مقالة منهجية

نموذج الجنين الزرد بالتصور فيفو و المرتبطة "تحليل إينترافيتال لمادة بيولوجية" المكوّرات العنقودية الذهبية العدوى

DOI:

10.3791/58523

⸱

يناير 7, 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Microbiology, Amsterdam UMC, 2Technical Medical Center, Department of Biomaterials Science and Technology, University of Twente, 3Department of Biomedical Engineering, W.J. Kolff Institute, University Medical Center Groningen, University of Groningen, 4Institute of Biology, Leiden University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة نموذجا جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية على مر الزمن استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. هذا النموذج نظام واعدة لاستكمال نماذج الحيوانات الثديية مثل الماوس نماذج لدراسة الأمراض المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) أحد أسباب رئيسية لفشل الأجهزة الطبية الحيوية. المكوّرات العنقودية الذهبية إحدى المسببات الرئيسية في بأي. النماذج الحالية تجريبية بأي الحيوانات الثديية مثل نماذج الماوس مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً، وذلك غير مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. وهكذا، الرواية نماذج حيوانية كنظم متكاملة للتحقيق بأي المجراة في المرغوب فيها. في هذه الدراسة، نحن تهدف إلى تطوير نموذج جنين الزرد المجراة في التصور والتحليل إينترافيتال للعدوى البكتيرية حضور الحيوية استناداً إلى الفحص المجهري الأسفار. وبالإضافة إلى ذلك، تدرس استجابة بلعم استفزاز. وتحقيقا لهذه الغاية، استخدمنا الفلورسنت معربا عن البروتين المذهبة س. والأجنة المعدلة وراثيا الزرد معربا عن البروتينات الفلورية في الضامة بهم ووضع إجراء لحقن البكتيريا وحدها أو بالاشتراك مع الجزئي المجالات الخرز الصغير في العضلات أنسجة الأجنة. لرصد تطور العدوى البكتيرية في الأجنة الحية على مر الزمن، ونحن استنباط طريقة بسيطة ولكنها موثوقة التهديف مجهرية للبكتيريا الفلورسنت. وأظهرت النتائج من التهديف مجهرية أن جميع الأجنة مع الوحدات المكونة للمستعمرة أكثر من 20 (زيمبابوي) من البكتيريا أسفرت عن إشارة إيجابية فلورسنت من البكتيريا. لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى، حددنا الأرقام زيمبابوي في المذهبة س. مع أو بدون 10 ميكرون البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير (PS10) كنموذج الحيوية في الأجنة. وعلاوة على ذلك، قمنا باستخدام ملف المشروع أوبجيكتج "الزرد-إيمونوتيست" العاملة في إيماجيج لقياس كثافة الأسفار من عدوى المكوّرات س. مع أو بدون ملاحظة:10 مع مرور الوقت. وأظهرت النتائج من كلا الأسلوبين أعلى الأرقام في المذهبة س. في الأجنة المصابة مع الجزئي المجالات الخرز الصغير مما في الأجنة دون الجزئي المجالات الخرز الصغير، مما يدل قابلية إصابة بزيادة حضور مادة بيولوجية. وهكذا، يظهر هذه الدراسة إمكانيات النموذجي الجنين الزرد للدراسة بأي مع الأساليب المتقدمة هنا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتزايد استخدام مجموعة متنوعة من الأجهزة الطبية (يشار إليها على أنها "الحيوية") في الطب الحديث لاستعادة أو استبدال أجزاء جسم الإنسان1. ومع ذلك، عند غرس الحيوية مريض للعدوى، دعا عدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي)، ومضاعفات رئيسية ليزرع في الجراحة. المكوّرات العنقودية الذهبية و المكوّرات العنقودية ابيديرميديس هي الأنواع البكتيرية الأكثر انتشارا هما مسؤولة بأي2،،من34،،من56. مزروع النموذج الحيوية على سطح عرضه لتشكيل بيوفيلم الجرثومي. وعلاوة على ذلك، قد تكون مختل الاستجابة المناعية المحلية بالحيوية مزروع، مما تسبب في انخفاض فعالية إزالة البكتيريا. الموافقة الأولية على إصابة البكتيريا يقوم أساسا بتسلل العَدلات، التي بشدة انخفاض قدرة جراثيم حضور المدرج أو مزروع مادة بيولوجية7. وعلاوة على ذلك، الضامة التسلل إلى الأنسجة بعد تدفق العَدلات الأولى سوف phagocytose البكتيريا المتبقية ولكن لا يمكن فعلياً قتلهم إينتراسيلولارلي، بسبب المناعة مختل مما يشير إلى أنه نتيجة لوجود مجتمعة مادة بيولوجية والبكتيريا8. وهكذا، يمكن تيسير وجود الحيوية البقاء داخل الخلايا للبكتيريا9،10،11،،من1213 وبيوفيلم تشكيل على مزروع الحيوية4،14. ونتيجة لذلك، قد تؤدي إلى الفشل بأي والحاجة إلى استبدال مزروع الحيوية، مما تسبب في زيادة معدلات الاعتلال والوفيات والاستشفاء المطول مع التكاليف الإضافية2،15.

ويجري عدد متزايد من استراتيجيات مكافحة--بأي المتقدمة2،،من1617. المجراة في تقييم فعالية هذه الاستراتيجيات في نماذج حيوانية ذات الصلة أمر ضروري. ومع ذلك، التقليدية التجريبية بأي نماذج حيوانية (مثل، الماوس نماذج) عادة ما تكون مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً لذلك غير مناسب لاختبار الإنتاجية العالية من استراتيجيات متعددة18. التطورات الأخيرة في تقنيات التصوير الضوئية الحيوية استناداً إلى طرحه/فلوري تسمية الخلايا المضيفة والبكتيريا قد يسمح للرصد المستمر للتفاعلات بأي تطور والمضيف الممرض/المضيف-المواد في الحيوانات الصغيرة واحدة مثل الفئران18،19،،من2021. ومع ذلك، هذا الأسلوب معقد نسبيا ولا تزال في مهدها، ويجب معالجة عدة قضايا للتحليل الكمي بأي18. على سبيل المثال، مطلوب بجرعة عالية من تحدي لتصور الاستعمار الجرثومي. وبالإضافة إلى ذلك، على ضوء التشتت والامتزاز إشارات الإضاءة الحيوية/الأسفار في أنسجة الثدييات اختبار الحيوانات كما يجب تناول18،،من1921. ولذلك، هي نماذج حيوانية مبتكرة، وفعالة من حيث التكلفة مما يسمح للتصور إينترافيتال والتحليل الكمي على مر الزمن قيمة النظم التكميلية للدراسة المجراة في بأي.

وقد استخدمت الزرد (الأجنة) كأداة في الحية تنوعاً لتشريح التفاعلات المضيف-مسببات المرض والإصابة المرضية للعديد من الأنواع البكتيرية مثل المتفطرة22،23من الزائفة الزّنجاريّة، الإشريكيّة القولونية26،24و العنقوديات البرازية faecalis2527. وقد أجنة الزرد العديد من المزايا مثل الشفافية الضوئية، وتكلفة الصيانة منخفضة نسبيا، وحيازة نظام المناعة عالية مماثلة لتلك في الثدييات28،29. وهذا يجعل الأجنة الزرد كائن نموذج الغاية الاقتصادية والمعيشية للتصور إينترافيتال وتحليل تطور العدوى والمضيف المقترنة الردود28،29. للسماح لتصور سلوك الخلية خطوط الزرد في الحية، ومحوره وراثيا مع أنواع مختلفة من الخلايا المناعية (مثل الضامة، والعدلات) وحتى مع المعلمة فلوريسسينتلي الهياكل سوبسيلولار وقد وضعت28 ،29. وبالإضافة إلى ذلك، يوفر معدل الإنجاب عالية الزرد إمكانية تطوير نظم اختبار إنتاجية عالية يتميز الحقن الآلية المؤتمتة والأسفار الآلي الكمي و تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل27، 30.

في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى وضع نموذج الزرد جنين للعدوى المرتبطة بمادة بيولوجية باستخدام تقنيات التصوير الأسفار. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير إجراء لحقن البكتيريا (S. aureus) حضور مادة بيولوجية الجزئي المجالات الخرز الصغير الأنسجة العضلية الزرد الأجنة. كنا المذهبة س. RN4220 وإذ تعرب عن مشري الفلورسنت البروتين (S. aureus-مشري)، الذي شيد كما هو موضح في مكان آخر لآخر10،سلالة المذهبة س. 31. السطر الزرد المحورة وراثيا (mpeg1: UAS/كايد) معربا عن كايد واستخدمت بروتين فلوري أخضر في الضامة32 والأزرق الفلورسنت البوليستيرين الجزئي المجالات الخرز الصغير. في دراسة سابقة، وقد أظهرنا أن ضخ العضلي الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة الزرد لتقليد غرس مادة بيولوجية هي عمليا33. لتحليل كمي التقدم بأي وتسلل خلية مرتبطة في الأجنة واحد مع مرور الوقت، كنا ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست" الذي يجري تشغيله في "أوبجيكتج" (المكونات في إيماجيج) لقياس كثافة الأسفار البكتيريا المقيمين والضامة التسلل إلى محيط موقع الحقن الجزئي المجالات الخرز الصغير33. وباﻹضافة إلى ذلك، عقدنا العزم الأرقام لتشكيل مستعمرة وحدات (زيمبابوي) من البكتيريا في الوجود والغياب الجزئي المجالات الخرز الصغير في الأجنة لدراسة الآثار المحتملة للمواد الحيوية على العدوى. لدينا هذه الدراسة يتبين أن الجنين الزرد مع الأساليب المتقدمة هنا، نموذج حيوانات الفقارية واعدة، ورواية لدراسة الإصابات المرتبطة بمادة بيولوجية المجراة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، وصيانة الزرد الكبار امتثالا للوائح المحلية الرفق بالحيوان كما أقرته اللجنة المحلية الرفق بالحيوان. وأجريت تجارب على الأجنة وفقا لتوجيهات 2010/63/الاتحاد الأوروبي.

1-إعداد "البكتيريا فقط" وتعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير

ملاحظة: يتم استخدام سلالة RN4220 S. aureus معربا عن البروتين الفلورسنت مشري (S. aureus-مشري). سلالة RN4220 في المذهبة س. هو تحور في أغرا (منظم الجينات الملحق A) منظم الجينات الفوعة34، وذلك قد فوعة منخفضة نسبيا في الطراز الجنين الزرد. ويمكن استخدام سلالات المكوّرات س. الأخرى أو غيرها من الأنواع البكتيرية لأي.

  1. يأخذ 4 إلى 5 مستعمرات من البكتيريا المكوّرات س. RN4220 من فول الصويا تريبتيك أجار الثقافة لوحات تستكمل مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول والثقافة البكتيريا إلى مرحلة النمو منتصف لوغاريتمي في 10 مل مرق الصويا تريبتيك تكملة مع 10 ميكروغرام/مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية تحت تهتز.
    1. خلال الثقافة، وتمييع 100 ميليلتر من تعليق البكتيرية في 900 ميليلتر من الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) في ومبومو (عرض 1 سم) لقياس كثافة بصرية (OD) في 620 نانومتر (OD620). الثقافة البكتيريا حتى OD620 يصل إلى 0.4 – 0.8.
      ملاحظة: عموما يناظر التطوير التنظيمي620 من 0.1 3.0 x 107 زيمبابوي/مل س المذهبة. OD620 من العدوى البكتيريا في منتصف مرحلة النمو لوغاريتمي ما بين 0.4 0.8. قد يلزم فترات زمنية مختلفة لاستزراع أنواع وسلالات من البكتيريا الأخرى.
  2. إعادة وقف البكتيريا الأعلاف في 1 مل PBS العقيمة والطرد المركزي البكتيريا في س 3,500 ز لمدة 10 دقائق. بعد ذلك يغسل البكتيريا مع أوقات PBS 2 العقيمة، وأخيراً إعادة تعليق البكتيريا في 1.1 مل محلول40 (40من حماية الأصناف النباتية) بوفيدون 4% (w/v) في برنامج تلفزيوني.
  3. دوامة هذا التعليق البكتيرية وتمييع ميليلتر 100 تعليق في 900 ميليلتر من PBS العقيمة في ومبومو لقياس620 OD. ضبط تركيز تعليق البكتيرية مع الحل40 حماية الأصناف النباتية. وهذا تعليق "للبكتيريا فقط".
  4. ويمكن اختيار الحيوية بحرية لخلط مع تعليق البكتيرية. وتستخدم في هذه الدراسة، الجزئي المجالات التجارية البوليستيرين (PS) الخرز الصغير (الفلورية الزرقاء، 10 ميكرومتر). لإنشاء تعليق بكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير، الطرد المركزي الجزئي المجالات الخرز الصغير لمدة 1 دقيقة في 1,000 ز x، درجة حرارة الغرفة، وتجاهل المادة طافية وإعادة تعليق الجزئي في المجالات الخرز الصغير في تعليق "للبكتيريا فقط" (في حماية الأصناف النباتية40 الحل).
  5. من أجل حقن جرعات متساوية تقريبا من البكتيريا في الوجود وفي غياب الجزئي المجالات الخرز الصغير، تركيز التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا يجب أن يكون ثلثا تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" (بدون الجزئي المجالات الخرز الصغير). ويتحقق ذلك بتمييع تعليق البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بحجم 0.5 من حل40 حماية الأصناف النباتية. مزيج أن الإيقاف قبل فورتيكسينج. من المذكرة، هذه النسبة (ثلثي) قد جرى تقييم المذهبة س. كما أنها مناسبة ابيديرميديس س.، ولكن ينصح بالتحقق من ما إذا كانت هذه النسبة ينطبق أيضا على غيرها من الأنواع البكتيرية والأحجام (من 10 ميكرون) أو الأشكال الحيوية (من الجزئي المجالات الخرز الصغير) بالحقن.
  6. فحص تركيز تعليق "للبكتيريا فقط" والبكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير بثقافة الكمية لتخفيف المسلسل إذ وصفها أدناه: نقل 100 ميليلتر من المعلقات إلى 96 لوحة جيدا وتمييع متسلسل بنقل 10 ميليلتر مختبرين تعليق إلى 90 ميليلتر من PBS العقيمة. لوحة مختبرين ميليلتر 10 مكرر من المعلقات غير مخفف والمخفف على ألواح [اغروس]، واحتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها، عد المستعمرات وحساب أرقام البكتيريا (الوحدات المكونة للمستعمرة. زيمبابوي).

2-تربية، الحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد

  1. اتبع الإجراءات العامة وصف سابق35،36 لتربية والحصاد، والحفاظ على الأجنة الزرد، مع إدخال التعديلات المبينة أدناه. عبر أسرة من نوع البرية توفيل زعنفة طويلة (TL) الزرد أو الزرد للسطر المحدد وراثيا (هنا، Mpeg1: كايد) في دبابة مع صافي إضافة إلى حمل الإناث البالغات لإنتاج البيض بعد يضيء الضوء، ثم فصل البالغين من البيض المنتجة.
  2. جمع الأجنة في اليوم التالي، وتجاهل تلك غير الشفافة التي لا تكون قابلة للتطبيق. تبقى حوالي 60 أجنة كل طبق بتري (100 ملم في القطر) في E3 المتوسطة37 واحتضان عند 28 درجة مئوية. إزالة أجنة ميتة وغير طبيعي، وتحديث المتوسطة E3 يوميا.

3-التحضير للحقن بالإبر

  1. تعد الإبر ميكروكابيلاري الزجاج للحقن باستخدام أداة ساحبة ميكروبيبيتي. استخدم الإعدادات التالية: الحرارة: 772، سحب: حطي 100،: 200، الوقت: الغاز 40،: 75.
  2. كسر طرف إبرة مع الملقط في موضع الإبرة فيها قطر خارجي لما يقرب من 20 ميكرومتر (عن 10 ميكرون الجزئي المجالات الخرز الصغير)، استخدام مجهر خفيفة مع شريط مقياس في العين. تجنب الإبر مع حجم فتحه كبيرة جداً، كما أنها سوف تهدد بقاء الأجنة.
    ملاحظة: ويمكن اختيار فتح يكون أصغر أو أكبر، تبعاً لحجم وشكل الحيوية بالحقن. في الأدب، أبلغ الحقن باستخدام الإبر مع فتح من حوالي 50 ميكرومتر يسبب انخفاضا كبيرا في بقاء الجنين38.

4-حقن "البكتيريا فقط" أو التعليق الجزئي المجالات الخرز الصغير-البكتيريا في الأجنة الزرد

  1. حرارة [اغروس] حل (1 – 1.5% (wt) في المياه ديمي) باستخدام فرن ميكروويف وتصب في طبق بتري 100 ملم. ضع قالب بلاستيكية العفن على رأس الحل [اغروس] في طبق بتري لإنشاء المسافات البادئة في [اغروس] لوضع الأجنة في المواقف المناسبة، تسهيل الحقن. احتضان في درجة حرارة الغرفة وإزالة العفن عندما قد وطدت الحل [اغروس].
  2. في 3 د بعد الإخصاب، وضع الأجنة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على 0.02% (w/v) حمض 3-امينوبنزويك (تريكيني) تخدير لهم. بعد 5 دقائق، نقل الأجنة إلى اللوحة [اغروس] مضافين مع E3 المتوسطة التي تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني ومواءمتها في اتجاه واحد للحقن. Mpeg1: خط المعدلة وراثيا كايد أولاً تخدير الأجنة في E3 المتوسطة تحتوي على 0.02% (w/v) تريكيني. ثم حدد الأجنة معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء باستخدام مجهر الأسفار ستيريو.
  3. تحميل الإبرة مع حوالي 10 ميليلتر من تعليق "للبكتيريا فقط" أو البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير باستخدام تلميح ماصة ميكرولوادير. جبل الإبرة على ميكرومانيبولاتور متصلاً مايكرو-الحاقن. لتستخدم محقن هنا (انظر الجدول للمواد)، استخدام الإعدادات التالية لحقن nL 2 – 3: الضغط: الضغط الخلفي 300 – 350،: 0, الوقت: 2 مللي ثانية.
    ملاحظة: تعتمد إعدادات مايكرو-الحاقن على محقن المستخدمة. إعدادات حاقن قد تحتاج إلى تعديل لحقن البكتيريا مختلطة مع الحيوية مع أحجام أو أشكال أخرى.
    1. استخدام الإبر مع فتح نفسه لحقن تعليق "للبكتيريا فقط" ووقف البكتيريا-الجزئي المجالات الخرز الصغير. إذا كان الإبرة مكسورة أو انسداد، دائماً تغيير إبرة جديدة لمزيد من الحقن.
  4. إدراج الإبرة في النسيج العضلي للأجنة تحت مجهر خفيفة (الشكل 1)، بزاوية من 45-60 درجة مئوية بين الإبرة والجسم للأجنة. ضبط موضع الإبرة في الأنسجة بلطف أنها تتحرك جيئة وذهابا. حقن الأجنة باستخدام دواسة قدم متصلاً مايكرو-الحاقن.
  5. بعد حقن البكتيريا الفلورسنت، نقاط الأجنة لعدوى ناجحة تحت مجهر fluorescence ستيريو. تجاهل السلبية الأجنة وسجل (لا البكتيريا الفلورسنت مرئية أو لا تظهر الجزئي الفلورسنت المجالات الخرز الصغير). الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.

5. سحق الأجنة والتهديف المجهرية، والثقافة كمية من البكتيريا

  1. نقاط جميع أجنة مجهريا لوجود البكتيريا الفلورية استخدام مجهر الأسفار ستيريو، البدء فورا بعد الحقن، وفي كل يوم بعد ذلك حتى الأجنة يتم اختيارها عشوائياً للثقافة الكمية.
  2. عشوائياً تحديد الأجنة المصابة حية قليلة (5 إلى 6 في هذه الدراسة) بعد الحقن بوقت قصير ونقلها على حدة إلى microtubes مل 2 منفصلة باستخدام النصائح العقيمة. إزالة المتوسطة وتغسل الأجنة بلطف مع PBS العقيمة مرة واحدة وإضافة 100 ميليلتر من PBS العقيمة.
  3. إضافة الخرز الزركونيا العقيمة 2 – 3 (قطرها 2 ملم) لكل قنينة وسحق الأجنة في الخالطون باستخدام (انظر الجدول للمواد) 3,500 لفة في الدقيقة لمدة 30 س. الثقافة هوموجيناتي كيفا وكما هو موضح في الخطوة 1، 3.
    ملاحظة: الخالطون أخرى قد تتطلب إعدادات مختلفة.
  4. عشوائياً اختيار أجنة متعددة في الأيام اللاحقة بعد الحقن لثقافة الكمية وفقا للخطوة 5.3.

6-الأسفار مجهرية من تطور الإصابة وتسلل خلية استفزاز في الأجنة الزرد

  1. تخدير الأجنة كما هو موضح في الخطوة 4، 2. "الماصة؛" 500 ميليلتر حل السليلوز الميثيل PBS-2% (wt) في طبق بتري يحتوي على المتوسطة E3 مع 0.02% (w/v) تريكيني. وضع الأجنة في الحل الميثيل السليلوز وإبقائها مستقيمة وأفقية.
    ملاحظة: يستخدم الميثيل السليلوز الحل "غراء"، الذي سبب لها اللزوجة، يمكن مؤقتاً تجميد الأجنة في اتجاه أفضل للتصوير.
  2. استخدام مجهر الأسفار ستيريو مزودة بمرشحات للأجنة الصورة الفردية ضمن إعدادات الأمثل مماثلة (مثل، كثافة والكسب، والتعرض الوقت) في التكبير 160 x ميدان مشرق، مشري، والبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل)، والأشعة فوق البنفسجية . قم بتعيين المستوى البؤري مثل الأنسجة الأضرار الناجمة عن الحقن في التركيز، باستخدام عامل التصفية حقل مشرق. تعيين عمق المكدس Z بحجم 10 ميكرون، وخطوة في 5 ميكرومتر، الذي يسمح بتسجيل الصور على التوالي 3.
  3. صورة فردية الأجنة مرة واحدة يوميا من الحقن بعد ح 5 حتى 3 أيام بعد الحقن. استبعاد أجنة ميتة (لا ضربات القلب أو الجنين جزئيا المتدهورة) لمواصلة التصوير والتحليل. الحفاظ على الأجنة على حدة في E3 المتوسطة في لوحات 48-جيدا. قم بتحديث في المتوسط يوميا.

7-التحليل الكمي لكثافة Fluorescence تطور العدوى وتسلل خلية تسبب استخدام كائن ي ملف المشروع "الزرد-إيمونوتيست"

  1. تحميل "الزرد-إيمونوتيست"، ودليل تفصيلي من الارتباط: < https://sils.fnwi.uva.nl/bcb/objectj/examples/zebrafish/MD/zebrafish-immunotest.htmL>، كما هو موضح في دراسة سابقة33. باختصار، فتح الصور للتحليل مع "الزرد-إيمونوتيست"، يعمل بموجب برنامج مجاني "صورة ج." في كل صورة تم تحميلها، يدوياً علامة الحقن استناداً إلى تلف الأنسجة الملحوظ للأجنة.
    ملاحظة: يستخدم الموقع ملحوظة "الزرد-إيمونوتيست" كنقطة المركز للكشف عن ذروة الأسفار على مسافة 50 ميكرومتر. ثم يتم استخدام ذروة fluorescence تم الكشف عنها كمركز لمنطقة موحدة (قطرها 100 ميكرومتر) لقياس الأسفار.
  2. انقر فوق "حساب" في القائمة "كائن ي" لتشغيل قياس الفلورسنت لقنوات متعددة، إذا كان ذلك ممكناً، لكل الصور تلقائياً. تصدير البيانات وتحليلها بطرق الاختبار الإحصائية المناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة تقييم مدى انطباق الزرد الأجنة كنموذج حيوانات الفقارية رواية للتحقيق في الإصابة المرتبطة بمادة بيولوجية. قد استخدمت تقنية microinjection عادة لمختلف أنواع الجراثيم بحقن الأجنة الزرد تسبب الإصابة22،،من2627،،من3036. استخدام الإجراء هو مبين في الشكل 1، س المذهبة وحدها أو بالاشتراك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العدوى المرتبطة بمادة بيولوجية (بأي) مضاعفات سريرية خطيرة. فهم أفضل للآلية المرضية بأي المجراة في أن يوفر رؤى جديدة لتحسين الوقاية والعلاج بأي. بيد أن الحالية تجريبية بأي نماذج حيوانية مثل نماذج مورين هي مكلفة وتتطلب عمالة مكثفة، وتتطلب تدريب العاملين المتخصصين في التقنيات الجراحية المعقدة. ولذلك، أن هذه النماذج ليست مناسبة لتحليل الإنتاجية العالية. نظراً لمتطلبات لالزرد الجنين النماذج أقل تعقيداً والتكاليف بشكل عام أقل من نماذج موريني، هذه الدراسة تقييم ما إذا كان يمكن استخدام الأجنة الزرد كنموذج حيوانات الفقارية رواية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة ماليا يدعمها المشروع إيبيزا البرنامج المواد الطبية الحيوية (بم) ويشترك في تمويله وزارة الشؤون الاقتصادية في هولندا. الكتاب يود أن يشكر الأستاذ الدكتور غراهام ليشكي من جامعة موناش، أستراليا لتوفير خط الزرد المحورة وراثيا (mpeg1:Gal4/UAS:Kaede).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجار الصويا التربتيBD Difco236950وحدة تحضير الوسائط في AMC
مرق الصويا TrypticBD Difco211825
Polyvinylpyrrolidone40ApplichemA2259.0250
10 & micro ؛ كريات البوليسترين المجهرية بقطر m (فلورسنت أزرق)تقنية الحياة/ThemoFisherF8829
زجاج صغير (1 مم OD × 0.78 مم معرف)جهاز هارفارد30-0038
أداة مجتذب الماصةالدقيقة Sutter Instrument IncFlaming p-97
مجهر ضوئي LM 20LeicaMDG33 10450123
3-aminobenzoic acid (Tricaine)Sigma-AldrichE10521-50G
Agarose MPRoche11388991001
مجهر فلورسنت ستيريو LM80LeicaMDG3610450126
MicroloaderEppendorf5242956.003
Micromanipulator M3301 مع حامل M10أدوات الدقة العالمية00-42-101-0000
FemtoJet Express الحاقنالصغير Eppendorf5248ZO100329
Microtrube 2 مل ppSarstedt72.693.005
حبات الزركونيابيو كونكت11079124ZX
MagNA LyserRoche41416401
ألواح MSA-2 (مانيتول ملح أجار -2)Biomerieux43671Chapmon 2 متوسط
ميثيل السليلوز 4000cpسيجما ألدريتشMO512-250G
كلورامفينيكولسيجما-ألدريتشC0378
شاكر جيروتوري (لنمو البكتيريا)نيو برونزويك العلميG10
حاضنة أسماك الزردVWRIncu-line
Cuvettesالعلامة التجارية759015
الطرد المركزيHettich-ZentrifugenROTANTA 460R
مطيافصيدلة التكنولوجيا الحيويةUltrospec & reg ؛ 2000
ملقطسيجما ألدريتشF6521-1EA
48 ألواح بئرGreiner bio-one677180
96 بئر لوحاتGreiner bio-one655161
طبق بتريFalcon353003
طبق بتريBiomerieuxNL-132
ImageJغير قابل للتطبيقالرابط: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
GraphPad 7.0Prismغير قابل للتطبيق
نصائح ماصة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Williams, D. F. On the nature of biomaterials. Biomaterials. 30, 5897-5909 (2009).
  2. Busscher, H. J., et al. Biomaterial-Associated Infection: Locating the Finish Line in the Race for the Surface. Science Translational Medicine. 4, 153rv10(2012).
  3. Otto, M. Staphylococcus epidermidis - the 'accidental' pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7, 555-567 (2009).
  4. Moriarty, T. F., et al. Orthopaedic device-related infection: current and future interventions for improved prevention and treatment. EFORT Open Reviews. 1, 89-99 (2016).
  5. Campoccia, D., Montanaro, L., Arciola, C. R. The significance of infection related to orthopedic devices and issues of antibiotic resistance. Biomaterials. 27, 2331-2339 (2006).
  6. Schierholz, J. M., Beuth, J. Implant infections: a haven for opportunistic bacteria. Journal of Hospital Infection. 49, 87-93 (2001).
  7. Zimmerli, W., Lew, P. D., Waldvogel, F. A. Pathogenesis of foreign body infection. Evidence for a local granulocyte defect. Journal of Clinical Investigation. 73 (4), 1191-1200 (1984).
  8. Boelens, J. J., et al. Biomaterial-associated persistence of Streptococcus epidermidis in pericatheter macrophages. Journal of Infectious Diseases. 181 (4), 1337-1349 (2000).
  9. Broekhuizen, C. A. N., et al. Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection. Critical Care Medicine. 36, 2395-2402 (2008).
  10. Riool, M., et al. Staphylococcus epidermidis originating from titanium implants infects surrounding tissue and immune cells. Acta Biomaterial. 10, 5202-5212 (2014).
  11. Zaat, S. A. J., Broekhuizen, C. A. N., Riool, M. Host tissue as a niche for biomaterial-associated infection. Future Microbiology. 5, 1149-1151 (2010).
  12. Broekhuizen, C. A. N., et al. Staphylococcus epidermidis is cleared from biomaterial implants but persists in peri-implant tissue in mice despite rifampicin/vancomycin treatment. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 85, 498-505 (2008).
  13. Broekhuizen, C. A. N., et al. Peri-implant tissue is an important niche for Staphylococcus epidermidis in experimental biomaterial-associated infection in mice. Infection and Immunity. 75, 1129-1136 (2007).
  14. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Seminars in Immunopathology. 33, 295-306 (2011).
  15. Darouiche, R. O. Current concepts - Treatment of infections associated with surgical implants. New England Journal of Medicine. 350, 1422-1429 (2004).
  16. Riool, M., de Breij, A., Drijfhout, J. W., Nibbering, P. H., Zaat, S. A. J. Antimicrobial peptides in biomedical device manufacturing. Frontiers in Chemistry. 5, 63(2017).
  17. Brooks, B. D., Brooks, A. E., Grainger, D. W. Antimicrobial medical devices in preclinical development and clinical use. Biomaterials Associated Infection. Moriaty, F. T., Zaat, S. A., Busscher, H. J. , Springer. New York, NY, USA. 307-354 (2013).
  18. Sjollema, J., et al. The potential for bio-optical imaging of biomaterial-associated infection in vivo. Biomaterials. 31, 1984-1995 (2010).
  19. Suri, S., et al. In vivo fluorescence imaging of biomaterial-associated inflammation and infection in a minimally invasive manner. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103, 76-83 (2015).
  20. Zhou, J., Hu, W. J., Tang, L. P. Non-invasive characterization of immune responses to biomedical implants. Annals of Biomedical Engineering. 44, 693-704 (2016).
  21. van Oosten, M., et al. Real-time in vivo imaging of invasive- and biomaterial-associated bacterial infections using fluorescently labelled vancomycin. Nature Communications. 4, 2584(2013).
  22. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion in Microbiology. 11, 277-283 (2008).
  23. Brannon, M. K., et al. Pseudomonas aeruginosa Type III secretion system interacts with phagocytes to modulate systemic infection of zebrafish embryos. Cellular Microbiology. 11, 755-768 (2009).
  24. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of zebrafish to probe the divergent virulence potentials and toxin requirements of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathogens. 5, e1000697(2009).
  25. Prajsnar, T. K., et al. Zebrafish as a novel vertebrate model to dissect enterococcal pathogenesis. Infection and Immunity. 81, 4271-4279 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus infection reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10, 2312-2325 (2008).
  27. Veneman, W. J., et al. A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC Genomics. 14, 255(2013).
  28. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease Model and Mechanism. 5, 38-47 (2012).
  29. Meijer, A. H., van der Vaart, M., Spaink, H. P. Real-time imaging and genetic dissection of host-microbe interactions in zebrafish. Cellular Microbiology. 16, 39-49 (2014).
  30. Spaink, H. P., et al. Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models. Methods. 62, 246-254 (2013).
  31. Riool, M., et al. A chlorhexidine-releasing epoxy-based coating on titanium implants prevents Staphylococcus aureus experimental biomaterial-associated infection. European Cells and Materials. 33, 143-157 (2017).
  32. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, E49-E56 (2011).
  33. Zhang, X., et al. The zebrafish embryo as a model to quantify early inflammatory cell responses to biomaterials. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 105, 2522-2532 (2017).
  34. Traber, K., Novick, R. A slipped-mispairing mutation in AgrA of laboratory strains and clinical isolates results in delayed activation of agr and failure to translate delta- and alpha-haemolysins. Molecular Microbiology. 59, 1519-1530 (2006).
  35. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  36. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. 61, 3781(2012).
  37. Brand, M., Granato, M., Christiane, N. -V. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish, A Practical Approach. Dahm, R., Nüsslein-Volhard, C. , Oxford University press. Oxford, UK. 7-37 (2002).
  38. Chaplin, W. T. P. Development of a microinjection platform for the examination of host-biomaterial interactions in zebrafish embryos. , Queen's University. Master thesis (2017).
  39. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 99, 12651-12656 (2002).
  40. Witherel, C. E., Gurevich, D., Collin, J. D., Martin, P., Spiller, K. L. Host-biomaterial interactions in zebrafish. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4, 1233-1240 (2018).
  41. Anderson, J. M. Biological responses to materials. Annual Review of Materials Research. 31, 81-110 (2001).
  42. Onuki, Y., Bhardwaj, U., Papadimitrakopoulos, F., Burgess, D. J. A review of the biocompatibility of implantable devices: current challenges to overcome foreign body response. Journal of Diabetes Science and Technology. 2, 1003-1015 (2008).
  43. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS One. 6, e16779(2011).
  44. Stockhammer, O. W., et al. Transcriptome analysis of Traf6 function in the innate immune response of zebrafish embryos. Molecular Immunology. 48, 179-190 (2010).
  45. Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3, 59(2007).
  46. Prajsnar, T. K., et al. A privileged intraphagocyte niche is responsible for disseminated infection of Staphylococcus aureus in a zebrafish model. Cellular Microbiology. 14, 1600-1619 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ObjectJ ImageJ

مقالات ذات صلة