مقالة منهجية

عزل جلوميرولي و في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي

DOI:

10.3791/58542

⸱

يناير 18, 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University, 2Institute of Cellular and Integrative Physiology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا بروتوكولا مورين في فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي مع البيوتين. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين الفائدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتينية ناتجة عن تعطيل عامل التصفية الكبيبي الذي يتكون البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس مع أغشية شق بهم. هيكل حساسة لتصفية الكبيبي، لا سيما الشق الحجاب الحاجز، يعتمد على التفاعل بين البروتينات السطحية الخلية المتنوعة. دراسة هذه الخلية البروتينات السطحية كانت حتى الآن محدودة للدراسات في المختبر أو تحليل النسجية. نقدم هنا، بيوتينيليشن مورين في فيفو وسم الأسلوب الذي يتيح دراسة الخلية الكبيبي البروتينات السطحية تحت الظروف الفسيولوجية وباثوفيسيولوجيك. هذا البروتوكول يتضمن معلومات عن كيفية نتخلل الكلي الماوس وعزل glomeruli وأداء إيمونوبريسيبيتيشن الذاتية من بروتين فائدة. كوانتيتيشن شبه خلية الكبيبي السطحية الوفرة متاحة بسهولة مع هذا الأسلوب الرواية، والوصول إلى نضح البيوتين جميع البروتينات ويمكن دراسة إيمونوبريسيبيتيشن. وباﻹضافة إلى ذلك، عزل glomeruli مع أو بدون بيوتينيليشن تمكن مزيد تحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي والبروتين، فضلا عن ثقافة الخلية الكبيبي الأولية (أي، بودوسيتي الرئيسية الخلية الثقافة).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيله هو السمة مميزة للإصابة الكبيبي، وعادة ما يصاحب اضطراب تصفية الكبيبي1. وتتألف التصفية الكبيبي البطانة فينيستراتيد والغشاء الكبيبي، وبودوسيتيس. التركيب الجزيئي الدقيق لتصفية الكبيبي درجة عالية من الديناميكية ورهنا بروتين سطح الخلية الاتجار في كلا الكليتين صحية والمريضة2،3،،من45،6 . ثبت الالتقام بروتينات السطحية خلية أساسية لبقاء بودوسيتيس7. نيفرين وبودوكاليكسين بالبروتينات ترانسميمبراني أعرب عن بودوسيتيس. نيفرين هو العمود الفقري للغشاء الكبيبي طولية، بينما بودوكاليكسين سيالوجليكوبروتين طلاء العمليات الثانوية سيرا على الأقدام من بودوسيتيس8،،من910. الاتجار اندوسيتيك سابقا وقد تبين نيفرين وبودوكاليكسين3،،من1112،،من1314.

على حد علمنا، الالتقام الخلية البروتينات السطحية قد لا بعد وصفت في خلايا بطانية الكبيبي في الأدب. ومع ذلك، عموما خلايا بطانية التعبير عن جميع البروتينات اللازمة لأنواع مختلفة من الالتقام (أي، تعتمد على كلاثرين، وتعتمد على طوف الالتقام)15،16. ولذلك، قد درس الاتجار بسطح الخلية البطانية بهذا الأسلوب باستخدام، على سبيل المثال، الأوعية الدموية غشائي (هاء)-كادهيرين وجزيء الالتصاق داخل الخلايا (ICAM-2) كخلية سطح البروتين علامة لخلايا بطانية الكبيبي17 .

ولسوء الحظ، ليس هناك دقيقة في المختبر نموذج لحساسة الطبقات الثلاث الكبيبي عامل التصفية في الخلية التي يمكن دراستها الاتجار بالبروتين السطحي. والهدف من هذا الأسلوب التالي لدراسة البروتين الكبيبي الاتجار في فيفو. وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن هذا البروتوكول معلومات عن كيفية عزل glomeruli، تمكين مزيد من التحليل الكبيبي الجيش الملكي النيبالي، والبروتينات، أو خلايا. عزل الكبيبي مماثلة قد وصفت التقنيات بمختلف المجموعات18،19.

سابقا، ونحن وآخرون قد استخدمت السابقين فيفو وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي بيوتينيليشن2،3،4،،من2021. ومع ذلك، في هذا الأسلوب السابقين فيفو ، تعرضت glomeruli معزولة للإجهاد الميكانيكي، والتي قد تؤثر على الاتجار اندوسيتيك. وبدلاً من ذلك، على نطاق واسع قد استخدم الفلورة وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي في الأدب2،،من2022. مع هذا الأسلوب، ومع ذلك، يمكن تحليلها إلا عدد قليل من البروتينات داخل شريحة واحدة، وكوانتيتيشن الصور الفلورة في كثير من الأحيان صعبة.

يوفر هذا الأسلوب الرواية في فيفو أداة موثوقة لدراسة الخلية الكبيبي البروتين السطحي وفرة والاتجار دقة في صحية ومريضة الكلي، ويمكن استخدامه كإضافة إلى اختبارات الفلورة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم الحصول على الفئران كسلالة داخلية من مرفق الرعاية الحيوانية المحلية أو من "مختبرات جانفييه" في فرنسا. التحقيقات التي أجريت وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الولايات المتحدة الوطنية معاهد للصحة المنشور رقم 85-23، تنقيح عام 1996). أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للموافقات ذات الصلة المؤسسية (حكومة ولاية لانوف مرجع رقم AZ:84-02.04. 2016.A435).

1-إعداد الأدوات والحلول، والمعدات

  1. تحضير 1 لتر من المحلول الملحي الفوسفات مخزنة وتستكمل مع كلوريد المغنيسيوم 1 مم (MgCl2) وكلوريد الكالسيوم 0.1 ملم (كاكل2) (ببسكم) وتصفيته من خلال عامل تصفية عقيمة.
  2. إعداد 5 مل ببسكم العقيمة كل الماوس التروية ووضعه على الجليد.
  3. لكل الماوس، وإعداد 5 مل ببسكم العقيمة وتستكمل مع البيوتين 0.5 ملغ/مل.
  4. لكل الماوس، إعداد 5 مل ببسكم العقيمة وإضافة 0.8 x 108 حبات مغناطيسية (مثلاً.، 200 ميليلتر 4 × 108 حبات مليلتر الحل، دون معالجة مسبقة) الانصمام glomeruli. إعداد هذا الحل تحت مقاعد البدلاء ثقافة الخلية لإبقاء الخرز المغناطيسية في الأنبوب الأصلي العقيمة. وضع هذا الحل على الجليد.
  5. إعداد حل التبريد بإضافة 100 مم جليكاين إلى ببسكم (5 مل في الماوس) وإبقائه على الجليد.
  6. جعل حلاً كولاجيناز (0.378 يو/مليلتر كولاجيناز أ في ببسكم معقمة). كل الماوس، "الماصة؛" 1 مل الحل كولاجيناز في أنبوب 2 مل ووضعه على الجليد.
  7. للغسيل، وإعداد ببسكم العقيمة (راجع الخطوة 1، 1) في 50 مل أنبوب ووضعه على الجليد.
  8. التروية، استخدام مضخة المحاقن مع تدفق 2.0 مل/دقيقة.
  9. إعداد حقنه 10 مل بإبرة ز 21. ضع طرف الإبرة في قسطرة طويل 20-30 سم (القطر الداخلي، معرف = 0.58 mm). توصيل القسطرة (معرف 0.58 mm) مع قسطرة قصيرة 10 سم (معرف 0.28 ملم) وقطع طرف القسطرة أصغر منحرف لإدراج سهلة في الشريان الاورطي الماوس.
  10. حرف مزدوج إجراءات أثناء الجراحة، لقطع 5-7 سم الحرير الخيوط الثلاثة (4-0 6-0) للماوس.
  11. للجراحة، وإعداد 3 المشابك الجراحية والمقص الجراحي 2، ملاقط 2، ملاقط غرامة 2، 1 مقص غرامة، ومسحات. إعداد التخدير (مثل التخدير داخل الكيتامين وزنها 100 مغ/كغ وإكسيلازيني 5 مغ/كغ وزن الجسم).
  12. لعزل glomeruli لهاتين الكليتين، استخدام مصفاة خلية 100 ميكرومتر وانبوبين 50 مل الماسك مغناطيس.
  13. إعداد الفصول تحلل المخزن المؤقت: 20 مم 3-[(3-cholamidopropyl) ديميثيلامونيو]-1-بروبانيسولفوناتي (الفصول)؛ 20 مم تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثان (تريس) الرقم الهيدروجيني 7.5؛ سوديومتشورليدي 50 ملم (كلوريد الصوديوم)؛ سوديومفلوريدي 50 ملم (NaF)؛ 15 ملم غ4ف2س7؛ مم 0.1 الإيثيلين حمض (يدتا) pH 8.0; سوديومورثوفاناداتي 2 مم؛ ومم 2 أدينوسينيتريفوسفات (ATP).
  14. بارد من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.

2-الجراحة تحت المجهر

  1. تخدير الماوس (مثلاً، مع الكيتامين/إكسيلازيني إينترابيريتونيلي، راجع الخطوة 1.11). إجراء اختبار تو-قرصه لتأكيد التخدير المناسب.
  2. تطهير الجانب البطني للماوس مع الايزوبروبانول 70%.
  3. إجراء خفض متوسط عن طريق الجلد من الحوض إلى القص وإزالة الجلد من لفافة البطن باستخدام الملقط. قطع الجلد على كلا الجانبين في منتصف البطن مع المقص الجراحي.
  4. تغيير الأدوات الجراحية. تطبيق خفض متوسط من الرهابه إلى المثانة من خلال طبقة العضلات البطن وتقسيمها إلى أربعة أجزاء باستخدام الملقط، والمقص الجراحي. إرفاق جانبا اثنين العلوي مع المشابك نحو رقبة الماوس مع المشابك الجراحية اثنين.
    ملاحظة: يتم الآن فتح البطن.
  5. وضع أجهزة الحشوي جانبا مع مسحه معقمة وقطع في الرباط الكبد فرنك مع مقص جيد.
  6. إعداد ربط (مع خيط حرير 4-0 6-0) حول الشريان الاورطي الدانية الشرايين الكلوية على ارتفاع الغدة الكظرية مع ملاقط غرامة اثنين. أحكم ربط الابهر الدانية إلغاء تدفق الدم بالملقط.
  7. مجاناً الابهر القاصي من اللفافة والدهون والأنسجة الأخرى وإعداد ربط حول الشريان المساريقي العلوي/الكبد الجمجمة الشرايين الكلوية استخدام الملاقط الجراحية الدقيقة.
  8. تعد عملية ربط (مع خيط حرير 4-0 6-0) حول الابهر القاصي الشرايين الكلوية والمشبك في الوريد الأجوف والشريان الاورطي في ذروة التشعب.
  9. قطع ثقب صغير في الشريان الاورطي القاصي للشرايين الكلوية حيث أن الثقب هو نصف قطر الشريان الاورطي. وضع القسطرة في الشريان الاورطي وإصلاحه مع حرف مزدوج الاستعداد.
    تحذير: تجنب فقاعات في نظام التروية لمنع الانسداد الهواء.
  10. تبدأ نضح ببسكم المثلج بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة.
  11. قطع ثقب الوريد الكلوي على مستوى الشرايين الكلوية مع غرامة المقص الجراحي وتشديد الربط حول الشرايين الكبدية والمساريقي العلوي.
    ملاحظة: الكلي ينبغي أن تتحول شاحب بعد البدء في التروية.

3. في فيفو بيوتينيليشن

  1. تغير المحاقن خالية الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع البيوتين 0.5 ملغ/مل للسطح وضع العلامات، ونتخلل الكلي مع 5 مل بمعدل تدفق 2 مل/دقيقة.
    ملاحظة: مزيج الحلول ببسكم (مثلاً، عن طريق تحويل أنابيب 50 مل) برفق لتجنب تشكيل فقاعات داخل الحل. وبعد التطلع للحل ضمن المحاقن، إجلاء أي فقاعات أو الهواء من المحاقن. استخدام قنية إضافية (21 ز) في المحاقن لملء الفراغ في قنية متصل بنظام القسطرة. وأخيراً، التمسك حقنه في القنية بالقسطرة دون فقاعات.
  2. تغيير المحاقن خالية من الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع 100 مم جليكاين آرو جلوميرولي، ونتخلل مع 5 مل في تدفق 2 مل/دقيقة.
  3. تغير المحاقن خالية الفقاعة إلى ببسكم المثلج وتستكمل مع 200 ميكروليتر المغناطيسي الخرز مليلتر ونتخلل الكلي في 2 مل/دقيقة.
    ملاحظة: على السطح الكلي، سوف يكون الانصمام glomeruli مع البنى الخرز المغناطيسي مرئية.

4-عزل جلوميرولي من هاتين الكليتين

  1. قم بإزالة الكلي في هيلم والكبسولة. مكان الكليتين على الجليد في 15 مل ببسكم في طبق ثقافة خلية 10 سم. Euthanize الماوس مع التفكك عنق الرحم تحت التخدير بعد الحصاد الكلي. إجراءات جراحة ونضح الماضي حوالي 20-22 دقيقة.
  2. قص الكلي إلى قطع أصغر ممكن مع شفرة مزدوجة حافة جديدة. نقل الأنسجة في أنبوب 2 مل مع 1 مل كولاجيناز A (راجع الخطوة 1، 6) وخلاصة في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قبل وبعد الهضم، تخلط بلطف مع 1000 ميكروليتر قطع ماصة.
  3. شطف الأنسجة هضمها من خلال 100 ميكرومتر مصفاة خلية باستخدام ببسكم المثلج. بلطف استخدام الخلية-مكشطة فرم الحوض الأنسجة المتبقية مصفاة الخلية وشطفه مع ببسكم المثلج بعد ذلك إلى إجمالي حجم 50 مل.
  4. الطرد المركزي بتعليق على 4 درجة مئوية 500 x غ 5 الحد الأدنى إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع أقل قليلاً من 1.5 مل ببسكم المثلج بينما فورتيكسينج بيليه. وبعد ذلك، وضع تعليق الكبيبي في أنبوب 2 مل جديدة.

5-الغسيل

  1. استخدام الماسك المغناطيس لسحب glomeruli لجانب واحد. انتظر 1 دقيقة قبل glomeruli قد تحرك باتجاه المغناطيس.
  2. إزالة المادة طافية مع 1000 ميكروليتر ماصة بينما لا يزال أنبوب 2 مل في الماسك المغناطيس. أثناء الغسل الأول والثاني خطوات (راجع الخطوة 5، 3)، 250 ميكروليتر الجثث طافية في أنبوب لتجنب فقدان glomeruli. تنفيذ هذا الإجراء بسرعة لتجنب ترك أنبوبي الهياكل تنزل إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
    ملاحظة: الإجراء الغسيل سوف تستمر لفترة أطول لولا ذلك.
  3. إزالة أنبوب 2 مل من الماسك المغناطيس وإضافة 1 مل ببسكم، ماصة صعودا وهبوطاً (مهم جداً)، ثم دوامة.
  4. إعادة وضع الأنبوب في الماسك المغناطيس والبدء من جديد مع الخطوة 5.2.
  5. كرر الخطوات الغسيل حتى نقاء glomeruli بلغت 90%. لهذا، يدرس قاسمة ممثل من المادة طافية تحت مجهر (40-100 س).
    ملاحظة: سوف تظهر Glomeruli كجولة الهياكل التي تحتوي على حبات مغناطيسية براون. هياكل ممدود شظايا أنبوبي، والخرز المغناطيسي مجاناً تظهر كنقط جولة براون. قد تظهر الخلية الحطام كالهياكل الضخمة.
  6. إذا تم التوصل إلى النقاء، تقدير عدد جلوميرولي بحل جلوميرولي في 1 مل ببسكم. بعد خلط، تأخذ قاسمة 10 ميكروليتر وتعول glomeruli تحت المجهر. حساب عدد جلوميرولي بالمعادلة التالية: العدد النهائي ل glomeruli = عدد جلوميرولي في 10 ميكروليتر x 100 اليكووت.
  7. نجاح عزل glomeruli يؤدي إلى مجموعة من 10,000 40,000 glomeruli.

6-البروتين الاستخراج وإيمونوبريسيبيتيشن (IP)

  1. جمع glomeruli بالطرد المركزي في 4 درجات مئوية في 6800 ز x للحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية أثناء استخدام الماسك مغناطيس وريسوسبيند بيليه في المخزن المؤقت لتحلل المثلج (على سبيل المثال-، glomeruli 30,000 في ميكروليتر 300؛ الفصول، راجع الخطوة 1، 11). مجانسة العينات مع الخالطون أنسجة على أعلى سرعة لمدة 30 ثانية ولهم على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  2. إزالة المواد غير قابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي في 15,000 س ز لمدة 30 دقيقة على 4 درجة مئوية. "الماصة؛" المادة طافية الذي يتضمن الخلية ليساتي في أنبوب 1.5 مل جديدة. تجاهل بيليه.
  3. قياس تركيز البروتين من المادة طافية باستخدام بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي)-على أساس طريقة اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تحلل ناجحة من 30,000 glomeruli غلة على كمية بروتين الكبيبي 700 1,000 ميكروغرام/مل. ضبط لكميات متساوية من البروتين مع تحلل المخزن المؤقت.
  4. تأخذ قاسمة 10% من الحجم الإجمالي الكبيبي ليستي وإضافة 2 × لايملي + ديثيوثريثول (DTT) قبل الحضانة لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
  5. للملكية الفكرية، واحتضان بقية ليساتي مع ستريبتافيدين [اغروس] الخرز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على شاكر النفقات عامة.
  6. الطرد المركزي الخرز [اغروس] في ز 1000 x لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية، وإضافة 800 ميكروليتر من تحلل المخزن المؤقت لغسل الخرز لربط البروتين غير محدد.
  7. تكرار الغسيل 3 مرات، وإزالة المادة طافية تماما.
  8. إضافة 30 ميكروليتر من 2 × لايمملي + DTT واحتضان عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  9. تحميل والمسابير الملكية الفكرية على المخزونات 10% جل وتشغيل هلام الحزب الديمقراطي الصربي في 70 الخامس لمدة 30 دقيقة، ثم في 20 مللي أمبير لكل جل ل 1.5 h. بعد ذلك لطخة الهلام ح 2 200 mA في غشاء النيتروسليلوز.
  10. كتلة الغشاء النيتروسليلوز بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع ألبومين المصل البقري 5% (BSA) في الغسيل المخزن المؤقت.
  11. احتضان الغشاء بالضد المصالح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يغسل مع الغسيل المخزن المؤقت 3 مرات لمدة 5 دقائق على شاكر واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية معلم برنامج الصحة الإنجابية ح 1 في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوة الغسيل.
  12. تصور ويَسْبِر إيمونوبريسيبيتيشن على الغشاء باستخدام عامل تشيميلومينيسسينت قرار فائقة مع كاميرا CCD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لعزل جلوميرولي بدقة، من الضروري أن نتخلل موريني الكلي مع ببسكم أولاً. يتحول التروية مع ببسكم الكلي شاحبة (الشكل 1أ). الانصمام glomeruli مع الخرز المغناطيسي سوف تظهر كنقط بني على السطح الكلي (الشكل 1ب). قد تظهر عزلة glomeruli مع الماسك المغناطيس التلوث مع توبولي الكلوي (الشكل 1ج). قبل المزيد من التحليل ل glomeruli، درجة نقاء > 95% من جلوميرولي يحتا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة عرض يتيح نجاح عزل glomeruli للتحقيق في الجيش الملكي النيبالي الكبيبي أو البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤديها الثقافات الخلية الكبيبي الأولية من glomeruli معزولة. إذا تم تطبيق البيوتين قبل عزلة الكبيبي، يمكن إجراء وسم البروتينات السطحية خلية الكبيبي. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن دراستها في فيفو خلية الكبيبي الاتجار البروتين السطحي، ومن الممكن كوانتيتيشن شبه من وفرة البروتين. هي الخطوات الأكثر أهمية لنجاح الاختبار وفرة بروتين سطح الخلية الكبيبي 1) تطوير الخبرات اليدوية في الماوس جراحة خاصة كانوليشن من ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون بلانكا دوفنجاك لها المساعدة التقنية استثنائية. ودعم هذا العمل Deutsche الأوقيانوغرافية (www.dfg.de) WO1811/2-1 إلى M.W. و QU280/3-1 للذكاء. وكان ممولاً أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات، وتحليل البيانات، وقرار نشر، وإعداد المخطوط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجهر SMZ168BL موتيك SMZ168 BLلجراحة الفأر
KL1500LCDمجهر Pulch and Lorenz150500ضوء لجراحة الفأر
Rompun (Xylazin) 2٪BayerPZN: 01320422تخدير
MicrofederschereBraun ، مقص AesculapFD100Rناعم ، لقطع الشريان الأورطي
Durotip Feine Scherenبراون ، AesculapBC210Rلقطع البطن
Anatomische PinzetteBraun ، AesculapBD215Rللجراحة حتى يتم فتح البطن
Prä. parierklemmeAesculapBJ008Rللجراحة  
SeraflexSerag WiessnerIC108000خيط الحرير
الكيتامين 10٪Medistarالتخدير
Rompun (Xylazin) 2٪التخديرBayer
Fine Bore Polythene Tubing ID 0.28mm OD 0.61mmPortex800/100/100القسطرة
غرامة تجويف البوليثين معرف الأنابيب 0.58mm OD 0.96mmPortex800/100/200القسطرة
جهاز هارفارد 11 بالإضافة إلىهارفارد70-2209مضخة حقنة
EZ-link Sulfo-NHC-LC-BiotinThermo Scientific21335البيوتين
Dynabeads خلايا T التي لم تمسهاالفأر Invitrogen11413Dلإصمام الكبيبات
كولاجيناز 10103578001روشلهضم أنسجة الكلى
DynaMag-2Invitrogen123.21Dماسك المغناطيس
100 & مايكرو ؛ m cell stainerGreiner-bio542000لعزل الكبيبات
Axiovert 40 CFLZeissغير متاحلتأكيد نقاء الأنسجة الكبيبية
RuptorQuiagen9002755مالطون الأنسجة
CHAPSSigma-AldrichC3023للمحلول المؤقت للتحلل
Tris-HCLSigma-AldrichT5941للمخزن
27810295كلوريد الصوديومVWRللمخزن المؤقت للتحلل
NaFSigma-Aldrich201154للمحلول
EDTASigma-AldrichE5134للمحلول المؤقت
ATPSigma-Aldrich34369-07-8للمخزن المؤقت للتحلل
Pierce BCA Protein AssayKit Thermo Scientific23225اتبع تعليمات الشركة المصنعة
الجسم المضاد للنفرينProgenGP-N2للجسم
المضاد للماعز متعدد النسيلةR & D SystemsAF15556-SPل westernblot
Streptavidin Agarose ResinThermo Scientific20347لبروتين الترسيب المناعي
أ سيفاروز CL-4BGE 17096303 للرعايةللأرانب
متعددة النسيلة للترسيب المناعي الأجسام المضادة للأرانب متعددة النسيلة المضادة ل p57SCBTsc-8298النسيلة المضاد للبيتا للفأر
، استنساخ AC-74Sigma-AldrichA2228اللطخة الغربية للتحكم في التحميل
الأرنب المضادة ل p44 / 42خلية الإشارات4695ل westernblot
بيرس عالية الحساسية ستربتافيدين-HRPThermo Scientific21130للفأر متعدد النسيلة westernblot
الجسم المضاد ICAM-2R & D SystemsAF774للفأر متعدد النسيلة westernblot
المضاد ل VE-cadherinR & D SystemsAF1002للبقعة الغربية
جهاز المؤقت للتحلل المواد الكيميائية المؤقت الغربي الصحية للجسم المضاد للأكتين أحادي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jefferson, J. A., Alpers, C. E., Shankland, S. J. Podocyte biology for the bedside. American Journal of Kidney Disease. 58 (5), 835-845 (2011).
  2. Konigshausen, E., et al. Angiotensin II increases glomerular permeability by beta-arrestin mediated nephrin endocytosis. Scientific Reports. 6, 39513(2016).
  3. Quack, I., et al. beta-Arrestin2 mediates nephrin endocytosis and impairs slit diaphragm integrity. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 103 (38), 14110-14115 (2006).
  4. Quack, I., et al. PKC alpha mediates beta-arrestin2-dependent nephrin endocytosis in hyperglycemia. Journal of Biological Chemitry. 286 (15), 12959-12970 (2011).
  5. Swiatecka-Urban, A. Endocytic Trafficking at the Mature Podocyte Slit Diaphragm. Frontiers in Pediatrics. 5, 32(2017).
  6. Swiatecka-Urban, A. Membrane trafficking in podocyte health and disease. Pediatric Nephrology. 28 (9), 1723-1737 (2013).
  7. Soda, K., et al. Role of dynamin, synaptojanin, and endophilin in podocyte foot processes. The Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4401-4411 (2012).
  8. Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein--nephrin--is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
  9. Martin, C. E., Jones, N. Nephrin Signaling in the Podocyte: An Updated View of Signal Regulation at the Slit Diaphragm and Beyond. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 9, 302(2018).
  10. Nielsen, J. S., McNagny, K. M. The role of podocalyxin in health and disease. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (8), 1669-1676 (2009).
  11. Yasuda, T., Saegusa, C., Kamakura, S., Sumimoto, H., Fukuda, M. Rab27 effector Slp2-a transports the apical signaling molecule podocalyxin to the apical surface of MDCK II cells and regulates claudin-2 expression. Molecular Biology of the Cell. 23 (16), 3229-3239 (2012).
  12. Tossidou, I., et al. Podocytic PKC-alpha is regulated in murine and human diabetes and mediates nephrin endocytosis. Public Library of Science One. 5 (4), 10185(2010).
  13. Qin, X. S., et al. Phosphorylation of nephrin triggers its internalization by raft-mediated endocytosis. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (12), 2534-2545 (2009).
  14. Waters, A. M., et al. Notch promotes dynamin-dependent endocytosis of nephrin. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (1), 27-35 (2012).
  15. Zhang, X., Simons, M. Receptor tyrosine kinases endocytosis in endothelium: biology and signaling. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (9), 1831-1837 (2014).
  16. Maes, H., Olmeda, D., Soengas, M. S., Agostinis, P. Vesicular trafficking mechanisms in endothelial cells as modulators of the tumor vasculature and targets of antiangiogenic therapies. Federation of European Biochemical Societies Journal. 283 (1), 25-38 (2016).
  17. Satchell, S. C., et al. Conditionally immortalized human glomerular endothelial cells expressing fenestrations in response to VEGF. Kidney International. 69 (9), 1633-1640 (2006).
  18. Takemoto, M., et al. A new method for large scale isolation of kidney glomeruli from mice. American Journal of Pathology. 161 (3), 799-805 (2002).
  19. Liu, X., et al. Isolating glomeruli from mice: A practical approach for beginners. Experimental and Therapeutic Medicine. 5 (5), 1322-1326 (2013).
  20. Haase, R., et al. A novel in vivo method to quantify slit diaphragm protein abundance in murine proteinuric kidney disease. Public Library of Science One. 12 (6), 0179217(2017).
  21. Satoh, D., et al. aPKClambda maintains the integrity of the glomerular slit diaphragm through trafficking of nephrin to the cell surface. Journal of Biochemistry. 156 (2), 115-128 (2014).
  22. Tomas, N. M., et al. Thrombospondin type-1 domain-containing 7A in idiopathic membranous nephropathy. New England Journal of Medicine. 371 (24), 2277-2287 (2014).
  23. Daniels, G. M., Amara, S. G. Selective labeling of neurotransmitter transporters at the cell surface. Methods in Enzymology. 296, 307-318 (1998).
  24. Ougaard, M. K. E., et al. Murine Nephrotoxic Nephritis as a Model of Chronic Kidney Disease. International Journal of Nephrology. 2018, 8424502(2018).
  25. Salant, D. J., Darby, C., Couser, W. G. Experimental membranous glomerulonephritis in rats. Quantitative studies of glomerular immune deposit formation in isolated glomeruli and whole animals. Journal of Clinical Investigation. 66 (1), 71-81 (1980).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Glomerular IsolationIn Vivo BiotinylationCell Surface Protein LabelingKidney PerfusionMagnetic Bead PurificationGlomerular Cell Surface ProteinsNephrin Podocalyxin AnalysisImmunoprecipitation MethodProtein Trafficking StudyPrimary Podocyte Culture

مقالات ذات صلة