاوة على ذلك، كثيرا ما يستخدم الجين المحيط الهندي كعلامة الوراثية في الدراسات الوراثية السكانية وتسلسل توقيع في إجراء تحاليل الحمض النووي المتوازية، أسفر العديد إدخالات تسلسل الحمض النووي في قواعد البيانات المفتوحة المصدر مثل بنك الجينات وغامق21 ،22. بجانب متواليات COI متاحة للجمهور من حيث باء، تتابع لجنة المحيط الهندي من الأنواع ذات صلة وثيقة (اليوروكانثوس spp. [N = 2]، أسيريس اليوروتشيتون، دوجيسيي اليوروديكوس، دراسة spp. [N = 3]، Spp. أندروبوجونيس نيوماسكيليا، أكاسياي تيتراليوروديس، وترياليوروديس [N = 4]) أدرجت في تصميم التمهيدي من هذه الدراسة والمستخدمة لتقييم التشخيص حساسية وخصوصية في السيليكون8 .

نظراً لدقة الأسلوب، سرعته (< ح 1) وبساطة البروتوكول، ثبت الفحص أن تكون مناسبة للتطبيق في الموقع عند تنفيذها كجزء من إجراءات مراقبة الاستيراد في "بو السويسري"8.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد مختبرين قلوية حل استخراج الحمض النووي.
    1. إنتاج مخزون من القلوية الحل استخراج الحمض النووي باستخدام المياه الصف الجزيئية وتستكمل مع 600 ميكرون البوتاسيوم هيدروكسيد (KOH) و 2 ميكرومتر "كريسول الأحمر".
      تنبيه: كوه قاعدة قوية المذابة في الماء. تجنب الانسكابات، والجلد، والاتصال بالعين.
    2. الاستغناء عن 30 ميليلتر من قلوية حل استخراج الحمض النووي (أعد الخطوة 1.1.1) إلى 0.5 مل ميكروسينتريفوجي أنابيب وتخزين مختبرين في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدم الحل استخراج الحمض النووي الكوتيد خلال سنة واحدة.
  2. إعداد التحكم التضخيم إيجابية حيث باء (PAC).
    1. توليد أمبليكونس بكر الجزء الحمض النووي الهدف مصباح.
      ملاحظة: مقدمة إلى بكر المبادئ العامة والممارسات التي تمنحها لورينز23.
      1. توليف أو الحصول على أجهزة الإشعال C1-ي-2195 (-تجاتتتتتجتكاتككاجاجت 5 '-3') و TL2-N-3014 (5 '-تككاتجكاكتاتكتجككاتاتا-3) تضخيم جزء من الجينات COI المتقدرية24،25.
      2. قم بإعداد رد فعل بكر كما هو موضح في الجدول 1. استخدام استخراج الحمض النووي (راجع الخطوة 2، 1) العينة (ب) حيث المرجعية كقالب الحمض النووي.
        ملاحظة: بشكل اختياري، من الممكن استخراج حيث الحمض النووي لباك استخدام مجموعة أدوات تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      3. برنامج cycler حرارية استخدام الشروط التالية: 15 دقيقة عند 95 درجة مئوية؛ دورات 45 40 s عند 95 درجة مئوية، 15 s عند 45 درجة مئوية، تكثف أكثر من 60 ثانية إلى 60 درجة مئوية، 2 دقيقة في 72 درجة مئوية؛ 7 دقيقة عند 72 درجة مئوية؛ عقد في 4 درجات مئوية.
      4. تنظيف المنتج التضخيم PCR باستخدام مجموعة أدوات تنظيف PCR تجارية وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة والوتي المنتج النهائي في المياه الصف الجزيئية.
      5. استخدام أدوات تجارية مع صبغ إينتيركالاتينج الحمض النووي لقياس تركيز الحمض النووي المنتج التضخيم PCR وفقا لإرشادات الشركة المصنعة وتخفف بالماء الصف الجزيئية لتركيز 1 نانوغرام/ميليلتر. مخزن [بكر] تضخيم المخفف المنتج كحل باك الأسهم عند-20 درجة مئوية.
        ملاحظة: استخدم الحل باك الأسهم خلال سنة واحدة.
      6. تكملة الحل الأسهم باك (أعد الخطوة 1.2.1.5) مع 0.6 ميكرومتر كوه وتخفف بالماء الصف الجزيئية لتركيز من 5 × 10-3 نانوغرام/ميليلتر. تخزين المنتج في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: استخدم الوحدويين داخل ح 5 لإعداد الجاهزة للاستخدام حيث باء- مصباح مجموعات الموصوفة في الخطوة التالية.
  3. إعداد جاهزة للاستخدام حيث باء- مصباح كيت (بروتوكول لوحدات 20)
    1. استخدام مقص قطع شرائط مصباح 8-الأنبوبة إلى الشريطين مصباح 4-أنبوب.
    2. قم بتسمية هذه أنابيب الشرائط مصباح 4-أنبوب وفقا للمخطط المبين في الشكل 1.
    3. إعداد حيث باء- مصباح رد فعل mastermix (بروتوكول لردود الفعل 80).
      1. إضافة 1195.1 ميليلتر من مزيج جاهزة للاستخدام الرئيسي متحاور جسبسد (التي تحتوي على بوليميراز جسبسد، بيروفوسفاتاسي، سلفات المغنزيوم، deoxynucleotides، حبلا مزدوجة ربط الحمض النووي ملزم صبغ) و 717.4 ميليلتر من حيث باء- مصباح التمهيدي مزيج إلى 2 مل أنبوب ميكروسينتريفوجي. بإيجاز ودوامه ونبض أجهزة الطرد المركزي.
      2. الاستغناء عن 22.5 ميليلتر من مصباح حيث رد فعل mastermix (أعد الخطوة 1.3.3.1) في كل أنبوب 4-أنبوب المصباح شرائط (أعد الخطوة 1.3.1) ونبض أجهزة الطرد المركزي.
    4. نبض ودوامه حيث باء- "مصباح باك" (إعداد في الخطوة 1، 2) بسرعة والطرد المركزي. ثم إضافة 2.5 ميليلتر في أنبوب المسمى مع "باك" لكل قطاع مصباح 4-أنبوب (الشكل 1).
    5. إغلاق الأغطية ومخزن الجاهزة للاستخدام حيث باء- مصباح عدة وحدات في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدم لهم خلال سنة واحدة.

2. تحليل مصباح في الموقع

  1. استخراج الحمض النووي
    1. استخدام المسواك العقيمة لنقل العينات الحشرية إلى 0.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على 30 ميليلتر من حل استخراج الحمض النووي (أعد الخطوة 1.1.2).
      ملاحظة: تأكد من أن الحشرات مغمورة في الحل الاستخراج.
    2. احتضان هذه العينات لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية في ثيرموميكسير (300 لفة في الدقيقة). بإيجاز ودوامه ونبض أجهزة الطرد المركزي.
  2. (ب) حيث مصباح الفحص
    1. إعدادها في الخطوة 1، 3 طقم مصباح حيث باء- ذوبان الجليد جاهزة لاستخدام. الدوامة بسرعة ونبض أجهزة الطرد المركزي.
      ملاحظة: مع كل مجموعة، فمن الممكن أما لاختبار عينات مختلفة اثنين أو لتحليل استخراج الحمض النووي من عينة واحدة في مكررة.
    2. إضافة 2.5 ميكروليتر من عينة استخراج الحمض النووي (إعدادها في الخطوة 2، 1) في أنابيب المسماة "S1" و "S2" جاهزة للاستخدام حيث باء- مصباح كيت (الشكل 1).
    3. إضافة ميليلتر 2.5 نقية الحل استخراج الحمض النووي القلوية (أعدت في القسم 1-1) إلى الأنبوبة المسماة "بريدًا" لعنصر التحكم التضخيم السلبية (الشكل 1).
    4. الدوامة الجاهزة للاستخدام حيث باء- مصباح كيت بسرعة ونبض أجهزة الطرد المركزي.
    5. مصباح حيث (ب) إدراج الجاهزة للاستخدام ومجموعات في جهاز تحليل مصباح (مع قياس fluorescence في الوقت الحقيقي) أو منبرا بكر في الوقت الحقيقي وإجراء تحليل الحمض النووي تضخيم متحاور على 65 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
    6. قياس درجة حرارة ذوبان الحمض النووي منتجات التضخيم بتدفئة تصل إلى 98 درجة مئوية مع خطوة لاحقة تبريد (منحنى معدل 0.05 ° C/s) إلى 75 درجة مئوية، بينما قياس fluorescence في الوقت الحقيقي.
  3. مصباح المقايسة القراءة
    1. التحقق من صحة القراءة مصباح يدوياً كما يلي.
      1. إذا قيست إيضاحات مسهبة الحمض النووي للعينة، ومؤتمر الوحدويين الأفريقيين، وتم قياس أي تضخيم الحمض النووي لائتلاف البرنامج الجديد، وكانت درجة الحرارة انلينغ منتجات التضخيم بين 80.0 و 85.5 درجة مئوية، والنظر في نتائج مصباح إيجابية (الشكل 2).
      2. إذا لم يكن هناك أي تضخيم الحمض النووي للعينات (أي، أنابيب المسمى S1 و S2) لكن بالنسبة لمؤتمر الوحدويين الأفريقيين وبريدا ثم النظر في النتيجة مصباح السلبية (الشكل 2).
      3. إذا تم قياس تضخيم الحمض النووي للعينات، ولكن درجات الحرارة انلينغ منتجات التضخيم المقابلة كانت خارج \u2012 نطاق 80.0 85.5 درجة مئوية، أعطى باك أي تضخيم الحمض النووي، و/أو بريدًا قدم تضخيم الحمض النووي، والنظر في النتيجة مصباح صالح (الشكل 2).
    2. بشكل اختياري، التحقق من صحة القراءة مصباح باستخدام تطبيق التحقق من صحة مصباح (ملف تكميلي 1).
      1. تعريف الأنواع المستهدفة وتحديد عدد العينات المختبرة. انقر فوق الزر "إنشاء تقرير" .
      2. نقل القراءة (تضخيم الحمض النووي الصلب المنتج التضخيم درجة الحرارة، نعم/لا، نتائج باك وبريدا) من جهاز تحليل مصباح في الموقع أو من منصة PCR الوقت الحقيقي لحقول الإدخال المطابق لتطبيق التحقق من الصحة. يتم عرض نتيجة التحقق من الصحة فورا بعد إدخال البيانات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أثناء التحقق من الصحة للمقايسة مصباح حيث باء ، كانت العينات الحشرات التي اعترضت أثناء عملية مراقبة الواردات السويسرية العادية تحليل8. العينات نشأت من ثمانية بلدان مختلفة (جزر الكناري والجمهورية الدومينيكية، إسرائيل، وماليزيا، والمغرب، وسنغافورة، وتايلاند وفيتنام) وتعكس التنوع الوراثي باء-حيث وجدت في "المؤسسات الحكومية الأوروبية"8. وكانت جميع مصباح نتائج التحقق من صحة عبر الحمض النووي المتوازية8.

من مجموع 80 عينات تم تحليلها بمصباح، واعتبرت العينات 75 (93.8 في المائة) بشكل صحيح حيث باء (صحيح-إيجابيات)، اعتبرت العينات اثنين (2.5%) بشكل صحيح لا يجري حيث باء (صحيح-السلبيات)، وثلاث عينات (3.8%) واعتبرت خطأ لم يتم حيث باء (false-السلبيات) (الجدول 2)8. النتائج السلبية تصحيح نشأت من اثنين فابوراريوروم ترياليوروديس العينات، أنواع غير المقننة في المخاطر العالية الخلط حيث باء في المؤسسات الحكومية ل منتجات المصنع8. وبناء على هذه النتائج، تم حساب القياسات التالية من دقة التشخيص: اختبار خصوصية (معدل سالب صحيح)، 100%؛ اختبار الحساسية (معدل الإيجابية الحقيقية)، 96.2%؛ اختبار الكفاءة (النسبة المئوية لنتائج الاختبار الصحيح)،8من 96.3 في المائة (الجدول 2). عند تقييم حساسية تحليلية (حد الكشف)، تضخيم المقايسة حيث باء- مصباح بنجاح عينة الحمض النووي تضعف إلى 100 جي/ميليلتر عبر replicates التقنية الثلاثة (الجدول 3).

مجموعة فرعية من الاختبارات (N = 13) كان يؤديها مفتشو الصحة النباتية الجاهزة للاستخدام أطقم المصباح حيث باء- 8باستخدام ظروف موقعية في مطار زيوريخ السويسرية بو. عند الصليب-صادق في المختبر المرجعي، تم العثور على جميع النتائج من التجارب في الموقع أن يكون صحيحاً (اختبار الكفاءة = 100%)8. تقييم أداء الفحص مصباح في الموقع، كان متوسط الوقت للايجابية (وقت حتى نتائج إيجابية التي كانت متاحة) 38.4 ± 10.3 دقيقة (يعني ± الانحراف المعياري)8. كما يرد في الشكل 3 ألف وبمؤامرة تضخيم الحمض النووي ممثل والمشتقة انلينغ المقابلة من تحليل مصباح (ب) حيث أنجزت بموجب الشروط في الموقع. في هذا المثال، اعتبرت نموذج واحد واثنين بشكل صحيح (ب) حيث أشار إلى جانب تضخيم الحمض النووي بعد حوالي 30 دقيقة (الشكل 3A) جنبا إلى جنب مع درجات الحرارة المتوقعة انلينغ في حوالي 82 درجة مئوية (الشكل 3B).

figure-results-1
رقم 1: التصور إعداد تجريبية من جاهزة لاستخدام طقم مصباح حيث المبينة في البروتوكول. S1، عينة 1؛ S2، نموذج 2؛ باك، مراقبة التضخيم الإيجابية؛ بريدًا، مراقبة التضخيم السلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
رقم 2: مصباح القراءة التحقق من صحة المخطط. باك: التضخيم إيجابية التحكم؛ بريدًا: التضخيم السلبية السيطرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: الحمض النووي التضخيم مشتق الأرض (A) والصلب (ب) لإجراء تحليل مصباح (ب) حيث أنجزت بموجب الشروط في الموقع. وتم قياس fluorescence في وحدات الكثافة النسبية. الخط الأخضر، عينة 1؛ أورانج الخط، نموذج 2؛ الخط الأزرق، ومراقبة التضخيم السلبية (NAC)؛ خط أحمر، مراقبة التضخيم الإيجابية (PAC). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المكونالأسهم الأسفلتالرد النهائي الأسفلتوحدة التخزين في رد فعل
ميكس ماجستير بوليميريز بوليميراز2 xس 110 ميليلتر
التمهيدي C1-ي-219520 ميكرومتر0.4 ميكرومترميليلتر 0.4
التمهيدي TL2-N-301420 ميكرومتر0.4 ميكرومترميليلتر 0.4
المياه الصف الجزيئية--8.2 ميليلتر
قالب الحمض النووي--1 ميليلتر

الجدول 1: إعداد PCR mastermix رد فعل (ب) حيث مراقبة إيجابية التضخيم. مكونات والتركيزات المطلوبة لإعداد رد فعل PCR واحد. حجم رد الفعل النهائي 20 ميليلتر. التمهيدي متواليات ترد في 1.2.1.1.

NننNتنظيم الأسرةNTNNالجبهة الوطنيةسين (%)جمعية مهندسي البترول (%) EFF (%)
807502396.210096.3

الجدول 2: النتائج باء حيث مصباح فحص التحقق من الصحة- N، عدد من التحليلات؛ نن، عدد من النتائج الإيجابية الحقيقية؛ Nتنظيم الأسرة، عدد نتائج إيجابية كاذبة؛ NTN، عدد صحيح سالب النتائج؛ Nالجبهة الوطنية، عدد النتائج السلبية الكاذبة؛ سين، حساسية التشخيص؛ جمعية مهندسي البترول، تشخيص خصوصية، المؤسسة، اختبار الكفاءة.

جالحمض النووي (fg/ميليلتر)Nالعلاقات العامة TP (دقيقة)
(يعني ± التنمية المستدامة)		 TA (درجة مئوية)
(يعني ± التنمية المستدامة)
1 × 105 333.5 ± 2.981.3 ± 0.1
1 × 104 330.7 ± 1.181 ± 0.0
1 × 103 340.4 ± 3.981.1 ± 0.1
1 × 102 350.7 ± 1.6هو 81.1
1 × 101 0--
1 × 100 0--

الجدول 3: حساسية تحليلية (حد الكشف) (ب) حيث مصباح المقايسة. تم اختبار كل تمييع في تريبليكاتيس. جالحمض النووي، وتركيز الحمض النووي كل رد فعل؛ Nالعلاقات العامة، يتطابق عدد الإيجابية؛ Tف، ووقت حتى نتيجة إيجابية كانت متاحة؛ TA، الصلب درجة الحرارة؛ التنمية المستدامة، والانحراف المعياري.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على دقة تحديد الكائنات الحية الضارة المحتملة دون إبطاء الوقت يمثل أحد جوانب حاسمة لإدارة الآفات الأنواع9،،من1026. إضافة إلى كونه السريع، لاستيراد المنتجات النباتية، ينبغي أن يكون أسلوب تحديد الآفات مثالية بسيطة لأداء الموقع في8،POEs26. وتفيد هذه الورقة بروتوكول مقايسة مصباح رواية للتعرف السريع على حيث باء، كائن الحشرات الحجر صحي كثيرا ما اعترضت على الحدود الأوروبية (https://ec.europa.eu/food/sites/food/files/plant/docs/ph_biosec_europhyt تقرير _annual _2016.pdf).

وكان الأساس المنطقي وراء تطوير الاختبار التشخيصي لتصميم بروتوكولا سهلة المتابعة التي يمكن أن يؤديها مفتشو الصحة النباتية مع التدريب المختبري الحد الأدنى أثناء إجراء مراقبة استيراد مصنع. من أجل جعل الموقع اختبار سريعة وبسيطة بقدر الإمكان، البروتوكول ينقسم إلى جزأين، إعداد مجموعة أدوات جاهزة للاستخدام والأداء الفعلي للمقايسة مصباح. قد يتم في الجزء الأول في مختبر خارجي حيث يقوم مفتش الصحة النباتية يمكن استخراج الحمض النووي ومصباح الفحص في الموقع مع الخطوة بيبيتينج واحد فقط.

على الرغم من خطوة واحدة فقط، بيبيتينج كميات صغيرة من السائل قد يكون تحديا بالنسبة للمستخدمين الذين لديهم خبرة مختبر قليلاً أو لا. لمعالجة هذه المسألة، هو إضافة صبغة (كريسول الحمراء) في حل استخراج حيث المشغل يمكن تأكيد بصريا يتم نقل كمية صغيرة من الحمض النووي (أي 2.5 ميليلتر) بشكل صحيح إلى أنبوب كل منهما. تبسيط هام آخر من البروتوكول هو تطبيق التحقق من الصحة كما أنها تسهل على تفسير موثوق بها للقراءة مصباح (ملف تكميلي 1).

تم التحقق من الرواية حيث باء- مصباح الفحص تحت المختبر والشروط في الموقع عن طريق اختبار العينات الحشرية اعترضت خلال عملية مراقبة الواردات العادية لسويسرا8. وفي المجموع، حللت العينات 80 من ثلاث قارات أفريقيا، أوراسيا وأمريكا الشمالية، بمصباح. ثلاثة فقط (3.8 في المائة) من العينات 80، حددت خطأ (false-السلبيات)8. عند تحليل تسلسل الحمض النووي الهدف التمهيدي للعينات السلبية الكاذبة، اتضح أنها كانت جديدة haplotypes باء-حيث أنه لم يتم حتى الآن وصف8. بناء على هذه النتائج، تم مجموعة التمهيدي مصباح (ب) حيث تم التعديل والتحقق من صحة بنجاح إعادة8.

حد كبير واحد من أي أسلوب المستندة إلى تضخيم الحمض النووي بما في ذلك مصباح أنهم فقط تحديد المستهدف المحدد سلفا تسلسل الحمض النووي8،27. ولذلك معرفة شاملة للتنوع الوراثي في تسلسل الهدف التمهيدي أمر حاسم لضمان دقة التشخيص8،27. هذه المعلومات غير غالباً محدودة للغاية، لا سيما في حالة الآفات الأنواع8الناشئة حديثا. على الرغم من نادرة، هي النتائج السلبية الكاذبة الناجمة عن الطفرات في تسلسل الهدف المتوقع8. في حالة المقايسة مصباح حيث (ب) الحالية، حلاً لهذه المشكلة هو الجمع بين تقنية على أساس المتوازية الحمض النووي، استراتيجية تتحقق أثناء تنفيذ هذا الاختبار التشخيصي في مطار زيورخ بو8. هنا، تم إعادة تحليل جميع النتائج السلبية مصباح بالحمض النووي المتوازية في مختبر خارجي8. في حالة مصادفة haplotype الآفات رواية وصف لم، يمكن تعديل كبسولة تفجير مصباح باستخدام تسلسل الحمض النووي التي تم إنشاؤها في عملية المتوازية8. وبالتالي، يعوض الخسارة الناتجة من السرعة في حالة مصباح نتيجة سلبية لأقصى قدر من الدقة التشخيصية وتكفل في هذه العملية مرحلتين8.

هي تكاليف الإنشاء للمقايسة مصباح الحالية في بو 25,000 دولاراً تقريبا. مع تزايد عدد الاختبارات مصباح للآفات النباتية (مثل Erwinia amylovoraو dorée فلافيسسينسي سيتريكاربا جويجنارديا)، يظهر هذا استثمار مرة واحدة15مبررة13،، 28. ومع ذلك، يحتمل أن يمكن تعديل البروتوكول خفض هذه التكاليف أكثر من ذلك. على سبيل المثال، لاستخراج الحمض النووي يمكن استبدال خطوة عند 95 درجة مئوية خلاط الحرارية المستخدمة هنا بحمام مائي أقل تكلفة، أو بإجراء هذه الخطوة مباشرة في الجهاز مصباح الوقت الحقيقي. وعلاوة على ذلك، ربما يمكن استبدال الخطوات خلط في الدوامة بالتحريك يدوياً الأنابيب، وفي خطوة نقل الحمض النووي بيبيتور يمكن أن تحل محل الحلقات تلقيح معقمة.

التحسينات المستقبلية لسرعة تحديد الأنواع حيث باء ومكافحة الآفات بصورة عامة يمكن أن يكون تطبيق نهج التسلسل في الموقع تسمح إجراء تحاليل الحمض النووي المتوازية في المؤسسات الحكومية. نظام مرشح واعدة لمثل هذا تنفيذ هو تكنولوجيا التسلسل نانوبوري. والواقع أن التكنولوجيا قد مؤخرا نفذت بنجاح في مسعى المتوازية الحمض النووي في الموقع لتقييم التنوع البيولوجي للغابات المطيرة8،،من2930. يمكن استبدال نظام تحديد هوية المتوازية الحمض النووي في الموقع تماما الحاجة إلى تطوير اختبارات تشخيصية محددة الأهداف وعلى التحقق من الصحة. كما أنه يتيح جمع معلومات إضافية حول خصائص الآفات مثل جينات مقاومة مبيدات الآفات8. ومع ذلك، حتى التكنولوجيات تسلسل الرواية ستنفذ بشكل روتيني، مقايسة مصباح (ب) حيث يمثل سريع (< ح 1) وأسلوب تحديد دقيق.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكاتب مايكل أندرو هو أحد المساهمين أوبتيجيني المحدودة التي تنتج المواد الكاشفة، والأدوات المستخدمة في هذه المقالة. ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلفين الآخرين.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ممتنون أنيت جرينديلمير، درينوفاتش اوريليا، كورنيليا ستودير، دانيال فراي، رضوي إليزابيث، أوجينفوس ماركوس، سيرينا فونزون ومولر سفين للمشاركة في التحقق من الصحة للمقايسة مصباح حيث .

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<م > ب. tabaci < / em> مزيج التمهيديLAMP OptiGene Ltd.عند الطلبلإعداد
للقراءة للاستخدام B. tabaci < / em>LAMP kit
الطرد المركزي MiniSpinEppendorf AG5452000010لعدة خطوات للطرد المركزي
Cresol red (صبغة حمراء)Sigma-Aldrich Corp.114472مكون من محلول استخراج الحمض النووي
Eppendorf ThermoMixerEppendorf AG5382000015لاستخراج الحمض النووي
Genie II (جهاز تحليل LAMP في الموقع)OptiGene Ltd.Genie® IIلتحليل LAMP
Genie (شرائط LAMP ذات 8 أنابيب) OptiGeneLtd.OP-0008-50لإعداد
للقراءة للاستخدام B. tabaci < / em>LAMP kit
HotStarTaq Master MixQiagen AG203443لتوليد التحكم في التضخيم الإيجابي
Labcycler (Thermocycler)SensoQuest GmbH ،
الموزعة بواسطة Witec AG		011-103لاستخراج الحمض النووي
GspSSD Lyse n 'Lamp متساوي الحرارة MastermixOptiGene Ltd.ISO-001LNLلإعداد
للقراءة للاستخدام B. طقم tabaci < / em>LAMP
طرد مركزي صغير Labnet PrismLabnet International Inc.C1801للعديد من خطوات الطرد المركزي
NucleoFast 96 PCRMarcherey-Nagel GmbH743500.4لتنظيف التحكم في التضخيم الإيجابي
محلول هيدروكسيد البوتاسيومSigma-Aldrich Corp.319376مكون من
محلول استخراج الحمض
النووي Qbit Fluorometer 3Thermo Fisher Scientific Corp.Q33226لقياس ارتباط الحمض النووي
للتحكم الإيجابي
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo Fisher ScientificQ32854لتنظيف التحكم في التضخيم الإيجابي
أنابيب القفل الآمن 0.5 مل (أنبوب الطرد المركزي الدقيق)Eppendorf AG0030 121.023لاستخراج الحمض
النووي أنابيب القفل الآمن 2.0 مل (أنبوب الطرد المركزي الدقيق)Eppendorf AG0030 120.094لتحضير
للقراءة للاستخدام B. tabaci LAMP kit
Wood ToothPickVWR International LLC470226-594لاستخراج الحمض
النووي Vortex-Genie 2 (Vortex)Industries Inc.SI-0236لعدة خطوات خلط
أجهزة شرائط جهاز Scientific

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annual Review of Entomology. 56, 1-19 (2011).
  2. Zhang, G. F., Lü, Z. C., Wan, F. H., Lövei, G. L. Real-time PCR quantification of Bemisia tabaci (Homoptera: Aleyrodidae) B-biotype remains in predator guts. Molecular Ecology Notes. 7 (6), 947-954 (2007).
  3. Boykin, L. M., De Barro, P. J. A practical guide to identifying members of the Bemisia tabaci species complex: and other morphologically identical species. Frontiers in Ecology and Evolution. 2, (2014).
  4. Cuthbertson, A. G. S., Vänninen, I. The importance of maintaining protected zone status against Bemisia tabaci. Insects. 6 (2), 432-441 (2015).
  5. Dalmon, A., Halkett, F., Granier, M., Delatte, H., Peterschmitt, M. Genetic structure of the invasive pest Bemisia tabaci: evidence of limited but persistent genetic differentiation in glasshouse populations. Heredity. 100 (3), 316-325 (2008).
  6. Dickey, A. M., Osborne, L. S., Shatters, R. G., Hall, P. A. M., Mckenzie, C. L. Population genetics of invasive Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) cryptic species in the United States based on microsatellite markers. Journal of Economic Entomology. 106 (3), 1355-1364 (2013).
  7. Bacon, S. J., Bacher, S., Aebi, A. Gaps in border controls are related to quarantine alien insect invasions in Europe. PLOS ONE. 7 (10), e47689(2012).
  8. Blaser, S., et al. From laboratory to point of entry: development and implementation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-based genetic identification system to prevent introduction of quarantine insect species. Pest Management Science. 74 (6), 1504-1512 (2018).
  9. Floyd, R., Lima, J., de Waard, J., Humble, L., Hanner, R. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests. Biological Invasions. 12 (9), 2947-2954 (2010).
  10. Armstrong, K. F., Ball, S. L. DNA barcodes for biosecurity: invasive species identification. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1462), 1813-1823 (2005).
  11. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research. 28 (12), E63(2000).
  12. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Dickinson, M. Development and evaluation of a one-hour DNA extraction and loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of phytoplasmas. Plant Pathology. 59 (3), 465-471 (2010).
  13. Kogovšek, P., et al. LAMP assay and rapid sample preparation method for on-site detection of flavescence dorée phytoplasma in grapevine. Plant Pathology. 64 (2), 286-296 (2015).
  14. Lee, M. S., Su, T. Y., Lien, Y. Y., Sheu, S. C. The development of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for the rapid authentication of five forbidden vegetables in strict vegetarian diets. Scientific Reports. 7, 44238(2017).
  15. Bühlmann, A., et al. Erwinia amylovora loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid pathogen detection and on-site diagnosis of fire blight. Journal of Microbiological Methods. 92 (3), 332-339 (2013).
  16. Cavalieri, V., Manglli, A., Tiberini, A., Tomassoli, L., Rapisarda, C. Rapid identification of Trialeurodes vaporariorum, Bemisia tabaci (MEAM1 and MED) and tomato-infecting criniviruses in whiteflies and in tomato leaves by real-time reverse transcription-PCR assay. Bulletin of Insectology. 67 (2), 219-225 (2014).
  17. Baek, J. H., Lee, H. J., Kim, Y. H., Lim, K. J., Lee, S. H., Kim, B. J. Development of an antibody-based diagnostic method for the identification of Bemisia tabaci biotype B. Pesticide Biochemistry and Physiology. 131, 18-23 (2016).
  18. Hsieh, C. H., Wang, H. Y., Chen, Y. F., Ko, C. C. Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics. Pest Management Science. 68 (8), 1206-1213 (2012).
  19. Rejili, M., et al. A PCR-based diagnostic assay for detecting DNA of the olive fruit fly, Bactrocera oleae, in the gut of soil-living arthropods. Bulletin of Entomological Research. 106 (5), 695-699 (2016).
  20. Hebert, P. D. N., Ratnasingham, S., deWaard, J. R. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proceedings. Biological Sciences. 270 (Suppl 1), 96-99 (2003).
  21. Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. bold: The Barcode of Life Data System (http://www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
  22. Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Bank Wheeler, D. L. G. en GenBank. Nucleic Acids Research. 33, D34-D38 (2005).
  23. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).
  24. Simon, C., Frati, F., Beckenbach, A., Crespi, B., Liu, H., Flook, P. Evolution, weighting, and phylogenetic utility of mitochondrial gene sequences and a compilation of conserved polymerase chain reaction primers. Annals of the Entomological Society of America. 87 (6), 651-701 (1994).
  25. Simon, C., Buckley, T. R., Frati, F., Stewart, J. B., Beckenbach, A. T. Incorporating molecular evolution into phylogenetic analysis, and a new compilation of conserved polymerase chain reaction primers for animal mitochondrial DNA. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 37 (1), 545-579 (2006).
  26. Harper, S. J., Ward, L. I., Clover, G. R. G. Development of LAMP and real-time PCR methods for the rapid detection of Xylella fastidiosa for quarantine and field applications. Phytopathology. 100 (12), 1282-1288 (2010).
  27. Lauri, A., Mariani, P. O. Potentials and limitations of molecular diagnostic methods in food safety. Genes & Nutrition. 4 (1), 1-12 (2009).
  28. Tomlinson, J. A., et al. A loop-mediated isothermal amplification-based method for confirmation of Guignardia citricarpa in citrus black spot lesions. European Journal of Plant Pathology. 136 (2), 217-224 (2013).
  29. Branton, D., et al. The potential and challenges of nanopore sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1146-1153 (2008).
  30. Pomerantz, A., et al. Real-time DNA barcoding in a rainforest using nanopore sequencing: opportunities for rapid biodiversity assessments and local capacity building. GigaScience. 7 (4), giy033(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LAMP

مقالات ذات صلة