مقالة منهجية

تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية Drosophila الميلانوجاستر البيض

DOI:

10.3791/58545

⸱

يونيو 4, 2019

 ,  ,  , 
1Biological Sciences Department Hunter College, City University of New York, 2Program in Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Graduate Center, City University of New York

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول للتصور، والكشف، وتحليل وتتبع الاتجار بالحمض النووي الريبي في غرفة البيض الحية Drosophila melanogaster باستخدام منارات الجزيئية، وقرص الغزل المجهرية البؤرية، وتحليل مفتوح المصدر البرمجيات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أحدثت تقنيات التصوير القائمة على الفلورة، بالاقتران مع التطورات في الفحص المجهري الضوئي، ثورة في كيفية قيام علماء الأحياء الخلوية بإجراء دراسات تصوير الخلايا الحية. وقد اتسع نطاق أساليب الكشف عن الـ RNAs بشكل كبير منذ أن ربطت الدراسات الجوهرية بين توطين الحمض النووي الريبي الخاص بالموقع وتنظيم التعبير الجيني. يمكن الآن تصور عمليات mRNA الديناميكية من خلال النهج التي تكشف عن mRNAs، إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط النطاق الديناميكي للسلوك الجزيئي. تكنولوجيا المنارة الجزيئية هي نهج قائم على التهجين قادر على الكشف المباشر عن النصوص الذاتية في الخلايا الحية. منارات جزيئيّة [هيربين-شبد], داخليّا يروي, [سنغل-نوكليوتيد] يميّز [نوكليك سد] تحقيقات, أيّ [فلورسّ] فقط على تهجين إلى تسلسل فريدة هدف. عندما يقترن مع المجهرية الفلورية المتقدمة والتصوير عالية الدقة، فإنها تمكن المرء من إجراء تتبع المكانية والزمانية للحركة داخل الخلايا من mRNAs. على الرغم من أن هذه التكنولوجيا هي الطريقة الوحيدة القادرة على الكشف عن النصوص الذاتية، علماء الأحياء الخلية لم تحتضن بعد تماما هذه التكنولوجيا بسبب صعوبات في تصميم مثل هذه التحقيقات لتصوير الخلايا الحية. تطبيق برنامج جديد، PinMol،يسمح لتصميم محسنوسريع من تحقيقات الأنسب لتهجين بكفاءة إلى المناطق المستهدفة mRNA داخل خلية حية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الحصول على الصور عالية الدقة في الوقت الحقيقي والبرمجيات الحالية المفتوحة المصدر لتحليل الصور يسمح بإخراج بيانات محسنة، مما يؤدي إلى تقييم أدق للتعقيد الكامن وراء العمليات الدينامية التي تنطوي عليها دورة حياة mRNA.

هنا نقدم بروتوكول شامل لتصميم وتسليم منارات الجزيئية في غرف البيض Drosophila melanogaster. يتم إجراء الكشف المباشر والمحدد للغاية والتصور من mRNAs الأمومية الذاتية عن طريق قرص الغزل المجهرية البؤرية. تتم معالجة بيانات التصوير وتحليلها باستخدام الكشف عن الأجسام وتتبعها في البرامج الجليدية للحصول على تفاصيل حول الحركة الديناميكية للmRNAs، والتي يتم نقلها وتوطينها إلى مناطق متخصصة داخل البويضة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أصبحت دراسات بيولوجيا الخلايا التي تصور الأحداث الدينامية ذات الاستبانة المكانية والزمنية ممكنة من خلال تطوير تقنيات التصوير بالخلايا الحية القائمة على الفلورة. في الوقت الحاضر، في التصور mRNA الجسم الحي يتحقق من خلال التكنولوجيات التي تقوم على التفاعلات الحمض النووي الريبي aptamer البروتين، RNA aptamer الناجمة عن الفلورة من الأصباغ العضوية والحمض النووي التحقيق الصلب1،2، 3.أنها توفر كل خصوصية عالية، والحساسية ونسبة الإشارة إلى الخلفية. ومع ذلك، تتطلب النُهج التي تركز على الحمض النووي الريبي معالجة جينية واسعة النطاق، حيث يتم تصميم الترانسجين للتعبير عن الحمض النووي الريبي مع الزخارف الهيكلية الاصطناعية المطلوبة لربط البروتين أو الصبغالعضوي. على سبيل المثال، يتطلب نظام MS2/MCP التعبير المشترك عن ترانسجين يعبر عن بنية RNA تحتوي على تكرارات متعددة جنبا إلى جنب من تسلسل ملزم للبروتين معطف MS2 البكتيريا (MCP)، وترميز آخر transgene بروتين الفلورسنت تنصهر إلىMCP 4،5. إضافة مثل هذه الزخارف الهيكلية الثانوية إلى الحمض النووي الريبي، جنبا إلى جنب مع بروتين الفلورسنت ضخمة الموسومة، أثارت مخاوف من أن عمليات الحمض النووي الريبي الأصلي قد تتأثر6. ومن التقنيات التي تعالج هذا الشاغل وتقدم مزايا فريدة إضافية هي النهج القائم على الحمض النووي، ومنارات الجزيئية (MBs). تسمح الـ MBs للكشف المتعدد عن mRNAs الذاتية، والتمييز في الاختلافات النيوكليوتيدات واحدة، وحركية سريعة للتهجين مع الهدف mRNA7،8. MBs هي تحقيقات oligonucleotide التي لا تزال في أضعاف دبوس الشعر المبردة قبل أن تمر بتغيير التشوه الفلورية بمجرد أن تهجين إلى أهدافها (الشكل1C)9. وقد حققت عدة مجموعات نجاحا في استخدام MBs للكشف عن كل من RNAs غير الترميز (microRNAs وlncRNAs)10،11،12،13،RNA الفيروسات الرجعية14 ودينامية الحمض النووي البروتين التفاعلات15. وقد تم استخدامها بنجاح للتصوير في مختلف الكائنات الحية والأنسجة، مثل أجنة حمار وحشي16، الخلايا العصبية13، أنسجة الورم17، التمييز بين خلايا القلب18، والسالمونيلا 19.

هنا نقوم بوصف نهج التصميم والتسليم والكشف عن mRNAs الذاتية في غرف البيض الحية D. melanogaster إلى جانب إعداد المجهرية التي هي سريعة بما فيه الكفاية لالتقاط مجموعة ديناميكية من النقل الجزيئي النشط. وقد عملت غرفة البيض D. melanogaster كنظام نموذج متعدد الخلايا مثالية لمجموعة واسعة من الدراسات التنموية، من تقسيم الخلايا الجذعية الجرثومية في وقت مبكر والتعبير الجيني الأمومي لتوليد خطة الجسم القطاعية20، 21. غرف البيض معزولة بسهولة، كبيرة وشفافة، وقادرة على تحمل ساعات من تحليل الجسم الحي السابق، مما يجعلها قابلة للغاية لتجارب التصوير. وقد ركز الكثير من العمل على توطين النصوص النفاسية غير المتماثلة في المناطق الفرعية المنفصلة قبل ترجمتها بنشاط. على وجه الخصوص، يجب أن يحدث توطين >أوسكار ميرنا« وترجمته اللاحقة في القطب الخلفي للبويطانة بطريقة منظمة بإحكام لتجنب النمط الظاهري الجنيني الثلاثي القاتل22. يتم نسخ oskar mRNA في 15 خلية جرثومية، وتسمى خلايا الممرضة، ويتم نقلها بنشاط من خلال الجسور السيتوبلازمية، وتسمى القنوات الدائرية، إلى البويضة، والخلية الجرثومية التي تصبح البويضة الناضجة ويتم إخصابها في نهاية المطاف (الشكل1A ). إن الكم الكبير من المعلومات المتاحة بالفعل فيما يتعلق بالتوظيف الدينامي وتبادل عوامل البروتين من وإلى أوسكار mRNP، إلى جانب سفره بعيد المدى داخل الخلايا، يجعل أوسكار مرشحاً مفضلاً للدراسة العديد من العمليات من دورة حياة mRNA. وقد لعبت MBs دوراً أساسياً في الكشف عن تفاصيل حول عملية توطين الحمض النووي الريبي وفك رموز تنظيم ووظيفة عوامل البروتين التي تتحكم في نقل الحمض النووي الريبي خلال Drosophila oogenesis. على وجه الخصوص ، عن طريق حقن الـ MBs الدقيقة في خلايا الممرضة وإجراء تجارب تصوير الخلايا الحية ، من الممكن تتبع mRNAs الذاتية8،23.

تقدم خارطة الطريق المعروضة هنا خطوات عملية كاملة، من إجراء تجربة تصوير الخلايا الحية باستخدام MBs، والحصول على بيانات التصوير، إلى إجراء تحليل البيانات لتتبع الحمض النووي الريبي المحلي في بيئته الخلوية الأصلية. ويمكن تعديل الخطوات وتحسينها لتلبية احتياجات الباحثين الذين يعملون مع الأنسجة/أنواع الخلايا الأخرى داخل إعداد المختبر الخاص بهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم MBs لتصوير الخلايا الحية

  1. طي تسلسل RNA الهدف للتنبؤ بالبنية الثانوية لهدف mRNA باستخدام "نموذج RNA" من خادم mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
    1. لصق /تحميل التسلسل المستهدف في شكل FASTA، حدد 5 أو 10٪ دون الأمثل (هياكل مع طاقة مجانية للطي في غضون 5 أو 10٪ من قيمة MFE، على التوالي)، وضبط الحد الأقصى لعدد الطي محسوب وفقا لذلك (على سبيل المثال أكبر ل 10٪ دون الأمثل).
      ملاحظة: إدراج الهياكل الثانوية دون الأمثل عند تصميم MBs يسمح لتحديد المناطق ضمن mRNA الهدف التي قد تكون أكثر مرونة أو أكثر صلابة مما هو متوقع لهيكل الحد الأدنى للطاقة الحرة (MFE) وحدها، مما يحسن التصميم العام لـ MBs مناسبة لتصوير الخلايا الحية.
    2. حدد "وظيفة فورية" لأهداف mRNA من 800 نيوكليوتيدات (nt)، أو "مهمة دفعية" لأطوال mRNA بين 801 و 8000 nt. حفظ ملف "ss-count" كملف نصي بسيط.
  2. استخدم ملف "ss-count" الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.1 كإدخال لبرنامج PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) مع المعلمات المطلوبة، لتصميم العديد من MBs للهدف mRNA (انظر الدروس التي تصف استخدام برنامج PinMol 24 في https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/).
    1. تحديد خصوصية MBs مختارة عن طريق إجراء تحليل BLAST: استخدام "blastn" مع قاعدة البيانات المناسبة (على سبيل المثال لOskar mRNA محددة MBs استخدام قاعدة البيانات "refseq-rna" والكائن الحي Melanogaster Drosophila).
    2. تحديد أي تعبير خاص بالأنسجة عن هدف mRNA (على سبيل المثال بالنسبة لقاعدة flybase mRNA oskar> بيانات التعبير عالي الإنتاجية> مجموعة FlyAtlas التشريحية الدقيقة أو التضمين التضمين التشريح الحمض النووي الريبي-Seq؛ http://flybase.org/reports/FBgn0003015) ومقارنتها مع أي ضربات الانفجار إيجابية. القضاء على التحقيقات التي تظهر > 50٪ عبر homology مع mRNAs الأخرى التي يتم التعبير عنها أيضا في الأنسجة / الخلية من الفائدة.
  3. حدد زوج الفلوروفور وquencher المناسب لإعداد الفحص المجهري المتاح لأداء التصوير بالخلايا الحية (على سبيل المثال Cy5/BHQ2)25.

2. توليف MB، تنقية، والتوصيف

  1. استخدام التوليف والتنقية الداخليين على النحو الموصوف سابقاً7،أو الخدمات المقدمة من مقدمي الخدمات التجارية، لتوليف وتنقية واحد إلى خمسة MBs (انظر الملاحظة أعلاه)، باستخدام مخطط وضع العلامات التالي: [5'(Fluorophore)-(C3 أو C6 linker) - (2'-O -ميثيل MB تسلسل)-(Quencher)3']. تنقية MBs باستخدام المرحلة العكسية HPLC، في المنزل أو باستخدام خدمات الموفر التجاري.
    ملاحظة: يجب أن يكون phosphoramidites المستخدمة في التوليف التحقيق الآلي تعديل 2'- O-ميثيل ريبونوكليوتيد. يمكن للمرء أيضا استخدام chimeras من حمض نووي مؤمن بالتناوب (LNA) و 2 '-O-methyl التعديلات لزيادة استقرار الهجين بين ميغابايت أقصر وهدفها mRNA26.
  2. توليف الحمض النووي oligonucleotides التي تتطابق مع تسلسل منطقة RNA المستهدفة، وبالتالي هي مكملة لمنطقة التحقيق من MBs، لاستخدامها في توصيف المختبر (انظر الخطوات 2.3 إلى 2.5؛ علما أعلاه). تعظيم التهجين من بروميد الميثيل مع هدف الحمض النووي-oligonucleotide تقليد، من خلال تضمين على كل نهاية من هدف الحمض النووي أربعة نيوكليوتيدات إضافية، كما هو موجود في تسلسل mRNA الهدف.
    ملاحظة: يمكن إجراء توصيف أكثر صرامة لكفاءة MB للكشف عن التسلسل المستهدف باستخدام أهداف الحمض النووي الريبي في المختبر توليفها بدلاً من الحمض النووي القلة التكميلية8.
  3. قم بإجراء إزالة النُصّم الحراري لمادة الMB وحدها، وقياس درجة حرارة ذوبانها (Tm)، والتأكد من أن الـ MB يفترض شكل دبوس الشعر المطلوب في درجة الحرارة الفسيولوجية. لقد لاحظنا قيم Tm بين 60 و 90 درجة مئوية.
  4. إجراء إزالة النُصّم الحراري لبروميد الميثيل في وجود هدف الحمض النووي oligonucleotide وقياس MB:DNA الهدف الهجين Tm، كما سبق وصفه7. مطلوب Tm بين 55 و 60 درجة مئوية لMB: DNA الهجين.
  5. أداء ردود الفعل التهجين في المختبر مع الهدف oligonucleotide الحمض النووي المقابلة، وتحديد كفاءة MB: تكوين الحمض النووي الهجين في درجة الحرارة الفسيولوجية، كما سبق وصفه7. ومن المرغوب فيه حركية التهجين السريع مع تقليد الهدف من الحمض النووي، ولكن MBs التي لا تظهر كفاءة التهجين عالية مع أهداف الحمض النووي قد يكون لها أداء أفضل مع mRNA الهدف في المختبر و / أو في الجسم الحي.

3. تشريح وإعداد غرف البيض الفردية للحقن الدقيق

  1. تغذية فقسحديثا، والإناث التزاوج لمدة 2-3 أيام مع معجون الخميرة الطازجة.
  2. تخدير الذباب على وسادة CO 2، وذلك باستخدام ملاقط غرامة (dumont #5)، نقل 1-2 الإناث في قطرة من زيت هالوكاربون 700 على زلة غطاء زجاجي.
  3. باستخدام زوج من ملاقط، توجيه ذبابة مع الجانب الظهري حتى تحت مجهر مجسم. تشريح البطن الإناث عن طريق إجراء شق صغير في النهاية الخلفية وضغط بلطف زوج من المبيضين في الزيت.
  4. قم بزراعة المبيضين على قطرة زيت على غطاء جديد. عقد بلطف مبيض واحد مع ملاقط واحد في حين قرصة قبالة أصغر مراحل البويضة مع ملاقط أخرى. يتم توطين oskar mRNA بنشاط في وبعد منتصف الأوجينيسيس (مراحل > 7)، وغرف البيض الأصغر سنا (مراحل < 7) هي أكثر صعوبة لحقن ولا البقاء على قيد الحياة طالما. اسحب ببطء على زلة الغطاء (مع حركة الهبوط) حتى يتم عزل الأوفاريولس الفردية أو غرف البيض ومحاذاة عموديا. مزيد من غرف البيض واحدة منفصلة عن طريق إزاحة المراحل غير المرغوب فيها من سلسلة البيض البويضة.
    ملاحظة: تأكد من أن غرف البيض مثار بشكل فردي لا تطفو في النفط، وأنها تلتزم زلة الغطاء. وهذا أمر مهم لكل من الحقن المجهري الناجح والحصول على الصور.

4. الحقن المجهري من MBs في خلايا ممرضة من غرف البيض

  1. إعداد محلول بروميد الميثيل، باستخدام منارة جزيئية واحدة (على سبيل المثال osk2216Cy5)، أو مزيج من اثنين من MBs التي تستهدف mRNAs مختلفة والتي وصفت مع الفلوروروس متميزة طيفيا (على سبيل المثال osk2216Cy5 وdrongo1111Cy3). استخدام تركيز 200-300 نانوغرام / ميكرولتر كل ميغابايت في HybBuffer (50 mM Tris-HCl - درجة الحموضة 7.5، 1.5 مليون متر MgCl2 و 100 مل NaCl). لكوكتيل من أربعة MBs المسمى مع نفس الفلوروفور التي تستهدف نفس mRNA في 200 نانوغرام / ميكرولتر لكل في HybBuffer (على سبيل المثال osk82، osk1236، osk2216). تدور أسفل الحل MB مباشرة قبل تحميل الإبرة للحقن الدقيق.
  2. حدد الهدف. يوصى بوضع هدف زيت يُستحسن بـ 40 مرة لإيجاد غرفة بيض مناسبة ولإجراء الحقن المجهري.
  3. جبل غطاء مع غرفة البيض تشريح على مرحلة المجهر. طرح الهدف في موقف التركيز وتحديد غرفة البيض في مرحلة النمو من منتصف إلى وقت متأخر، التي يتم توجيهها بشكل صحيح للحقن الدقيق (أي، مع محور AàP عمودي على طرف إبرة للسماح للحقن السهل داخل ممرضة الخلية القريبة من البويضة).
  4. تحميل إبرة (التجارية أو أعدت في منزل27)مع ~ 1 كيلوبايت MB الحل (انظر الخطوة 4.1) وتوصيله إلى الحاقن الدقيق. للحقن الدقيقة في غرف البيض الميلانوغاستر D. ، توجيه الإبرة (انظر جدولالمواد) في زاوية <45° إلى مرحلة المجهر (على سبيل المثال 30 درجة) لتجنب ثقب عدة خلايا ممرضة.
  5. إعداد حاقن مع ضغط حقن من 500-1000 هبأ والضغط التعويض من 100-250 هبأ (انظر جدولالمواد).
  6. تتحرك ببطء المرحلة لجلب في مجال عرض منطقة من النفط قطرة فارغة من غرف البيض.
  7. باستخدام عصا التحكم micromanipulator، خفض الإبرة بلطف في قطرة النفط وجلب طرفها في التركيز نحو محيط مجال الرؤية.
  8. أداء وظيفة "نظيفة" لإزالة الهواء من طرف الإبرة وضمان أن هناك تدفق من الإبرة.
  9. جلب الإبرة إلى موقف المنزل والتركيز على غرفة البيض ليتم حقنها microinjected، ثم جلب الإبرة مرة أخرى إلى التركيز ووضعها بالقرب من حافة غرفة البيض.
  10. إجراء تعديل جيد لموقف الهدف Z بحيث الغشاء الذي يفصل خلايا الجريب عن خلايا الممرضة هو في التركيز.
  11. إدراج الإبرة في خلية ممرضة وإجراء حقن لمدة 2-5 s.
  12. قم بإزالة الإبرة برفق وسحبه إلى موضع المنزل.
  13. تغيير الهدف إلى التكبير المطلوب للحصول على صورة (60-63x أو 100x)، والتركيز على غرفة البيض، والبدء في اكتساب.

5. الحصول على البيانات باستخدام قرص الغزل الإعداد المجهر البؤري

ملاحظة: راجع جدول المواد لإعدادنا المحدد.

  1. إعداد بروتوكول الاكتساب لتسجيل مكدس XYZCt من الصور 8-16 بت (XYZ = وحدة التخزين، C = قناة، t = الوقت).
  2. حدد خطوط الليزر للقنوات المطلوبة (على سبيل المثال 641 نانومتر ليزر لCy5 و 491 نانومتر لGFP) والحصول على القنوات بالتتابع: أولا إشارة الفلورة في كل قناة ومن ثم تغيير موقف Z، للسماح لتحليل التعريب السليم.
  3. حدد الخطوة Z (على سبيل المثال 0.3 ميكرومتر)، وحدود Z العلوي ة والسفلية (علىسبيل المثال -2 ميكرومتر إلى 2 ميكرومتر).
  4. إدخال وقت الاقتناء ومعدل أخذ العينات (على سبيل المثال كل 15-30 ق لمدة تصل إلى 1 ساعة).
  5. بدء الاستحواذ.

6. المعالجة وتحليل البيانات للحصول على معلومات التتبع والتعريب، وإعداد ملفات الفيديو

  1. معالجة الصور
    1. تحميل، فك، وفتح Icy، منصة المجتمع مفتوحة للمعلوماتية الصور الحيوية (http://icy.bioimageanalysis.org/)
    2. افتح مكدس XYZCt الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5: صورة/تسلسل >ملف>فتح.
    3. تحويل المكدس إلى ImageJ: ImageJ> أدوات> تحويل إلى IJ، لديك وضع منفصل ON.
    4. إنشاء كومة فرعية (مجموعة من الخطوات Z والنقاط الزمنية التي سيتم تحليلها بشكل أكبر): ImageJ>Image>مكدسات>أدوات>جعل المكدس الفرعي...; حدد القنوات المطلوبة وخطوات Z والنقاط الزمنية.
    5. حفظ المكدس الفرعي كملف TIFF: ImageJ>ملف>حفظ باسم>Tiff...; استخدام هذا الملف للخطوات اللاحقة.
    6. تقسيم القنوات: ImageJ>صورة>اللون>قنوات سبليت.
    7. طرح الخلفية إما باستخدام كومة الخلفية: ImageJ>Process>آلة حاسبة الصورة...، أو باستخدام خيار الكرة المتداول: ImageJ>Process>طرح الخلفية...، حدد دائرة نصف قطرها الكرة المتداول. معاينة الصورة لنصف القطر المحدد قبل تحديد "قبول".
      ملاحظة: سوف تنشأ إشارة الخلفية أساسا من التبريد غير السليم للفلوروروفور. غالبًا ما تُستخدم نسبة الإشارة:الخلفية (S:B) كمؤشر لـ "سطوع" MB، ويتم قياسها من تجارب التهجين في المختبر لـ MB وDNA target oligonucleotide. على سبيل المثال، Osk1236 و osk2216 S:B من ~ 81 و ~ 120، على التوالي.
    8. اضبط السطوع والتباين لكل قناة: ImageJ>Image>Adjust>السطوع/التباين، وحدد تطبيق.
    9. حفظ كل قناة كملف TIFF منفصل: ImageJ>ملف>حفظ باسم>Tiff....
    10. دمج القناتين: ImageJ>صورة>اللون>دمج القنوات...; حدد القنوات. حفظ المكدس الجديد كملف TIFF جديد (راجع الخطوة 6.1.8).
  2. الكشف عن البقعة وتتبعها
    1. تحول مرة أخرى إلى الجليدية: ImageJ>أدوات>تحويل إلى الجليدية.
    2. شريط مقياس هو تلقائيا متراكبة على المكدس عند التحويل إلى الجليدية، إذا تم تثبيت البرنامج المساعد شريط مقياس [البحث باستخدام الإضافات>الإعداد>البرنامج المساعد على الانترنت]. إذا لزم الأمر، قم بتحرير شريط المقياس عبر نافذة المفتش (الجانب الأيمن من الشاشة)>علامة تبويب الطبقة>الاسم>شريط المقياس.
    3. قم بإلغاء تحديد/إلغاء تنشيط رمز "العين" لشريط المقياس من علامة التبويب طبقة>اسم لإزالة شريط المقياس من المكدس الأصلي. يمكن إعادة تنشيطه على المكدس النهائي.
    4. حفظ المكدس التي تمت معالجتها حديثا عن طريق أخذ لقطة شاشة باستخدام رمز "الكاميرا" من شريط القوائم في نافذة الصورة، "خذ لقطة من العرض الحالي" وملف>حفظ باسم>Tiff....
    5. تحديد حساسية موضعية، إذا تم بالفعل تحديد معلمات حساسية موضعية الانتقال إلى الخطوة 6.2.7.
    6. الكشف عن البقع: حدد النافذة مع الصورة أو المكدس لتحليلها، الكشف والتتبع>الكشف> الكشف عن بقعة، وملء المعلمات إعدادات:
      1. للإدخال، حدد "currentSequenceInputDetection" (افتراضي).
      2. بالنسبة للمعالجة المسبقة، حدد "القناة 0" (افتراضي)، أو القناة المطلوبة عن طريق الإسناد الترافقي للرقم في نافذة المفتش>علامة التبويب تسلسل.
      3. للكشف عن، حدد "الكشف عن بقعة مشرقة على خلفية مظلمة؛" استخدام "استخدام القوة من Wavelets 2D ل3D" فقط إذا لم يكن هناك ما يكفي من Z-شرائح في المداخن لإجراء التحليل. حدد "مقياس (مقاييس)" و"حساسية" لكل مقياس (أضف المزيد من المقاييس للبقع الأكبر). المقياس والحساسية (أكبر عدد أكثر حساسية هو الكشف، واقترح الحد الأقصى من 140 من قبل الجليدية) هي متغيرات التجربة والخطأ، التي يجب فحصها بصريا بعد ذلك والبت فيها.
      4. بالنسبة لمنطقة الاهتمام، استخدم "ROIfromSequence" (افتراضي).
      5. للتصفية، استخدم "NoFiltering" (افتراضي)، أو حدد "SizeFiltering" لتعريف "نطاق الكائنات المقبولة (بالبكسل)".
      6. الإخراج: حدد إعداد إخراج XLS أو XML (حدد تنسيق XML عند استخدام 2007 MS Excel أو إصدار سابق وهناك >65,000 نقطة). إذا تم استخدام نتائج الكشف عن بقعة لتحليل تتبع، حدد أيضا "تصدير إلى حمام السباحة".
      7. تكرار الكشف عن البقع باستخدام قيم مختلفة للمقياس/الحساسية حتى يتم الكشف عن جميع أو معظم البقع. تسجيل كافة المعلمات النهائية.
      8. لتحليل التعريب المشترك، كرر الكشف الموضعي للقناة الأخرى.
    7. لتعقب المواقع، حدد الكشف والتتبع>التتبع>تتبع البقعة>تشغيل كاشف البقعة مع المعلمات من الخطوة 6.2.6.، أو استخدم "تحديد نتائج الكشف هنا" القائمة المنسدلة لتحديد مجموعة بيانات موجودة (لهذا، حافظ على نافذة الكشف الموضعي فتح من الخطوة 6.2.5). اضغط على زر "تقدير المعلمات" وحدد الحركة المستهدفة المطلوبة في النافذة المنبثقة لتقدير المعلمات (على سبيل المثال "هو على حد سواء غير مُجمَّع وموجه"). اضغط على زر "تشغيل التتبع".
    8. كرر الكشف عن البقعة والتعقب للقنوات الأخرى عند تعقب بقع مكدسات متعددة القنوات، باتباع الخطوتين 6.2.6 و 6.2.7، بدءاً من المكدس الذي تم إنشاؤه من الخطوة 6.2.7.
    9. لتصور المسارات، حدد الكشف والتتبع>التتبع>مدير التتبع - يتم فتح هذه النافذة تلقائيًا عند الانتهاء من تشغيل التتبع. بالنسبة لـ "معالج مسار الألوان"، حدد "تمكين" واختر التمثيل المطلوب للون للمسارات. يمكن الوصول إلى معالجات المسار ذات الصلة عبر "إضافة معالج المسار..." قائمة منسحبة لأسفل (على سبيل المثال، حدد "تعقب مقطع وقت المعالج"، وتمكين نافذة "تعقب المقص"، واختيار العدد المطلوب من عمليات الكشف ليتم عرضها قبل وبعد نقطة الوقت الحالية.)
    10. حفظ معلومات المسارات كملف تتبع XML: الكشف والتعقب>التتبع>إدارة التتبع>ملف>حفظ باسم ....
    11. حفظ النتائج عن طريق التقاط لقطة شاشة باستخدام رمز "الكاميرا" من شريط القوائم في نافذة الصورة، "خذ لقطة شاشة من العرض الحالي". يمكن أخذ لقطات الشاشة مع البقع المكتشفة و / أو المسارات ببساطة عن طريق تفعيل / تعطيل رمز (رموز) العين المقابلة الموجودة في نافذة المفتش>علامة تبويب طبقة>الاسم>تراكب المجمع.
    12. تثبيت البرنامج المساعد تراكب الطابع الزمني: الإضافات>الإعداد>البرنامج المساعد على الانترنت>تراكب الطابع الزمني>تثبيت.
    13. إضافة الطابع الزمني: الإضافات>تراكب الطابع الزمني (جديد). اتبع الإرشادات الموجودة على النافذة المنبثقة (الركن الأيمن السفلي من الشاشة) للحصول على إرشادات حول وضع الطابع الزمني وتنسيقه. يمكن إضافة/تغيير الفاصل الزمني في إطار المفتش>علامة التبويب تسلسل>خصائص التسلسل>تحرير.
    14. حفظ النتائج عن طريق أخذ لقطة شاشة أخرى. حفظ الصورة كما 1) تنسيق Tiff، و 2) كتنسيق AVI؛ لتنسيق AVI أولا تحويل إلى تقديم RGB (صورة / تسلسل>تقديم>صورة RGB).
    15. تدوير الصورة إلى الاتجاه المطلوب: نافذة المفتش>علامة تبويب التسلسل>Canvas>استدارة.
    16. حفظ الصورة التي تمت استدارة عن طريق "خذ لقطة من طريقة العرض الحالية". تأكد من إلغاء تحديد رمز "العين" لشريط المقياس، حيث سيتم تدويره أيضًا مع الصورة.
    17. اختر عائد الاستثمار وحصّله: حدد منطقة الاهتمام>عائد استثمار 2D>اختر شكل عائد الاستثمار ثم قم بإنشاء/سحب عائد الاستثمار على الصورة؛ صورة / تسلسل> مستوى (XY)> محصول سريع.
  3. تحليل التعريب المشترك
    1. إعداد بروتوكول للتوطين المشترك؛ وترد عدة أمثلة على الموقع الجليدي (http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/List) (انظر الموادالتكميلية ).
    2. تحميل بروتوكول التعريب: أدوات>برمجة نصية>بروتوكولات>تحميل، وضبط المعلمات في كتل التفاعل (على سبيل المثال في معلمات استخدام كتلة "الكشف عن الموجات" المحددة في الخطوة 6.2.6.).
    3. قياس حجم الجسيمات بالبكسل، وتحديد مسافة التعريب المشترك وإدخالها في كتلة "Colocalizer" كمسافة "الحد الأقصى".
      ملاحظة: يعتمد حجم الجسيمات بالبكسل على نظام الكشف. لقياس الحجم، قم بالتكبير إلى جسيم واحد وعد البيكسلات التي تمتد عرض الإشارة عبرها يدويًا. متوسط القياسات من ثلاثة جزيئات على الأقل. المسافة القصوى التي سيتم تعيينها للتوطين المشترك هي حجم الجسيمات بالبكسل (وهذا يمثل الحد الأقصى لمجموع نصف قطر اثنين من الجسيمات التي تلامس).
    4. إذا رغبت في ذلك، حدد عائد استثمار واحد أو أكثر لتحليل التعريب المشترك: منطقة الاهتمام>عائد الاستثمار 2D>اختر شكل عائد الاستثمار>رسم عائد الاستثمار على الصورة.
    5. عائد الاستثمار(المحاصيل): صورة/تسلسل>المستوى (XY)>المحاصيل السريعة.
    6. إجراء الترجمة المشتركة: إطار محرر البروتوكولات>علامة تبويب البروتوكول المختارة>تشغيل. ستحتوي الكتلة النهائية في إطار محرر البروتوكولات على النسبة المئوية الإجمالية للتوطين المشترك استناداً إلى الكشف الموضعي، بينما يمكن العثور على المعلومات في كل نقطة زمنية في إطار المفتش> علامة التبويب إخراج.
    7. تتبع الجسيمات المشتركة والمفردة باتباع الخطوة 6.2.7 (بقع المسار).
    8. حفظ كما هو موضح في الخطوة 6.2.16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام PinMol،يمكن تصميم العديد من MBs لهدف واحد mRNA (الشكل 1B-C). بعد التوليف والتنقية، تتميز MBs المختارة وتقارن باستخدام التحليل في المختبر.

figure-results-1
الشكل 1: وصف التقنية والأنسجة لتصوير الخلايا الحية من mRNAs الذاتية. (أ) تصوير غرفة بيض دروسوفيلا في منتصف المرحلة المس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعتمد التصور المباشر للاتجار بالحمض النووي الريبي المحلي في غرف البيض Drosophila على استخدام MBs محددة وفعالة ومقاومة للنوكل، والتي يمكن الآن تصميمها بسهولة مع برنامج PinMol. MBs هي تحقيقات محددة مصممة للكشف عن تسلسل فريد ة داخل mRNA الهدف (ويفضل المناطق خالية من الهيكل الثانوي)، مما يجعل من الممكن الكشف عن حل كبير للنسخة. القيد الوحيد عند اعتماد هذه التقنية / بروتوكول لأنواع الأنسجة /الخلايا الأخرى هو كفاءة تسليم MB للعينة ذات الفائدة. في حين أن النهج الأخرى تتطلب التلاعب الوراثي للأنسجة للتعبير عن apt...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر سلفاتوري أ. إ. ماتراس (مركز معهد بحوث الصحة العامة، جامعة روتجرز) على تركيب ووسم وتنقية منارات جزيئية، ودانيال سانت جونستون (معهد غوردون، جامعة كامبريدج) على أوسكار-MS2/ MCP-GFP الأسهم ذبابة المعدلة وراثيا. وقد تم دعم هذا العمل من قبل جائزة المؤسسة الوطنية للعلوم الوظيفي 1149738 وجائزة مؤتمر الموظفين الفنيين - CUNY إلى DPB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مقياس الطيفالفلوري فلوروماكس -4 هوريبا-جوبين إيفونن / أمقياس الطيف فلوري لعد الفوتون
كوفيتكوفيت فايرفلايسي (شركة Precision Cells Inc سابقا)701MFL
Dumont # 5 ملاقطأدوات الدقة العالمية501985الملقط الرفيع مهم جدا لفصل غرف البيض الفردية
زيت الهالوكربون 700Sigma-AldrichH8898
غطاء زلة رقم 1 22 مم × 40 ممVWR48393-048
المجهرLeica MZ6 Leica Microsystems Inc.N / A
CO2< / sub> وسادة تخدير ذبابة الفاكهةGenesee Scienific59-114
Tris-HCL درجة الحموضة 7.5سيجما ألدريتش1185-53-1
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش7791-18-6
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش7647-14-5
مجهرثنائي البؤر للقرص الغزلمجهر مقلوب Leica DMI-4000B مجهز بقرص الغزل Yokogawa CSU 10 Leica Microsystems Inc.N / a
Hamamatsu C9100-13 ImagEM EMCCD كاميراHamamatsun / a
PatchMan NP 2 MicromanipulatorEppendorf Inc.920000037
FemtoJet MicroinjectorEppendorf Inc.920010504
إبرة الحقن: Femtotips IIEppendorf Inc.930000043
نصيحة التحميل: 20 مو ؛ L MicroloaderEppendorf Inc.930001007
نظارات Micro Cover رقم 1 أو 1.5 ، 22 مم × 40 ممVWR48393-026 ؛ 48393-172
خميرة جافةأي متجر بقالةبدون
كمبيوتر ، > 20 جيجابايت رامعلى الرغم من أنه يمكن إجراء المعالجة على معظم أجهزة الكمبيوتر ، إلا أن القدرات العالية ستزيد من سرعة المعالجة
تشريح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nature Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annual Reviews of Biomedical Engineering. 11, 25-47 (2009).
  3. Mannack, L. V., Eising, S., Rentmeister, A. Current techniques for visualizing RNA in cells. F1000Research. 5, (2016).
  4. Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
  5. Bertrand, E., et al. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  6. Garcia, J. F., Parker, R. MS2 coat proteins bound to yeast mRNAs block 5' to 3' degradation and trap mRNA decay products: implications for the localization of mRNAs by MS2-MCP system. RNA. 21 (8), 1393-1395 (2015).
  7. Bratu, D. P. Molecular beacons: Fluorescent probes for detection of endogenous mRNAs in living cells. Methods in Molecular Biology. 319, 1-14 (2006).
  8. Bratu, D. P., Cha, B. J., Mhlanga, M. M., Kramer, F. R., Tyagi, S. Visualizing the distribution and transport of mRNAs in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 100 (23), 13308-13313 (2003).
  9. Tyagi, S., Kramer, F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. Nature Biotechnology. 14 (3), 303-308 (1996).
  10. Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550(2017).
  11. Liu, Y., et al. Multiplex detection of microRNAs by combining molecular beacon probes with T7 exonuclease-assisted cyclic amplification reaction. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 107-114 (2017).
  12. Baker, M. B., Bao, G., Searles, C. D. In vitro quantification of specific microRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Research. 40 (2), e13(2012).
  13. Ko, H. Y., et al. A color-tunable molecular beacon to sense miRNA-9 expression during neurogenesis. Scientific Reports. 4, 4626(2014).
  14. Vet, J. A., et al. Multiplex detection of four pathogenic retroviruses using molecular beacons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 96 (11), 6394-6399 (1999).
  15. Li, J., Cao, Z. C., Tang, Z., Wang, K., Tan, W. Molecular beacons for protein-DNA interaction studies. Methods in Molecular Biology. 429, 209-224 (2008).
  16. Li, W. M., Chan, C. M., Miller, A. L., Lee, C. H. Dual Functional Roles of Molecular Beacon as a MicroRNA Detector and Inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3568-3580 (2017).
  17. Kuang, T., Chang, L., Peng, X., Hu, X., Gallego-Perez, D. Molecular Beacon Nano-Sensors for Probing Living Cancer Cells. Trends in Biotechnology. 35 (4), 347-359 (2017).
  18. Ban, K., et al. Non-genetic Purification of Ventricular Cardiomyocytes from Differentiating Embryonic Stem Cells through Molecular Beacons Targeting IRX-4. Stem Cell Reports. 5 (6), 1239-1249 (2015).
  19. Hadjinicolaou, A. V., Demetriou, V. L., Emmanuel, M. A., Kakoyiannis, C. K., Kostrikis, L. G. Molecular beacon-based real-time PCR detection of primary isolates of Salmonella Typhimurium and Salmonella Enteritidis in environmental and clinical samples. BMC Microbiology. 9, 97(2009).
  20. McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster Oogenesis: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
  21. Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Current Biology. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
  22. Rongo, C., Gavis, E. R., Lehmann, R. Localization of oskar RNA regulates oskar translation and requires Oskar protein. Development. 121 (9), 2737-2746 (1995).
  23. Mhlanga, M. M., et al. In vivo colocalisation of oskar mRNA and trans-acting proteins revealed by quantitative imaging of the Drosophila oocyte. PLoS One. 4 (7), e6241(2009).
  24. Bayer, L. V., Omar, O. S., Bratu, D. P., Catrina, I. E. PinMol: Python application for designing molecular beacons for live cell imaging of endogenous mRNAs. bioRxiv. , (2018).
  25. Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Efficiencies of fluorescence resonance energy transfer and contact-mediated quenching in oligonucleotide probes. Nucleic Acids Research. 30 (21), e122(2002).
  26. Bratu, D. P., Catrina, I. E., Marras, S. A. Tiny molecular beacons for in vivo mRNA detection. Methods in Molecular Biology. 714, 141-157 (2011).
  27. Dean, D. A. Preparation (pulling) of needles for gene delivery by microinjection. Cold Spring Harbor. 2006 (7), (2006).
  28. Alami, N. H., et al. Axonal transport of TDP-43 mRNA granules is impaired by ALS-causing mutations. Neuron. 81 (3), 536-543 (2014).
  29. Jackson, S. R., et al. Applications of Hairpin DNA-Functionalized Gold Nanoparticles for Imaging mRNA in Living Cells. Methods in Enzymology. 572, 87-103 (2016).
  30. Zimyanin, V. L., et al. In vivo imaging of oskar mRNA transport reveals the mechanism of posterior localization. Cell. 134 (5), 843-853 (2008).
  31. Catrina, I. E., Marras, S. A., Bratu, D. P. Tiny molecular beacons: LNA/2'-O-methyl RNA chimeric probes for imaging dynamic mRNA processes in living cells. ACS Chemical Biology. 7 (9), 1586-1595 (2012).
  32. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Research. 36 (12), e69(2008).
  33. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Research. 32 (6), e58(2004).
  34. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Research. 35 (16), e105(2007).
  35. Bevilacqua, P. C., Ritchey, L. E., Su, Z., Assmann, S. M. Genome-Wide Analysis of RNA Secondary Structure. Annual Review of Genetics. 50, 235-266 (2016).
  36. Mhlanga, M. M., Vargas, D. Y., Fung, C. W., Kramer, F. R., Tyagi, S. tRNA-linked molecular beacons for imaging mRNAs in the cytoplasm of living cells. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1902-1912 (2005).
  37. Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nature Methods. 9 (7), 697-710 (2012).
  38. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
  39. Trcek, T., et al. Drosophila germ granules are structured and contain homotypic mRNA clusters. Nature Commununications. 6, 7962(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

mRNA Drosophila Icy

مقالات ذات صلة